Name: Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę immunozłota do ilościowej analizy receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie lokalizacji i gęstości białek synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Programy Stacjonarne Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych (NIDCD), Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). Dziękujemy placówce NINDS EM i rdzeniowi zaawansowanego obrazowania NIDCD (kod # ZIC DC 000081-03) za pomoc.

Opieka i obchodzenie się ze zwierzętami były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIH. Szczury Sprague-Dawley 15-21 po urodzeniu (P), którym wstrzyknięto 1-1,2% CTB obustronnie przez wzgórek górny, utrzymywano w 12:12-godzinnym cyklu światło: ciemność.
1. Utrwalenie tkanki siatkówki
<ol>
	<li>Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, 2 kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, celulozową bibułę filtracyjną, plastikową pipetę i szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Znieczulić szczura w zamkniętej komorze za pomocą 2,0 ml halotanu (wziewny środek znieczulający). Określ odpowiednie znieczulenie tymi metodami: brak wycofania tylnej łapy po uszczypnięciu palca lub brak odruchu mrugania. Następnie natychmiast odciąć głowę gilotyną. Usuń oczy nożyczkami do tęczówki i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego usuń rogówkę, odcinając przednią część gałki ocznej. Usuń soczewkę i ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Oderwij twardówkę dwoma kleszkami, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej.</li>
	<li>Natychmiast pokrój siatkówkę na paski o grubości 100 - 200 μm za pomocą brzytwy i poddaj utrwaleniu pH.</li>
	<li>Utrwal paski siatkówki w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB przy pH 6,0 przez 20 - 30 minut, a następnie w 4% paraformaldehydzie plus 0,01% aldehydu glutarowego o pH 10,5 przez 10 - 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po kilku płukaniach w PB z 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 w 4°C), przed substytucją przez zamrożenie należy kriochronić paski siatkówki glicerolem (60 minut każdy w 10%, 20%, 30%, a następnie O/N w 30%) w 0,1 M PB.</li>
</ol>
2. Zamiana zamrożenia
UWAGA: Ta metoda zamrożenia i podstawiania jest zmodyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu 19,20. Ważne jest również, aby instrumenty były bardzo zimne (nosić rękawiczki); W przeciwnym razie tkanka może częściowo rozmrozić się po dotknięciu narzędziami. Wszystkie te czynności są wykonywane w komorze AFS i instrumenty nigdy nie mogą poruszać się ponad krawędź komory. Podobnie, konieczne jest odpowiednie chłodzenie wszystkich chemikaliów stosowanych w AFS.
<ol>
	<li>Zamrozić wgłębne paski siatkówki w ciekłym propanu w temperaturze -184°C w przyrządzie do kriokonserwacji EM (CPC). Za pomocą cienkiej szczotki umieść próbki na małych kawałkach podwójnie przyklejonej taśmy przymocowanej do metalowych króćców, które znajdują się na końcu prętów zanurzających (odetnij dodatkowy bufor za pomocą szczotki).</li>
	<li>Zanurzyć pręty w ciekłym propanu i trzymać tam przez około 5 sekund, a następnie przenieść do automatycznego przyrządu do zamrażania i substytucji (AFS) za pomocą małej komory transportowej wypełnionej ciekłym azotem ("chłodzony kriowaniem pojemnik do przenoszenia LN2").</li>
	<li>Po umieszczeniu zamrożonej próbki i narzędzi (kleszczy i skalpela) w systemie AFS, należy schłodzić narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki lub schłodzić je, umieszczając końcówki narzędzi na kilka sekund w małej komorze transportowej (wypełnionej ciekłym azotem ("pojemnik do kriotransferu chłodzony LN2")). </li>
	<li>Po umieszczeniu w AFS usuń próbkę i taśmę z króćca za pomocą drobnego skalpela. Podczas tych procedur należy również utrzymywać otwarty regulator przepływu azotu gazowego, TF (TF jest opisany jako "regulator dla parownika LN2").</li>
	<li>Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w uchwytach do płaskiego zatapiania (tj. przed ustawieniem AFS) należy wyciąć cienkie kółko z przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego i umieścić je na dnie uchwytu tak, aby wyłożyć dno każdego dołka. Pozwala to na stosunkowo łatwiejsze usuwanie spolimeryzowanych bloków próbki po zakończeniu. 
