Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie nowego podejścia do ilościowej analizy białek błonowych w synapsach wstążkowych siatkówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii siatkówki, takie jak precyzyjna lokalizacja białek w synapsach w obrębie obwodu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oszacowania liczby, gęstości i szybkości wielu białek w synapsach wstążkowych siatkówki.

Aby zademonstrować procedurę substytucji mrożenia oraz skrawania ultracienkich przekrojów, w materiale wystąpili Ron Petralia i Ya-Xian Wang z NIDCD Advanced Imaging Core. Na początku tej procedury należy przeprowadzić mikrodysekcję gałki ocznej pod mikroskopem. W tym celu najpierw usuń rogówkę.

Następnie usuń pęcherzyk i ciało szkłowate z powierzchni międzyretinalnej za pomocą pęsety. Po tym odwarstwij twardówkę, aż siatkówka zostanie oddzielona od gałki ocznej. Natychmiast potnij siatkówkę na paski o grubości 100 200 micrometer za pomocą żyletki.

Następnie paski siatkówki wymieszaj w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB. Potem w 4% paraformaldehydzie z dodatkiem 0,01% glutaraldehydu w temperaturze pokojowej. Po kilku płukaniach w PB z 0,15 mM chlorkiem wapnia, przeprowadź krioprotekcję pasków siatkówki glicerolem w 0,1 M PB przed mrożeniem z substytucją. Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w uchwytach do płaskiego zatapiania, wytnij cienkie kółko z przezroczystej plastikowej folii i połóż je na dnie każdego uchwytu, aby ułatwić wyjęcie spolimeryzowanego bloku z próbką po zakończeniu procesu.

Następnie ustaw automatyczną sekwencję w urządzeniu AFS. Napełnij AFS ciekłym azotem i umieść w nim płaskie uchwyty do zatapiania. Wypełnij je 1,5% octanem uranylu w metanolu i schłodź je wstępnie.

Aby błyskawicznie zamrozić paski siatkówki w ciekłym propanie w temperaturze 184 °C, należy za pomocą cienkiego pędzla umieścić próbki na małych kawałkach dwustronnej taśmy przyklejonej do metalowych wsporników na końcach prętów do zamrażania. Następnie pędzlem należy odsączyć nadmiar buforu. Pręty należy zanurzyć w ciekłym propanie na około pięć sekund.

Następnie przenieś je do AFS, używając małej komory transportowej wypełnionej ciekłym azotem. Po umieszczeniu zamrożonej próbki oraz narzędzi – pęsety i skalpela – w AFS, chłodź narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki. Alternatywnie można je schłodzić, zanurzając końcówki narzędzi na kilka sekund w małej komorze transportowej wypełnionej ciekłym azotem.

Następnie usuń próbkę i taśmę z podstawki za pomocą precyzyjnego skalpela. Dalej, umieść dwa fragmenty mrożonych przekrojów w każdym z siedmiu wgłębień płaskiego aluminiowego uchwytu do zatapiania z 1,5% octanem uranylu w metanolu. Przechowuj je w temperaturze 90 °C przez co najmniej 32 godziny w AFS.

Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do 45°C w sekwencji automatycznej. Po tym czasie przemyj próbki trzykrotnie w schłodzonym metanolu. Następnie poddaj próbki progresywnej infiltracji żywicami do zatapiania niskotemperaturowymi jako medium do zatapiania.

Następnego dnia ponownie wymień żywicę i dostosuj jej poziom tak, aby sięgał górnej krawędzi studzienek. Ustaw lampę UV w urządzeniu AFS i polimeryzuj próbki światłem UV w AFS aż do zakończenia automatycznej sekwencji. Następnie wyjmij próbki z AFS.

Zazwyczaj bloki z próbkami nadal wykazują pewien różowy odcień i zabarwienie. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej przez noc, lub do momentu, aż staną się całkowicie przezroczyste. Na tym etapie wykonaj ultra-cienką serię przekrojów o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na siatkach niklowych powlekanych węglem i formvarem.

Przemyj siatki raz w wodzie destylowanej, a następnie trzykrotnie w TBS. Następnie inkubuj siatki w 20 µL 5% BSA w TBS przez 30 minut, a potem w 20 µL mieszaniny zawierającej przeciwciało kozie anty-CTB oraz przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR przez noc w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyj siatki trzy razy, za każdym razem używając 20 µL TBS o pH 7,6.

Następnie przemyć siatki raz buforem TBS o pH 8,2 przez pięć minut. Inkubować siatki przez dwie godziny z 20 µl mieszaniny zawierającej przeciwciała osiołkowe anty-królicze IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 10 nm oraz przeciwciała osiołkowe anty-kozie IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 18 nm. Po dwóch godzinach przemyć siatki trzykrotnie w 20 µl buforu TBS o pH 7,6, a następnie przemyć w wodzie ultraczystej i pozostawić siatki do wyschnięcia na powietrzu.

Następnie przeprowadź kontrastowanie siatek, stosując 5% octanu uranylu w wodzie destylowanej przez osiem minut, a następnie 0,3% cytrynianu ołowiu w wodzie destylowanej przez pięć minut w ciemności. W przypadku eksperymentów z potrójnym znakowaniem, inkubuj siatki przez noc w temperaturze pokojowej z 20 µL mieszaniny przeciwciał anti-goat CTB, anti-mouse PSD-95 oraz anti-rabbit UN2A. Następnie inkubuj siatki przez dwie godziny z 20 µL mieszaniny IGG sprzężonych z cząsteczkami złota o średnicach 18, 10 i 5 nm.

W tej sekcji należy najpierw ustawić pasek skali. Następnie za pomocą oprogramowania ImageJ zmierz długość PSD poszczególnych dendrytów RGC. Następnie oblicz liczbę cząsteczek złota znajdujących się w odległości 10 nanometrów od błony, przyjmując średnią grubość błony plazmatycznej od siedmiu do dziewięciu nanometrów.

Oblicz gęstość cząstek jako liczbę cząstek złota na liniowy mikrometr. Następnie zmierz odległość między środkiem każdej cząstki złota a środkiem PSD dla lokalizacji synaptycznej lub krawędzią PSD dla lokalizacji pozasynaptycznej. Ten obraz przedstawia podwójne znakowanie immunozłotem GluA2/3 i CTB.

Jest to wstęgowa zakończenia presynaptycznego, a małe złote cząsteczki skupiają się w PSD wypustek RGC. Obraz przedstawia podwójne znakowanie immunozłotem GluN2B i CTB. Małe złote cząsteczki znajdują się na pozasynaptycznej błonie plazmatycznej.

Na tym obrazie przedstawiono podwójne znakowanie immunozłotem GluN2A i CTB. Podobnie jak w przypadku GluA2/3, małe cząsteczki skupiają się w obrębie PSD. Tutaj pokazano potrójne znakowanie immunozłotem GluN2A, PSD-95 i CTB.

Cząsteczki złota znakujące GluN2A i PSD-95 współistnieją w obrębie PSD na pojedynczych dendrytach RGC dodatnich dla CTB. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo delikatnej fiksacji tkanki, ponieważ antygenowość niektórych białek, takich jak receptory NMDA, znacznie spada przy silnej i przedłużonej fiksacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat precyzyjnej detekcji i analizy białek błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki.