Name: Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę oceny toksyczności nanokoloidów srebra w różnych zasoleniach przy użyciu jaj ryb Medaka. Technika umożliwia szybkie testowanie wpływu chemikaliów na organizmy wodne w warunkach słodkowodnych, brakowych i morskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Pani Kaori Shimizu i Panu Masaki Takasu z Graduate School of Life Sciences, Toyo University, za ich wsparcie techniczne. Projekt ten został wsparty grantami badawczymi ze Specjalnej Fundacji Badawczej i Centrum Badań Bio-Nanoelektroniki Uniwersytetu Toyo (dla SK); przez Fundusz Promocji Badań Naukowych Korporacji Promocji i Wzajemnej Pomocy dla Szkół Prywatnych w Japonii (na rzecz SK); przez Nowy Fundusz Projektów Oceny Ryzyka z Ministerstwa Gospodarki, Handlu i Przemysłu (dla SK); w ramach programu Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (23651028 przyznany SK); w formie dotacji na badania naukowe (B) i (C) (przyznanie 23310026 i 26340030 SK); oraz w ramach grantu na projekt strategicznej bazy badawczej dla uniwersytetów prywatnych (S1411016 dla SK) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Japońska medaka użyta w tym badaniu była traktowana humanitarnie, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Toyo, z należytym uwzględnieniem łagodzenia stresu i dyskomfortu.
1. Nanokoloidy srebra (SNC)
<ol>
	<li>Zakup oczyszczonych SNC (20 mg/L−1, czystość 99,99%, średnia średnica cząstek około 28,4 ± 8,5 nm zawieszone w wodzie destylowanej).</li>
	<li>Zatwierdzić czystość i stężenie srebra za pomocą analiz spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) zgodnie z instrukcją obsługi8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów SNC (mieszaniny koloidów srebra i Ag+) o różnym zasoleniu
<ol>
	<li>Przygotować 60× ERM składający się z 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl2·2H2O i 9,78 g MgSO4·7H2O w 1 l ultraczystej wody; dostosować pH do 7,0 za pomocą 1,25%NaHCO3 w wodzie ultraczystej.</li>
	<li>Roztwór ERM mieszać w temperaturze 25 °C przez noc.</li>
	<li>Wymieszaj SNC z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml każdego zmieszanego roztworu SNC-ERM. Końcowe stężenie wynosi 10 mg/L−1 SNC w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x).</li>
	<li>Doprowadzić pH zmieszanego roztworu SNC-ERM do 7,0 z 0,625%NaHCO3 w ultraczystej wodzie. Dostosowanie pH jest bardzo ważne przy przygotowywaniu roztworu SNC, ponieważ uwalnianie Ag+ jest ułatwione w kwaśnych warunkach9.</li>
	<li>Stosować AgNO3 jako związek odniesienia dla SNC.
	<ol>
		<li>Zmieszać AgNO3 z rozcieńczonym ERM. Przygotować 40 ml mieszaniny AgNO3-ERM o stężeniu AgNO3 15,7 mg/L-1 (10 mg/L−1 srebra) w różnych stężeniach ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x). 
		Uwaga: Aby zbadać toksyczność koloidów srebra, roztwór AgNO3, który jest źródłem rozpuszczalnego srebra, jest stosowany jako związek odniesienia dla SNC, które są mieszaniną koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla Medaka i zbieranie jaj
<ol>
	<li>Zdobądź medaka (O. latipes) (szczep pomarańczowo-czerwony) (60 samców i 60 samic).</li>
	<li>Hodowla medaka w grupach (20 samców i 20 samic w jednej grupie) w 1x ERM w zbiornikach o pojemności 3 litrów przy użyciu przepływowego systemu hodowli medaka.
	<ol>
		<li>Hodowla w następujących warunkach: 
		Zakres pH pożywki: 6,2 do 6,5 
		Światło: Ciemny cykl: 16:8 godz 
		temperatura pożywki: 24 ± 0,5 °C 
		ciśnienie osmotyczne pożywki hodowlanej: 257 mOsm</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm medakę naupliami Artemia salina o 10:00 (raz dziennie) i karm sztuczną dietą suchych ryb o 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 i 17:00 (pięć razy dziennie).
	<ol>
		<li>Otrzymaj nauplii A. salina.</li>
		<li>Przygotuj 5 l 3,0% roztworu soli w plastikowej zlewce.</li>
		<li>Dodaj 30 g jaj krewetek solankowych do roztworu soli w zlewce.</li>
		<li>Inkubować jaja w temperaturze 25 °C przez 48 godzin z bulgotaniem (4 l/min-1) za pomocą pompy napowietrzającej.</li>
		<li>Po 48 godzinach przestań bulgotać.</li>
		<li>Pozostawić roztwór na 5 do 10 minut, aby oddzielić wyklute nauplia A. salina (dolna część roztworu) od niewyklutych jaj i skorupek jaj (górna część roztworu).</li>
		<li>Usunąć górną warstwę roztworu przez dekantację.</li>
		<li>Przefiltrować dolną część roztworu przez sito z otworami o średnicy 283 μm i zebrać nauplia, które przez nie przechodzą, na siatce z otworami o średnicy 198 μm.</li>
		<li>Nakarm nauplii medaka w ciągu 6 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po tarle samic medaka delikatnie usuń zewnętrzne skupiska jaj z ciał samic lub zbierz jaja z dna akwarium za pomocą małej siatki (rozmiar siatki 5 cm x 5 cm, rozmiar otworu 0,2 mm x 0,2 mm).</li>
	<li>Opłucz kiść jaj pod bieżącą wodą z kranu przez 5 sekund.</li>
	<li>Dodaj wszystkie opłukane kiście jaj do 30-krotnego roztworu ERM.</li>
	<li>Wyjmij kiście z roztworu po 1 minucie i umieść je między suchymi ręcznikami papierowymi i delikatnie zwiń.</li>
	<li>Włóż jajka z powrotem do 30x ERM.</li>
	<li>Wybierz zapłodnione jaja pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Umieść wybrane 810 jaj w 1x ERM na sześciodołkowych plastikowych płytkach za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Jaja inkubować w temperaturze 25 ± 0,1 °C w inkubatorze do stadium rozwojowego 21. (Stadia rozwojowe embrionów medaka zostały zdefiniowane na podstawie pracy Iwamatsu10.)</li>
	<li>Wybierz inkubowane jaja w stadium rozwojowym 21 pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Opłucz wybrane jajka za pomocą 1x ERM.</li>
	<li>Poddane płukanym jajom poddać eksperymentom związanym z narażeniem (sekcja 4).</li>
</ol>
4. Badanie toksyczności SNC lub AgNO3 przy różnych zasoleniach ERM
<ol>
	<li>Opłucz jaja medaka (etap 21) trzykrotnie roztworem badanym [SNC (10 mg/L−1) lub AgNO3 (15,7 mg/L−1 jako 10 mg/L−1 srebra) przy każdym stężeniu ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x lub 30x) przy pH 7]. Jako kontrolę należy użyć jaj w 1× do 30× ERM o pH 7.</li>
	<li>Dodać 15 opłukanych jaj do 5 ml każdego roztworu badanego na sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego. (Przeprowadzić doświadczenia narażenia trzy razy w celu zbadania toksyczności SNC lubAgNO3 przy użyciu każdego roztworu badanego.)</li>
	<li>Zawiń talerze w folię aluminiową.</li>
	<li>Inkubować owinięte płytki w temperaturze 25 °C w ciemności do momentu wylęgu lub przez 14 dni.</li>
	<li>Obserwuj odsłonięte jaja co 24 godziny pod kątem zmian biologicznych i martwych jaj (ryc. 1 i 2).</li>
	<li>Wymieniaj roztwory testowe co 24 godziny.</li>
	<li>Wykonaj obserwacje w następujący sposób.
	<ol>
		<li>W 6 dniu ekspozycji należy policzyć tętno (na 15 sekund) zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą stopera (ryc. 3a).</li>
		<li>W 6 dniu ekspozycji zmierz rozmiar (średnicę) oczu zarodków medaka pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3b).</li>
		<li>W dniu wylęgu należy zmierzyć całą długość ciała larw pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrometru (ryc. 3c).</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę odsłoniętych jaj, które wykluwają się w ciągu 14 dni (ryc. 3d).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Izolacja rozpuszczalnego srebra z roztworu SNC i analiza srebra
<ol>
	<li>Wyizolować rozpuszczalne srebro z każdego roztworu SNC (mieszaniny koloidów srebra i rozpuszczalnego srebra) poprzez filtrowanie przez filtr membranowy o mocy 3 kDa przy 14 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min. Użyć filtra membranowego o mocy 3 kDa do wyizolowania rozpuszczalnego srebra od SNC, ponieważ podana średnia średnica zagregowanych SNC w 1x ERM wynosi 67,8 nm11, a Ag+ wynosi 0,162 nm12; membrana 3 kDa nie obejmuje cząstki o średnicy 2 nm lub większej13.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie srebra w 50 μl przefiltrowanego roztworu (= stężenie rozpuszczalnego srebra) za pomocą analizy ICP-MS (rysunek 3e) zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8. Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.</li>
</ol>
6. Pomiar bioakumulacji srebra w zarodkach Medaka
<ol>
	<li>Wystawić jaja medaka (etap 21) na działanie SNC lub AgNO3, jak opisano w punkcie 4.</li>
	<li>W 6 dniu ekspozycji usuń kosmówkę z komórki jajowej (tj. dechorion) za pomocą enzymu wylęgowego medaka zgodnie z protokołem opisanym w Księdze Medaka14.</li>
	<li>Zmierz stężenie srebra w jajach z odkorówką za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi ICP-MS8 (rysunek 3f). Metoda obróbki wstępnej dla analiz ICP-MS jest opisana w sekcji 7.</li>
</ol>
7. Pomiar stężenia srebra za pomocą analizy ICP-MS
<ol>
	<li>Dodać próbki [50 μl roztworu srebra (w celu sprawdzenia stężenia srebra; sekcja 1); trzy zarodki z odkorówką (sekcja 5); lub 50 μl przefiltrowanego roztworu (sekcja 5)] do zlewki teflonowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego do zlewki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej w temperaturze 110 °C, aż do momentu tuż przed wyschnięciem (około 3 godziny).</li>
	<li>Aby całkowicie rozpuścić materię organiczną, dodaj do zlewki 2,0 ml ultraczystego kwasu azotowego i 0,5 ml nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Ponownie podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej, aż do momentu wyschnięcia (około 3 godzin).</li>
	<li>Pozostałość rozpuścić w 4 ml 1,0% ultraczystego roztworu kwasu azotowego.</li>
	<li>Przenieść 4 ml roztworu do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Powtórz od 7,6 do 7,7 dwa razy (w sumie trzy razy). Ostateczna objętość to 12,0 ml.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie srebra w próbce (rozpuszczonej w 1,0% ultraczystym kwasie azotowym) za pomocą analizy ICP-MS zgodnie z instrukcją obsługi8.
	<ol>
		<li>Użyć wewnętrznego i zewnętrznego roztworu wzorcowego (patrz Lista materiałów) w celu ilościowego określenia stężenia srebra. Wewnętrzne i zewnętrzne rozwiązanie wzorcowe jest akredytowane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Akredytacji Laboratoriów (A2LA). Granice wykrywalności srebra wynosiły 0,0018 ng/ml-1 (roztwór) i 0,016 ng mg-wagowo-1 (ciało zarodka).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2+Effects+on+Biotic+Systems%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems</a>. , OECD. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761">http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22National+Coastal+Condition+Report%22">National Coastal Condition Report</a>. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).</li>
<li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fac.+Sci.+Univ.+Tokyo%22%5BJournal%5D)">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li>
<li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+%28Oryzias+latipes%29+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jpn.+Soc.+Waste+Manage.+Exp%22%5BJournal%5D)">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li>
<li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22EHP%22%5BJournal%5D)">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwamatsu%2C+T+%22The+Integrated+Book+for+the+Biology+of+the+Medaka%22">The Integrated Book for the Biology of the Medaka</a>. , University Education Press. Japan. (2006).</li>
<li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zoo.+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XSERIES+2+ICP-MS+Getting+Started+Guide+Revision+B+-+121+9590%22">XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from:
 <a target="_blank" href="http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf">http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf</a> (2007).</li>
<li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions%5BTitle%5D)+AND+%22ES+%26+T%22%5BJournal%5D)">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li>
<li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li>
<li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li>
<li>Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from:
 <a target="_blank" href="http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html">http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html</a> (2015).</li>
<li>Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from:
 [cited 2015] <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme">https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Medaka to ryba słodkowodna, która jest wysoce tolerancyjna na wodę morską; nie jest powszechnie znane, że pierwotnym naturalnym środowiskiem tej ryby była słona woda u wybrzeży Japonii6. W związku z tym ryby medaka mają dobrze rozwinięte komórki chlorkowe7. Ta unikalna właściwość zapewnia naukowcom nowy sposób testowania toksyczności substancji chemicznych w środowisku w funkcji zasolenia (woda słodka do wody morskiej) przy użyciu tylko jednego gatunku ryb.
Aby uzyskać ja...