	UWAGA: Wcześniej stosowaliśmy metodę alternatywną do płaskich uchwytów do zatapiania i stosowaliśmy podwójne kapsułki Reichert + żelatyna (patrz Petralia i Wenthold, 1999) 20.</li>
	<li>Użyj następującej automatycznej sekwencji w AFS (używając terminologii instrumentów): T1 = -90°C przez 32 godziny, S1 = wzrost temperatury o 4°C/h (11,3 h), T2 = -45°C przez 50 godzin, S2 = wzrost temperatury o 5°C/h (9 h), T3 = 0°C przez 40 godzin (łącznie = 142,3 h). Umieszczenie próbek w systemie AFS (w temperaturze -90°C) przed rozpoczęciem sekwencji czasowej może zająć od 2 do 4 godzin.</li>
	<li>Zanurz zamrożone skrawki w 1,5% octanie uranylu w metanolu w temperaturze -90°C na >32 godziny w AFS. Umieść dwa kawałki chusteczek (zazwyczaj) w każdym z siedmiu dołków w aluminiowym uchwycie do płaskiego osadzania (trzy pasują do AFS).
	<ol>
		<li>Umieść tkankę + taśmę w octanie uranylu/metanolu w studzienkach i usuń taśmę później, tuż przed rozpoczęciem infiltracji pożywki (takiej jak Lowicryl HM20), jeśli usunięcie tkanki z taśmy jest zbyt trudne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do -45°C (+4°C na godzinę; w sekwencji automatycznej).</li>
	<li>Umyj próbki trzykrotnie we wstępnie schłodzonym metanolu, używając plastikowej pipety z cienką końcówką w celu usunięcia starego roztworu z każdego płaskiego uchwytu do zatapiania, a następnie używając innej standardowej pipety z tworzywa sztucznego, aby dodać wstępnie schłodzony świeży metanol.</li>
	<li>Następnie, stosując tę samą metodę, stopniowo infiltruj próbki żywicami do zatapiania w niskiej temperaturze, takimi jak medium do zatapiania (HM20 / metanol w stosunku 1:1 i 2:1, każda przez 2 godziny, a następnie czysta żywica przez 2 godziny, a następnie zmień żywice i zachowaj O/N).</li>
	<li>Następnego dnia ponownie zmień żywicę, dostosowując poziom żywicy tak, aby sięgała tylko do górnej krawędzi studzienek.</li>
	<li>Polimeryzować próbki (od -45°C do 0°C w sekwencji automatycznej; +5°C na godzinę) światłem UV przez 40 godzin.</li>
	<li>Następnie wyjąć próbki z systemu AFS. Zazwyczaj bloki próbek nadal wykazują pewien różowy kolor. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestoriach chemicznych, w temperaturze RT O/N lub dłużej, aż staną się całkowicie przezroczyste.</li>
</ol>
3. Wprowadzenie immunocytochemii EM Immunogold
UWAGA: Immunocytochemia po osadzeniu jest wykonywana zgodnie z opisem 23,24,25.
