Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka
18 marca 2016
Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest przetestowanie zależnej od zasolenia toksyczności chemikaliów dla organizmów wodnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekotoksykologii, takie jak ocena toksyczności w wodzie słodkiej, słonawej i morskiej. Główną zaletą tej techniki jest to, że medaka nigdy nie jest proszona o testowanie toksyczności chemikaliów w różnych zasoleniach.
Dodatkowo, implikacje tej techniki rozciągają się na inne terapie lub diagnostykę toksyczności chemikaliów. Przygotowanie komercyjnych nanokoloidów srebra w roztworze, o różnym zasoleniu, jest omówione w protokole tekstowym. Podobnie jak hodowla medaka i zbieranie jaj.
Rozpocznij od przepłukania sześciu kolekcji jaj medaka etapu 21, trzykrotnie w roztworze testowym. Zrób to za pomocą ERM, w różnym stężeniu dla każdego zestawu jaj. Teraz, z każdej wypłukanej grupy, przenieś 15 jaj do innego dołka z roztworem testowym, na sześciodołkowej plastikowej płytce.
Przygotuj ten eksperyment w trzech egzemplarzach, myjąc każdą grupę osobno. Zawiń płytki w folię i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza, w ciemności. Do momentu wyklucia się jaj lub przez 14 dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
Podczas inkubacji należy codziennie obserwować jaja pod kątem zmian biologicznych. I dla wszelkich martwych jaj. Zmieniaj roztwór testowy codziennie, wraz z dokonywaniem obserwacji.
W szóstym dniu obserwacji policz tętno każdego zarodka w ciągu 15 sekund. Również szóstego dnia zmierz średnicę oczu każdego zarodka, w każdych warunkach eksperymentalnych, za pomocą mikrometru. Za każdym razem, gdy zarodki wykluwają się z larw, zmierz ich pełną długość ciała za pomocą mikrometru.
Ponadto w ciągu 14 dni licz całkowitą liczbę wykluwających się jaj. Aby zmierzyć bioakumulację srebra, szóstego dnia należy zebrać kosmówkę jaj przy użyciu standardowej metody. Jaja z odkoryzacją mogą być analizowane tak samo, jak analizowany jest roztwór SNC, jak opisano w następnym rozdziale.
Aby wyizolować rozpuszczalne srebro z każdego roztworu SNC. Najpierw odfiltruj mieszaninę koloidów i rozpuszczalnego srebra za pomocą membrany o mocy trzech kilodaltonów. Następnie odwiruj załadowany filtr z prędkością 14 000 G przez 10 minut w wirówce z chłodzeniem.
Z 50 mikrolitrów filtratu zmierzyć stężenie srebra za pomocą analizy ICP-MS. Załaduj podwielokrotność do zlewki teflonowej o pojemności 50 mililitrów i dodaj do niej dwa mililitry ultraczystego kwasu azotowego. Następnie podgrzej mieszaninę na gorącej płycie w temperaturze 110 stopni Celsjusza.
W ciągu około trzech godzin podgrzewania pozwól roztworowi prawie wyschnąć. Gdy zlewka ostygnie, całkowicie rozpuść organiczne ciała stałe. Dodaj dwa mililitry ultraczystego kwasu azotowego i 0,5 mililitra nadtlenku wodoru do zlewki.
Następnie ponownie podgrzej mieszaninę, aż prawie wyschnie. Teraz rozpuść pozostałą pozostałość w czterech mililitrach jednoprocentowego ultraczystego kwasu azotowego, wykonanego w ultraczystej wodzie. Przenieś roztwór do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Powtórz proces rozpuszczania pozostałych ciał stałych w zlewce teflonowej jeszcze dwa razy, schładzając trzy kolekcje w jednej probówce. Teraz zmierz stężenie srebra w próbce za pomocą ICP-MS. Do analizy próbek należy użyć protokołu zalecanego przez producenta.
Pamiętaj, aby korzystać ze standardów wewnętrznych i zewnętrznych. Wpływ zasolenia na toksyczność SNC był łatwo zauważalny. Wywołanie deformacji lub śmierci było wyraźnie zależne od zasolenia.
Wykonano różne pomiary fizjologiczne. Tętno nie miało wpływu na tętno do momentu, gdy zasolenie osiągnęło 30 X ERM. Długość ciała była istotnie krótsza przy zasoleniu 15 i 30 X ERM.
Średnica oka również spadła, co jest zgodne z długością ciała. Wylęg był mniej prawdopodobny przy 15 X ERM i wystąpił tylko dla dwóch procent jaj w 30 X ERM. W roztworach eksperymentalnych kompleksy metali rozpuszczalnych w wodzie tworzyły się łatwiej wraz ze wzrostem stężenia soli.