Od czasu ustanowienia Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) wytycznych dotyczących testowania substancji chemicznych w 1979 roku, w sekcji 2 wytycznych, Wpływ na systemy biotyczne1, opublikowano 38 wytycznych dotyczących testów. Wszystkie badane organizmy wodne pochodziły z siedlisk słodkowodnych, a mianowicie z roślin słodkowodnych; glony; bezkręgowce, takie jak rozwielitki i chironomidy; oraz ryby takie jak medaka, danio pręgowany i pstrąg tęczowy. W porównaniu ze środowiskami słonowodnymi, na środowiska słodkowodne bardziej bezpośredni wpływ ma działalność gospodarcza i przemysłowa człowieka. W związku z tym środowiska słodkowodne zostały potraktowane priorytetowo do testów, ponieważ są one bardziej narażone na zanieczyszczenie.
Na obszarach przybrzeżnych, w tym ujścia rzek, zasolenie waha się między słonawą wodą a wodą morską, a obszary te są często zanieczyszczone przez działalność przemysłową2. Obszary przybrzeżne i związane z nimi tereny podmokłe charakteryzują się wysoką ekologiczną różnorodnością biologiczną i produktywnością. Ekosystemy przybrzeżne muszą być zatem chronione przed zanieczyszczeniem chemicznym. Przeprowadzono jednak ograniczone badania ekotoksykologiczne w siedliskach wód słonawych i morskich.
Sakaizumi3 badał toksyczne interakcje między metylortęcią a zasoleniem w japońskich jajach medaka i odkrył, że zwiększenie ciśnienia osmotycznego roztworu testowego zwiększa toksyczność metylortęci. Sumitani i wsp. 4 wykorzystano jaja medaka do zbadania toksyczności odcieków ze składowisk odpadów; Odkryli, że osmotyczna równoważność odcieku z jaj była kluczem do wywołania nieprawidłowości podczas embriogenezy. Ponadto Kashiwada5 poinformowała, że nanocząstki plastiku (o średnicy 39,4 nm) łatwo przenikają przez kosmówkę jaja medaka w słonawych warunkach (15x pożywka do hodowli zarodków (ERM)).
Typowy model małej ryby, japońska medaka (Oryzias latipes) była używana w podstawowej biologii i ekotoksykologii6. Japońska medaka może żyć w warunkach od słodkiej do morskiej ze względu na wysoko rozwinięte komórki chlorkowe7. W związku z tym mogą być przydatne do testowania w warunkach o szerokim zakresie zasolenia.

