Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie nowego podejścia do ilościowej analizy białek błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii siatkówki, takie jak dokładna lokalizacja białek w synapsach w obwodzie. Główną zaletą tej techniki jest to, że może oszacować liczbę, gęstość i szybkość wielu białek w synapsach wstęgowych siatkówki.

Demonstrując procedurę zamrażania i ultracienkiego cięcia, mamy doktorów Rona Petralia i Ya-Xian Wanga z NIDCD Advanced Imaging Core. Aby rozpocząć tę procedurę, przeanalizuj gałkę oczną pod mikroskopem. Aby to zrobić, najpierw usuń rogówkę.

Następnie usuń soczewkę i ciało szkliste z powierzchni międzysiatkówkowej za pomocą kleszczy. Następnie obierz twardówkę, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej. Natychmiast pokrój siatkówkę na 100 pasków o grubości 200 mikrometrów za pomocą brzytwy.

Następnie wymieszaj paski siatkówki z 4% paraformaldehydem w 0,1 molowym PB. Następnie w 4% paraformaldehydu plus 0,01% aldehydu glutarowego w temperaturze pokojowej. Po kilku płukaniach w PB 0,15 milimolowym chlorkiem wapnia, krioprotechluj paski siatkówki glicerolem w 0,1 molowym PB, przed substytucją przez zamrożenie. Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w płaskich uchwytach do zatapiania, wytnij cienkie kółko z przezroczystego plastikowego arkusza i umieść je na dnie każdego uchwytu, aby umożliwić łatwiejsze wyjęcie spolimeryzowanego pudełka na próbki po zakończeniu.

Teraz ustaw automatyczną sekwencję w AFS. Napełnij AFS ciekłym azotem i umieść w nim płaskie uchwyty do osadzania. Napełnij je 1,5% octanem uranylu w metanolu i wstępnie ostudź.

Aby zanurzyć paski siatkówki w ciekłym propanie w temperaturze 184 stopni Celsjusza, użyj cienkiej szczotki, aby umieścić próbki na małych kawałkach podwójnie przyklejonej taśmy przymocowanej do metalowych króćców na końcu prętów zanurzających. Następnie odetnij dodatkowy bufor za pomocą szczotki. Zanurz pręty w ciekłym propanu na około pięć sekund.

Następnie przenieś je do AFS za pomocą małej komory transportowej, która jest wypełniona ciekłym azotem. Po umieszczeniu zamrożonej próbki i narzędzi, kleszczyków i skalpela, w AFS, schłodzić narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki. Lub schłodzić je, umieszczając końcówki instrumentów na kilka sekund w małej komorze transportowej wypełnionej ciekłym azotem.

Następnie usuń próbkę i taśmę z klocka za pomocą drobnego skalpela. Następnie umieść dwa kawałki zamrożonych odcinków w każdym z siedmiu dołków w płaskim aluminiowym uchwycie do zatapiania z 1,5% octanem uranylu w metanolu. Trzymaj je w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez co najmniej 32 godziny w AFS.

Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do 45 stopni Celsjusza w sekwencji automatycznej. Następnie umyj próbki trzykrotnie we wstępnie schłodzonym metanolu. Następnie stopniowo infiltruj próbki za pomocą niskotemperaturowych żywic zatapiających jako medium do zatapiania.

Następnego dnia ponownie wymień żywicę i dostosuj poziom żywicy, aby dotrzeć do górnej krawędzi studzienek. Ustaw światło UV na AFS i polimeryzuj próbki światłem UV w AFS do końca automatycznej sekwencji. Następnie należy usunąć próbki z systemu AFS.

Zazwyczaj bloki próbki nadal wykazują pewną różowość i kolor. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestoriach chemicznych w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu, gdy staną się całkowicie przezroczyste. Na tym etapie wytnij ultracienkie odcinki o grubości 70 nonometrów za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na formvar powlekanych węglem siatkach niklowych.

Umyj kratki raz w wodzie destylowanej, a następnie trzy razy przepłucz TBS. Następnie inkubować siatki w 20 mikrolitrach 5% BSA w TBS przez 30 minut, a następnie w 20 mikrolitrach mieszaniny zawierającej kozi anty-CTB i przeciwciało przeciwko jednej podjednostce NMDAR przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie umyj kratki trzykrotnie 20 mikrolitrami TBS za każdym razem przy pH 7,6.

Następnie umyj kratki raz TBS przy pH 8,2 przez pięć minut. Inkubować siatki przez dwie godziny z 20 mikrolitrami mieszaniny zawierającej IGG przeciwko królikom osła sprzężoną z 10-nanometrowymi cząstkami złota i IGG anty-koziego osła sprzężoną z 18-nanometrowymi cząstkami złota. Po dwóch godzinach umyj kratki w 20 mikrolitrach TBS, trzykrotnie przy pH 7,6, a następnie umyj je w ultraczystej wodzie, a następnie wysusz kratki na powietrzu.

Następnie przeciwbarwić siatki 5% octanem uranylu w wodzie destylowanej przez osiem minut, a następnie 0,3% cytrynianem ołowiu w wodzie destylowanej przez pięć minut w ciemności. W przypadku eksperymentów z potrójnym znakowaniem należy inkubować siatki przez noc w temperaturze pokojowej z 20 mikrolitrami mieszaniny anty-koziego CTB, anty-mysiego PSD-95 i anty-królika UN2A. Następnie inkubuj siatki przez dwie godziny z 20 mikrolitrami mieszaniny IGG sprzężonych z 18, 10 i pięcionanometrowymi cząstkami złota.

W tej sekcji najpierw ustaw podziałkę liniową. Następnie zmierz długość PSD poszczególnych dendrytów RGC za pomocą oprogramowania ImageJ. Następnie policz cząsteczki złota w promieniu 10 nanometrów od błony w oparciu o średnią grubość od siedmiu do dziewięciu nanometrów dla błony plazmatycznej.

Oblicz gęstość cząstek jako liczbę cząstek złota na mikrometr liniowy. Następnie zmierz odległość między środkiem każdej cząsteczki złota a środkiem PSD dla lokalizacji synaptycznej lub krawędzi PSD dla lokalizacji pozasynaptycznej. Ten obraz przedstawia podwójne znakowanie GluA2/3 i CTB za pomocą immunozłota.

Jest to wstęga presynaptyczna, a małe cząsteczki złota są skupione w PSD procesów RGC. Ten obraz przedstawia podwójne znakowanie immunogold GluN2B i CTB. Małe cząsteczki złota znajdują się na pozasynaptycznej błonie plazmatycznej.

A ten obraz pokazuje podwójne znakowanie immunozłotem GluN2A i CTB. Podobnie jak w przypadku GluA2/3, małe cząstki są skupione w PSD. Potrójne znakowanie immunozłotem GluN2A, PSD-95 i CTB pokazano tutaj.

Cząstki złota GluN2A i cząstki złota PSD-95 są kolokalizowane w PSD na poszczególnych dendrytach RGC dodatnich pod względem CTB. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o bardzo delikatnym utrwaleniu tkanki, ponieważ niektóre antygenowość białek, takie jak antygenowość receptorów NMDA, znacznie spada przy silnym, przedłużonym utrwaleniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać i analizować białka błonowe z dużą precyzją w synapsach wstęgowych siatkówki.