Badanie kompleksów metali w zarodkach po sześciu dniach wykazało, że ich stężenie w zarodkach wzrastało wraz ze wzrostem stężenia w roztworze. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dostosowaniu pH warunków testowych, ponieważ uwalnianie jonów srebra jest ułatwione przez kwaśne warunki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową wysokoprzepustową metodę oceny toksyczności substancji chemicznych dla embrionów wodnych w zależności od zasolenia, ze szczególnym uwzględnieniem ryby medaka. Metoda ta wypełnia istotną lukę w ekotoksykologii, umożliwiając ocenę toksyczności substancji chemicznych przy różnych poziomach zasolenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekotoksykologia
- Toksykologia wodna
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Stadia embrionalne organizmów wodnych są wysoce podatne na ksenobiotyki.
- Obecne metody nie testują w sposób wystarczający zależności toksyczności chemicznej od zasolenia.
- Zrozumienie toksyczności przy różnych poziomach zasolenia jest kluczowe dla ocen środowiskowych.
- Ryba medaka służy jako organizm modelowy w testach toksyczności.
Cel badania
- Opracowanie metody badania toksyczności substancji chemicznych przy różnym zasoleniu.
- Pogłębienie zrozumienia wpływu substancji chemicznych na organizmy wodne w zróżnicowanych środowiskach.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań ekotoksykologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komercyjnych nanokoloidów srebra przy różnych poziomach zasolenia.
- Hodowla ryb medaka i pobieranie jaj.
- Wysokoprzepustowe testy toksyczności w warunkach wody słodkiej, słonawej i morskiej.
- Ocena wpływu substancji chemicznych na rozwój zarodkowy.
Główne wyniki
- Nowa metoda skutecznie mierzy toksyczność chemikaliów w różnych warunkach zasolenia.
- Wyniki wskazują na istotne różnice w toksyczności w zależności od poziomu zasolenia.
- Zarodki medaki wykazują wiarygodną reakcję na ekspozycję chemiczną przy różnych poziomach zasolenia.
- Technika ta ma szersze zastosowanie w ocenie toksyczności substancji chemicznych w środowiskach wodnych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia nowatorskie podejście do oceny toksyczności chemicznej u organizmów wodnych.
- Wyniki wniosą wkład do dziedziny ekotoksykologii poprzez analizę efektów zasolenia.
- Badanie podkreśla znaczenie uwzględnienia czynników środowiskowych w ocenach toksyczności.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy toksyczności zależne od zasolenia z wykorzystaniem ikry medaki umożliwiają zespołom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego ocenę bezpieczeństwa chemicznego i toksyczności mechanistycznej w zróżnicowanych fizjologicznie warunkach wodnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w ocenie ryzyka środowiskowego i wspiera wczesną minimalizację ryzyka w przypadku kandydujących nanomateriałów. Wprowadzenie zasolenia jako zmiennej wypełnia istotną lukę w standardowych procedurach badania toksyczności, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dotyczących związków o potencjale ekspozycji środowiskowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę mechanistyczną toksyczności związków w obrębie gradientów środowiskowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną ścieżek toksyczności pod wpływem siły jonowej i ciśnienia osmotycznego.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną profilów bezpieczeństwa środowiskowego nowych substancji chemicznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych testów opartych na embrionach do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w warunkach zmiennego zasolenia.
- Standaryzuje ilościowe punkty końcowe, takie jak częstotliwość bicia serca, średnica oka i odsetek wyklucia, w celu zapewnienia powtarzalnej oceny toksyczności.
- Umożliwia wiarygodne porównanie efektów działania związków w analogach wody słodkiej, słonawej i morskiej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje testy toksyczności do rzeczywistej ekspozycji środowiskowej, istotnej dla rozwoju translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość przejścia od przesiewowej fazy odkrywania do przedklinicznej oceny ryzyka środowiskowego.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku związków z potencjalnymi obciążeniami wynikającymi z ekspozycji w środowisku wodnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test mieści się w kontinuum od wczesnej fazy odkrywania do przedklinicznej oceny ryzyka, łącząc mechanistyczną ocenę toksyczności z profilowaniem bezpieczeństwa środowiskowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów toksyczności modulowanej zasoleniem oraz bioakumulacji.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do oceny związków w różnych warunkach.
- Analityka: Umożliwia ilościowe oznaczenie akumulacji srebra metodą ICP-MS oraz analizę punktów końcowych fizjologicznych do badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki laboratoryjne ze scenariuszami ekspozycji środowiskowej w kontekście kwestii regulacyjnych i bezpieczeństwa.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych nanomateriałów i chemikaliów w zmiennych warunkach wodnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną wyników toksyczności w różnych kontekstach środowiskowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy toksyczności oparte na embrionach w celu stworzenia skalowalnych i powtarzalnych procedur.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań nad związkami z ryzykiem ekspozycji środowiskowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów chemicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile bezpieczeństwa środowiskowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie wodnych systemów modelowych oraz pracy z embrionami.
- Wymagany jest dostęp do aparatury ICP-MS w celu ilościowej analizy metali.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja warunków testowych i punktów końcowych pomiędzy zespołami.
- Metodę można dostosować do innych gatunków wodnych poprzez odpowiednie modyfikacje protokołu.
- Poprawność analizy zależy od precyzyjnej kontroli pH oraz zasolenia.