<table><tbody><tr><td>Nanokoloidy srebra</td><td>Utopia Suplementy</td><td></td><td></td>srebra</tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>Do produkcji ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>Do tworzenia ERM</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>Do wytwarzania ERM</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>Do tworzenia ERM</td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>Do produkcji ERM</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>HORIBA, Sp. z o.o.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (Oryzias latipes) pomarańczowo-czerwony szczep</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka przepływowy system hodowli</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii</td><td>jaja Japonia pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>pompa napowietrzająca</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>niehałasująca w300</td><td></td></tr><tr><td>Larwa Otohime &beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Larwa Otohime &beta;-1 Sztuczny</td> mikroskop preparacyjny <td>do diety z suszonych ryb</td></tr><tr><td></td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>mikrometr</td><td>Fujikogaku, Sp. z o.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10450023 inkubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>wytrząsarka</td><td>ELMI Sp. z o.o.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki plastikowe</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>folia aluminiowa</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stoper</td><td>DRETEC Co., Ltd.</td><td>SW-111YE Filtr membranowy</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0,5 ml filtr</td><td></td>odśrodkowy</tr><tr><td>50 ml zlewka teflonowa</td><td>AS ONE Co.</td><td></td><td></td>33431097</tr><tr><td>Niestandardowy standard claritas</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>Dla wewnętrznego standardu</td></tr><tr><td>Niestandardowy standard claritas</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>Dla zewnętrznego standardu</td></tr><tr><td>ultraczystego kwasu azotowego</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru&nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>do atomowej spektrometrii absorpcyjnej</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>płyta grzewcza</td><td>Tiger Co.</td><td>Aparat CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj medaka