<ol>
	<li>Wyciąć skrawki o grubości 1 μm za pomocą ultramikrotomu, wybarwić skrawki 1% błękitem toluidynowym i zbadać je pod kątem orientacji przekroju; ustawić blok tkanki tak, aby uzyskać optymalną płaszczyznę poprzeczną przekroju.</li>
	<li>Wytnij ultracienkie sekcje o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na niklowych kratkach szczelinowych pokrytych węglem Formvar.</li>
	<li>Przemyć kratki jeden raz w destylowanymH2O, a następnie trzykrotnie przepłukać solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS, 0,05 M bufor Tris, 0,7% NaCl, pH 7,6).</li>
	<li>Inkubować siatki w 20 μl kropli 5% BSA w TBS przez 30 min, a następnie w 20 μl kroplach mieszaniny zawierającej kozi anty-CTB (1:3,000) i przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR (anty-króliczej GluN2A 1:50, GluN2B 1:30) lub anty-króliczej GluA2/3 (1:30) w TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) z 2% BSA i 0,02 M NaN3 O/N w RT.</li>
	<li>Myj kratki na trzech oddzielnych kroplach (20 μl) TBS (pH 7,6) przez 10, 10 i 20 minut, a następnie TBS (pH 8,2) przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować siatki przez 2 godziny na kroplach (20 μl) mieszaniny zawierającej anty-króliczą IgG (1:20) sprzężoną z cząstkami złota 10 nm i anty-koziołka IgG (1:20) sprzężoną z cząstkami złota 18 nm w TBST (pH 8,2) z 2% BSA i 0,02 M NaN3.</li>
	<li>Myj kratki w 20 μl kropli TBS (pH 7,6) przez 5, 5 i 10 minut, a następnie w ultraczystej wodzie, a następnie wysusz.</li>
	<li>Siatki przeciwbarwiące z 5% octanem uranylu i 0,3% cytrynianem ołowiu w destylowanymH2Oprzez odpowiednio 8 i 5 minut w ciemnych warunkach.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z potrójnym znakowaniem inkubuj siatki O/N w RT z 20 μl kropli mieszaniny anty-koziego CTB (1:3,000), anty-mysiego PSD-95 (1:100) i anty-królika GluN2A (1:50). Następnie inkubować siatki przez 2 godziny na kroplach 20 μl mieszaniny IgG sprzężonej z cząstkami złota o długości 18, 10 i 5 nm w TBST (pH 8,2) z 2% BSA i 0,02 M NaN3. Zachowaj te same procedury, co w przypadku podwójnego etykietowania do mycia i barwienia przeciwstawnego między i po inkubacji przeciwciał.</li>
	<li>Przeprowadzono kontrole, w których przeciwciała drugorzędowe stosowano samodzielnie.</li>
	<li>Przeglądaj siatki na EM i digitalizuj obrazy. Przetwarzaj ostateczne dane w programie Adobe Photoshop 6.0 tylko pod kątem jasności i kontrastu, jeśli jest to konieczne24.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja
<ol>
	<li>Ręcznie wybierz obszary wewnętrznej warstwy pleksi (IPL) bez otworów i pęknięć przy powiększeniu 8 000X, a następnie losowo fotomontuj całą głębokość IPL przy powiększeniu 25 000X.</li>
	<li>Zidentyfikuj dendryty RGC w dwubiegunowych diadach stożkowych, gdy a) zawierają one transportowany wstecznie sygnał CTB (duże cząstki złota), b) wykazują dobrze zdefiniowane błony, szczeliny i gęstości postsynaptyczne, c) zawierają co najmniej dwie małe cząsteczki złota w PSD lub więcej niż jedną małą cząsteczkę złota wzdłuż pozasynaptycznej błony plazmatycznej.</li>
	<li>Zbierz 45 - 55 dendrytów RGC, w oparciu o powyższe kryteria, do analizy ilościowej.</li>
	<li>Zmierz długości PSD i pozasynaptycznej błony plazmatycznej poszczególnych dendrytów RGC za pomocą oprogramowania NIH ImageJ. Policz cząstki złota w promieniu 10 nm od błony jako związane z błoną, w oparciu o średnią grubość 7 - 9 nm dla błony plazmatycznej 26.</li>
	<li>Oblicz gęstość cząstek jako liczbę cząstek złota na mikrometr liniowy (złoto/μm). Zmierz odległość między środkiem każdej cząsteczki złota a środkiem PSD (dla lokalizacji synaptycznej) lub krawędzią PSD (dla lokalizacji pozasynaptycznej).</li>
	<li>Przeprowadzanie analiz statystycznych za pomocą oprogramowania. Użyj dwustronnych testów t, aby porównać średnie. Zakończ istotność, gdy P <0,05. O ile nie wskazano inaczej, należy podać wartości jako średnią ± SEM18.</li>
</ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Opisaliśmy cztery techniki skutecznego ilościowego barwienia immunogold EM po zatopieniu: 1) krótka i słaba fiksacja, 2) substytucja przez zamrożenie, 3) barwienie immunozłotem po zatopieniu i 4) kwantyfikacja.