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Zasolenie jest ważną cechą środowiska wodnego. W przypadku organizmów wodnych określa siedliska wody słodkiej, słonawej i morskiej. Badania toksyczności chemikaliów i oceny ich zagrożeń ekologicznych dla organizmów wodnych są często przeprowadzane w wodach słodkich, ale toksyczność chemikaliów dla organizmów wodnych zależy od pH, temperatury i zasolenia. Nie istnieje jednak metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. Tutaj użyliśmy medaka (Oryzias latipes), ponieważ potrafią przystosować się do wody słodkiej, słonawej i morskiej. Różne stężenia pożywki do hodowli zarodków (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x i 30x) zastosowano do zbadania toksyczności cząstek nanokoloidalnych srebra (SNC) dla jaj medaka (1x ERM i 30x ERM mają ciśnienie osmotyczne równoważne odpowiednio wodzie słodkiej i morskiej). W sześciodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego 15 jaj medaka w trzech egzemplarzach wystawiono na działanie SNC w dawce 10 mg/L−1 w różnych stężeniach ERM przy pH 7 i 25 °C w ciemności.
Użyliśmy mikroskopu preparacyjnego i mikrometru do pomiaru częstości akcji serca na 15 sekund i średnicy oka w dniu 6 oraz pełnej długości ciała larw w dniu wyklucia (sekcja 4). Zarodki obserwowano do wyklucia lub 14 dnia; Następnie liczyliśmy wskaźnik wylęgu codziennie przez 14 dni (sekcja 4). Aby zobaczyć akumulację srebra w zarodkach, zastosowaliśmy spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie do pomiaru stężenia srebra w roztworach testowych (sekcja 5) i zarodkach z odwążówką (sekcja 6). Toksyczność SNC dla embrionów medaka oczywiście wzrastała wraz ze wzrostem zasolenia. Ta nowa metoda pozwala nam badać toksyczność substancji chemicznych o różnym zasoleniu.

Wpływ zasolenia na toksyczność SNC był bardzo wyraźny: indukcja deformacji lub śmierć były zależne od poziomu zasolenia (Ryc. 1 i 2). Zmierzono biomarkery fenotypowe (częstość akcji serca, wielkość oczu, całkowitą długość ciała oraz odsetek wyklucia) u embrionów eksponowanych na SNC (10 mg/L−1). Biomarkery fenotypowe te ujawniły zależną od zasolenia toksyczność SNC.
Częstość akcji ser...

Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.

Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie toksyczności substancji chemicznych wobec organizmów wodnych w zależności od zasolenia. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekotoksykologii, takie jak ocena toksyczności w warunkach wody słodkiej, słonawej i morskiej. Główną zaletą tej techniki jest to, że ryby medaka nie były wcześniej wykorzystywane do badania toksyczności substancji chemicznych przy różnych poziomach zasolenia.Ponadto zastosowania tej techniki rozciągają się na inne metody terapii lub diagnostyki toksyczności substancji chemicznych. Przygotowanie komercyjnych nanokolloidów srebra w roztworze, przy różnych poziomach zasolenia, zostało opisane w protokole tekstowym. Podobnie jak hodowla rybek medaka oraz pobieranie ikry.Zacznij od wypłukania sześciu serii ikry medaka w stadium 21, trzykrotnie w roztworze testowym. Wykonaj tę czynność przy użyciu ERM, stosując inne stężenie dla każdego zestawu ikry. Następnie z każdej wypłukanej serii przenieś 15 jaj do osobnej studzienki z roztworem testowym w plastikowej płytce sześciodołkowej.Przygotować ten eksperyment w trzech powtórzeniach, płucząc każdą grupę osobno. Płytki zawinąć w folię aluminiową i inkubować w temperaturze 25 °C, w ciemności, aż do wyklucia się jaj lub przez 14 dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.Podczas inkubacji codziennie obserwuj jaja pod kątem zmian biologicznych oraz obecności martwych jaj. Codziennie wymieniaj roztwór testowy, dokonując jednocześnie powyższych obserwacji.Szóstego dnia obserwacji należy zmierzyć częstotliwość bicia serca każdego zarodka w ciągu 15 sekund. Również szóstego dnia, w każdym z warunków eksperymentalnych, należy zmierzyć średnicę oczu każdego zarodka za pomocą mikrometru. W momencie wyklucia się zarodków do postaci larw należy zmierzyć ich całkowitą długość ciała, używając mikrometru.Ponadto, przez 14 dni należy prowadzić obliczenia całkowitej liczby wyklutych jaj. Aby zmierzyć bioakumulację srebra, w szóstym dniu należy zebrać choriony jaj, stosując standardową metodę. Jaja po dechorionacji można poddać analizie, analogicznie do analizy roztworu SNC, zgodnie z opisem w następnej sekcji.Aby wyizolować rozpuszczalne srebro z każdego roztworu SNC, najpierw przefiltrować mieszaninę koloidów i rozpuszczalnego srebra, używając membrany o wielkości porów 3 kDa. Następnie odwirować załadowany filtr przy 14 000 G przez 10 minut w wirówce chłodzącej.Z 50 µL filtratu zmierz stężenie srebra za pomocą analizy ICP-MS. Przenieś alikwot do 50 mL teflonowego zlewki i dodaj do niej 2 mL ultrazczystego kwasu azotowego. Następnie podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej w temperaturze 110 °C.Podgrzewaj roztwór przez około trzy godziny, aż niemal całkowicie odparuje. Po ostygnięciu zlewki całkowicie rozpuść pozostałe ciała stałe organiczne. Do zlewki dodaj 2 ml ultrapure kwasu azotowego oraz 0,5 ml nadtlenku wodoru.Następnie ponownie podgrzej mieszaninę, aż niemal całkowicie odparuje. Teraz rozpuść pozostałą pozostałość w czterech mililitrach jednego procentowego ultrapurego kwasu azotowego, przygotowanego w wodzie ultrapurej. Przenieś roztwór do 15 mililitrowej probówki do wirowania.Powtórz proces rozpuszczania pozostałych ciał stałych w zlewce teflonowej jeszcze dwa razy, łącząc trzy uzyskane frakcje w jednej probówce. Następnie zmierz stężenie srebra w próbce za pomocą ICP-MS. Do analizy próbek zastosuj protokół zalecany przez producenta.Należy pamiętać o zastosowaniu standardów wewnętrznych i zewnętrznych. Wpływ zasolenia na toksyczność SNC był wyraźnie widoczny. Indukcja deformacji lub śmierć były ewidentnie zależne od stopnia zasolenia.Wykonano różne pomiary fizjologiczne. Częstość akcji serca nie uległa zmianie, dopóki zasolenie nie osiągnęło poziomu 30 X ERM. Długość ciała była znacząco mniejsza przy zasoleniu wynoszącym 15 i 30 X ERM.Średnica oka również uległa zmniejszeniu, co było spójne z długością ciała. Wykluwanie było mniej prawdopodobne przy 15 X ERM i wystąpiło jedynie w przypadku dwóch procent jaj przy 30 X ERM. W zastosowanych roztworach doświadczalnych rozpuszczalne w wodzie kompleksy metali tworzyły się łatwiej wraz ze wzrostem stężenia soli.Badanie kompleksów metali w embrionach po sześciu dniach wykazało, że ich stężenie w embrionach wzrastało wraz ze wzrostem ich stężenia w roztworze. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dostosowaniu pH warunków testowych, ponieważ uwalnianie jonów srebra jest ułatwione w warunkach kwaśnych.

salinity-dependent-toxicity-assay-silver-nanocolloids-using-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Przedstawiono protokół lokalizacji Ag w tkankach wątroby i nerek waleni za pomocą autometalografii. Ponadto opracowano nowy test, nazwany histologicznym testem Ag waleni (CHAA) w celu oszacowania stężeń Ag w tych tkankach.

Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Pokazujemy testy toksyczności glonów dla trudnych substancji (np. substancji kolorowych lub nanomateriałów) za pomocą zestawu oświetlonego pionowo diodą LED.

Zestaw na małą skalę do badania toksyczności glonów nanomateriałów i innych trudnych substancji

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Ta praca ma na celu ocenę i przegląd procedury biologicznego testu śmiertelności Artemia salina, również identyfikowanej jako test śmiertelności krewetek solankowych. Ta prosta i tania metoda dostarcza informacji na temat ogólnej toksyczności (traktowanej jako wstępna ocena toksyczności) próbek, a mianowicie produktów naturalnych.

Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

Poznaj metodę oceny toksyczności nanokoloidów srebra w różnych zasoleniach przy użyciu jaj ryb Medaka. Technika umożliwia szybkie testowanie wpływu chemikaliów na organizmy wodne w warunkach słodkowodnych, brakowych i morskich.

Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka

Przeglądaj więcej filmów