EM immunogold pozwala na wykrywanie specyficznych białek w ultracienkich skrawkach tkanek. Przeciwciała znakowane cząstkami złota można bezpośrednio wizualizować za pomocą EM. Chociaż EM immunogold jest skuteczny w wykrywaniu subsynaptycznej lokalizacji receptora błonowego, może być tec...

Glutaminian jest głównym neuroprzekaźnikiem pobudzającym w siatkówce1. Komórki zwojowe siatkówki (RGC), otrzymujące glutaminergiczny wkład synaptyczny z komórek dwubiegunowych2, są neuronami wyjściowymi siatkówki, które wysyłają informacje wizualne do mózgu. Badania fizjologiczne wykazały, że pobudzenie synaptyczne RGC odbywa się postsynaptycznie przez receptory NMDA (NMDAR) i receptory AMPA (AMPAR) 3,4,5. Chociaż pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC) w RGC są mediowane przez AMPAR i NMDAR3,5,6,7,8 , spontaniczne miniaturowe EPSC (mEPSC) na RGC wykazują tylko składnik 4,5,9, w którym pośredniczy AMPAR. Jednak zmniejszenie wychwytu glutaminianu ujawniło składnik NMDAR w spontanicznych EPSC5, co sugeruje, że NMDAR na dendrytach RGC mogą znajdować się poza synapsami pobudzającymi. Kinazy guanylanowe związane z błoną (MAGUK), takie jak PSD-95, które grupują receptory neuroprzekaźników, w tym receptory glutaminianu i kanały jonowe w miejscach synaptycznych, również wykazują wyraźne subsynaptyczne wzorce ekspresji 10,11,12,13,14.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci, immunohistochemia konfokalna i immunohistochemia z użyciem wstępnego mikroskopu elektronowego (EM) były wykorzystywane do badania ekspresji receptorów błonowych. Chociaż konfokalne barwienie immunologiczne ujawnia szerokie wzorce ekspresji receptorów, jego niższa rozdzielczość uniemożliwia użycie go do rozróżnienia lokalizacji subkomórkowej. Wstępne wbudowanie badań EM w siatkówce ssaków wskazuje, że podjednostki NMDAR są obecne w elementach postsynaptycznych w stożkowych synapsach wstęgowych komórek dwubiegunowych 15,16,17. Jest to wyraźny kontrast z dowodami fizjologicznymi. Jednak dyfuzja produktu reakcji jest dobrze znanym artefaktem w metodzie wstępnego zatapiania immunoperoksydazy. W związku z tym podejście to zwykle nie daje statystycznie wiarygodnych danych i może wykluczać rozróżnienie między lokalizacją na błonie synaptycznej a błoną pozasynaptyczną 18,19,20,21. Z drugiej strony, dane fizjologiczne i anatomiczne są zgodne z synaptyczną lokalizacją AMPAR na RGC 3,5,7,9,22. Tak więc receptory glutaminianu i MAGUK w synapsie wstęgowej siatkówki są zlokalizowane nie tylko w postsynaptycznych, ale także w perysynaptycznych lub zewnątrzsynaptycznych przedziałach błony. Jednak nadal potrzebna jest analiza ilościowa tych białek błonowych w synapsie wstęgowej siatkówki o wysokiej rozdzielczości.
Tutaj opracowaliśmy technikę postemagonalnego immunogolda EM, aby zbadać subsynaptyczną lokalizację podjednostek NMDAR, podjednostek AMPAR i PSD-95, a następnie oszacować liczbę, gęstość i zmienność tych białek w synapsach na szczurzych RGC znakowanych za pomocą metod śledzenia wstecznego podjednostki B (CTB) toksyny.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GluN2A</td><td>Milipory</td><td>AB1555P</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Anty-GluN2B</td><td>Milipory</td><td>AB1557P</td><td>Rozcieńczenie 1/30</td></tr><tr><td>Anty-GluA2/3</td><td>Milipory</td><td>AB1506</td><td>Rozcieńczenie 1/30</td></tr><tr><td>Anty-PSD-95</td><td>Milipory</td><td>MA1&ndash; 046</td><td>Rozcieńczenie 1/100</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG-10 nm cząsteczki złota</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysie cząstki złota IgG-10 nm</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysie cząsteczki złota IgG-5 nm</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>Rozcieńczenie 1/20</td></tr><tr><td>Cząstki złota anty-kozy IgG-18 nm osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Rozcieńczenie 1:20</td></tr><tr><td>Siatki niklowo-szczelinowe powlekane węglem Formvar.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica CPC</td><td>Leica</td> Ultramikrotom Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>Ciekły azot JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roberts Tlen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan</td><td>Roberts Tlen Lista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>Laboratoria Biologiczne</td><td>104</td><td>1 - 1,2%</td></tr><tr>Lista <td>anty-CTB</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>703</td><td>Rozcieńczenie 1/4,000</td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) otrzymują pobudzające dane glutaminergiczne z komórek dwubiegunowych. Wzbudzenie synaptyczne RGC odbywa się postsynaptycznie przez receptory NMDA (NMDAR) i receptory AMPA (AMPAR). Dane fizjologiczne wskazują, że receptory glutaminianu w RGC ulegają ekspresji nie tylko w postsynaptycznych, ale także w perysynaptycznych lub pozasynaptycznych przedziałach błonowych. Nie ustalono jednak dokładnych lokalizacji anatomicznych receptorów glutaminianu w synapsach RGC. Chociaż szeroko stosowana jest analiza ilościowa receptorów glutaminianu w centralnych synapsach o wysokiej rozdzielczości, podejście to odniosło jedynie ograniczony sukces w siatkówce. Opracowaliśmy metodę postembedding immunogold do analizy receptorów błonowych, dzięki której możliwe jest oszacowanie liczby, gęstości i zmienności tych receptorów w synapsach wstęgowych siatkówki. Poniżej opisujemy narzędzia, odczynniki i praktyczne kroki, które są potrzebne do: 1) skutecznego przygotowania utrwalenia siatkówki, 2) substytucji przez zamrożenie, 3) immunocytochemii po zatopieniu immunogold electron mikroskop (EM) oraz 4) ilościowej wizualizacji receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych.

Przedstawione tutaj wyniki wykazują wyraźnie odmienne wzorce lokalizacji podsynaptycznej GluA 2/3 oraz NMDAR w dendrytach RGC w siatkówce szczura, zgodnie z wcześniejszymi opisami 24,25. 77% cząsteczek immunozłota dla GluA 2/3 w profilach dendrytycznych RGC znajdowało się w obrębie PSD (Rysunek 1A), podobnie jak w większości synaps centralnych. Jednakże NMDAR znajdowały się albo synaptycznie, albo pozasynaptycznie. 83% cząsteczek immunozłota dla GluN2A zlokaliz...

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie nowego podejścia do ilościowej analizy białek błonowych w synapsach wstążkowych siatkówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii siatkówki, takie jak precyzyjna lokalizacja białek w synapsach w obrębie obwodu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oszacowania liczby, gęstości i szybkości wielu białek w synapsach wstążkowych siatkówki.Aby zademonstrować procedurę substytucji mrożenia oraz skrawania ultracienkich przekrojów, w materiale wystąpili Ron Petralia i Ya-Xian Wang z NIDCD Advanced Imaging Core. Na początku tej procedury należy przeprowadzić mikrodysekcję gałki ocznej pod mikroskopem. W tym celu najpierw usuń rogówkę.Następnie usuń pęcherzyk i ciało szkłowate z powierzchni międzyretinalnej za pomocą pęsety. Po tym odwarstwij twardówkę, aż siatkówka zostanie oddzielona od gałki ocznej. Natychmiast potnij siatkówkę na paski o grubości 100 200 micrometer za pomocą żyletki.Następnie paski siatkówki wymieszaj w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB. Potem w 4% paraformaldehydzie z dodatkiem 0,01% glutaraldehydu w temperaturze pokojowej. Po kilku płukaniach w PB z 0,15 mM chlorkiem wapnia, przeprowadź krioprotekcję pasków siatkówki glicerolem w 0,1 M PB przed mrożeniem z substytucją. Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w uchwytach do płaskiego zatapiania, wytnij cienkie kółko z przezroczystej plastikowej folii i połóż je na dnie każdego uchwytu, aby ułatwić wyjęcie spolimeryzowanego bloku z próbką po zakończeniu procesu.Następnie ustaw automatyczną sekwencję w urządzeniu AFS. Napełnij AFS ciekłym azotem i umieść w nim płaskie uchwyty do zatapiania. Wypełnij je 1,5% octanem uranylu w metanolu i schłodź je wstępnie.Aby błyskawicznie zamrozić paski siatkówki w ciekłym propanie w temperaturze 184 °C, należy za pomocą cienkiego pędzla umieścić próbki na małych kawałkach dwustronnej taśmy przyklejonej do metalowych wsporników na końcach prętów do zamrażania. Następnie pędzlem należy odsączyć nadmiar buforu. Pręty należy zanurzyć w ciekłym propanie na około pięć sekund.Następnie przenieś je do AFS, używając małej komory transportowej wypełnionej ciekłym azotem. Po umieszczeniu zamrożonej próbki oraz narzędzi – pęsety i skalpela – w AFS, chłodź narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki. Alternatywnie można je schłodzić, zanurzając końcówki narzędzi na kilka sekund w małej komorze transportowej wypełnionej ciekłym azotem.Następnie usuń próbkę i taśmę z podstawki za pomocą precyzyjnego skalpela. Dalej, umieść dwa fragmenty mrożonych przekrojów w każdym z siedmiu wgłębień płaskiego aluminiowego uchwytu do zatapiania z 1,5% octanem uranylu w metanolu. Przechowuj je w temperaturze 90 °C przez co najmniej 32 godziny w AFS.Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do 45°C w sekwencji automatycznej. Po tym czasie przemyj próbki trzykrotnie w schłodzonym metanolu. Następnie poddaj próbki progresywnej infiltracji żywicami do zatapiania niskotemperaturowymi jako medium do zatapiania.Następnego dnia ponownie wymień żywicę i dostosuj jej poziom tak, aby sięgał górnej krawędzi studzienek. Ustaw lampę UV w urządzeniu AFS i polimeryzuj próbki światłem UV w AFS aż do zakończenia automatycznej sekwencji. Następnie wyjmij próbki z AFS.Zazwyczaj bloki z próbkami nadal wykazują pewien różowy odcień i zabarwienie. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej przez noc, lub do momentu, aż staną się całkowicie przezroczyste. Na tym etapie wykonaj ultra-cienką serię przekrojów o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na siatkach niklowych powlekanych węglem i formvarem.Przemyj siatki raz w wodzie destylowanej, a następnie trzykrotnie w TBS. Następnie inkubuj siatki w 20 µL 5% BSA w TBS przez 30 minut, a potem w 20 µL mieszaniny zawierającej przeciwciało kozie anty-CTB oraz przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR przez noc w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyj siatki trzy razy, za każdym razem używając 20 µL TBS o pH 7,6.Następnie przemyć siatki raz buforem TBS o pH 8,2 przez pięć minut. Inkubować siatki przez dwie godziny z 20 µl mieszaniny zawierającej przeciwciała osiołkowe anty-królicze IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 10 nm oraz przeciwciała osiołkowe anty-kozie IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 18 nm. Po dwóch godzinach przemyć siatki trzykrotnie w 20 µl buforu TBS o pH 7,6, a następnie przemyć w wodzie ultraczystej i pozostawić siatki do wyschnięcia na powietrzu.Następnie przeprowadź kontrastowanie siatek, stosując 5% octanu uranylu w wodzie destylowanej przez osiem minut, a następnie 0,3% cytrynianu ołowiu w wodzie destylowanej przez pięć minut w ciemności. W przypadku eksperymentów z potrójnym znakowaniem, inkubuj siatki przez noc w temperaturze pokojowej z 20 µL mieszaniny przeciwciał anti-goat CTB, anti-mouse PSD-95 oraz anti-rabbit UN2A. Następnie inkubuj siatki przez dwie godziny z 20 µL mieszaniny IGG sprzężonych z cząsteczkami złota o średnicach 18, 10 i 5 nm.W tej sekcji należy najpierw ustawić pasek skali. Następnie za pomocą oprogramowania ImageJ zmierz długość PSD poszczególnych dendrytów RGC. Następnie oblicz liczbę cząsteczek złota znajdujących się w odległości 10 nanometrów od błony, przyjmując średnią grubość błony plazmatycznej od siedmiu do dziewięciu nanometrów.Oblicz gęstość cząstek jako liczbę cząstek złota na liniowy mikrometr. Następnie zmierz odległość między środkiem każdej cząstki złota a środkiem PSD dla lokalizacji synaptycznej lub krawędzią PSD dla lokalizacji pozasynaptycznej. Ten obraz przedstawia podwójne znakowanie immunozłotem GluA2/3 i CTB.Jest to wstęgowa zakończenia presynaptycznego, a małe złote cząsteczki skupiają się w PSD wypustek RGC. Obraz przedstawia podwójne znakowanie immunozłotem GluN2B i CTB. Małe złote cząsteczki znajdują się na pozasynaptycznej błonie plazmatycznej.Na tym obrazie przedstawiono podwójne znakowanie immunozłotem GluN2A i CTB. Podobnie jak w przypadku GluA2/3, małe cząsteczki skupiają się w obrębie PSD. Tutaj pokazano potrójne znakowanie immunozłotem GluN2A, PSD-95 i CTB.Cząsteczki złota znakujące GluN2A i PSD-95 współistnieją w obrębie PSD na pojedynczych dendrytach RGC dodatnich dla CTB. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo delikatnej fiksacji tkanki, ponieważ antygenowość niektórych białek, takich jak receptory NMDA, znacznie spada przy silnej i przedłużonej fiksacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat precyzyjnej detekcji i analizy białek błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).

Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: Zhang, J., et al. Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę mikroskopii elektronowej do wizualizacji lokalizacji receptora neuroprzekaźnika w synapsach siatkówki. Skrawki siatkówki zawierają komórki zwojowe siatkówki, które wykazują receptory neuroprzekaźników związane z błoną i są znakowane podjednostką B toksyny cholery (CTB). Po znakowaniu markerów przeciwciałami...

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości receptorów neuroprzekaźników w synapsach siatkówki

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę immunozłota do ilościowej analizy receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie lokalizacji i gęstości białek synaptycznych.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Przeglądaj więcej filmów