Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności
7 marca 2016
Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa. Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.
Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można wykorzystać bioczujnik do oceny toksyczności próbek wody pitnej. Osiąga się to poprzez tworzenie biochipów, które zawierają monowarstwę komórek skrzelowych pstrąga tęczowego, a następnie wykorzystanie ich jako części bioczujnika opartego na impedancji. Procedura ta umożliwia szybkie wykrycie toksyczności chemicznej w wodzie pitnej na poziomach istotnych dla zdrowia ludzkiego.
Głównymi zaletami tej techniki jest to, że biochipy mogą być używane w warunkach polowych, mogą być przechowywane w niskiej temperaturze przez okres do dziewięciu miesięcy bez żadnej pielęgnacji lub konserwacji komórek oraz że są w stanie gotowym do testów i mogą być używane w dowolnym momencie po wyjęciu z chłodzenia. Tę procedurę zademonstruje Jordan McNairn, student studiów licencjackich z naszego laboratorium. Dzień przed wysiewem komórek wyjmij biochipy z opakowania i umieść je w wysterylizowanych plastikowych walizkach na narzędzia.
Podłącz jeden z przewodów do strzykawki i wlej 20% roztwór wybielacza do strzykawki o pojemności 20 mililitrów. Wstrzyknąć dwa mililitry roztworu do każdego kanału biochipa. Po zakończeniu pozostaw biochipy na godzinę z roztworem wybielacza.
Po godzinie użyj sterylnej jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w męski zestaw poślizgowy luer podłączony do linii próżniowej, aby zassać roztwór wybielacza z obu kanałów. Po zassaniu wybielacza z biochipa, podłącz sterylny zespół rurki z męskimi luzerami poślizgowymi na każdym końcu do biochipa, aby użyć go jako drenu podczas płukania biochipów. Następnie nabierz sterylną wodę do 20-mililitrowej strzykawki i przepłucz każdy kanał chipa pięcioma mililitrami wody.
Odkurz wodę jak poprzednio. I umieść biochipy z powrotem w plastikowych futerałach na instrumenty. Pozostaw biochipy w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do następnego dnia.
Na godzinę przed wysiewem biochipów wstrzyknij dwa mililitry roztworu fibronektyny o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr do każdego kanału biochipa. Inkubuj biochipy w kapturze bezpieczeństwa biologicznego przez 60 minut, a następnie odsysaj próżniowo roztwór fibronektyny. Na koniec umieść dwa sterylne zespoły rurek biochipowych na portach biochipów i odłóż biochipy na bok, aż komórki będą gotowe do wysiewu.
Wyjąć z inkubatora jedną zlewającą się kolbę T-175 zawierającą komórki nabłonkowe skrzeli pstrąga tęczowego i umieścić ją w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Jedna zlewająca się kolba T-175 będzie w stanie wysiać około 16 biochipów. Odessać pożywkę z komórek.
Opłucz je PBS i odessaj PBS. A następnie dodaj sześć mililitrów roztworu trypsyny-EDTA do warstwy komórkowej. Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez około pięć minut.
Następnie dodaj 15 mililitrów kompletnej pożywki do hodowli komórkowych L-15 do każdej kolby, aby dezaktywować trypsynę. Pobrać małą porcję z zawiesiny komórek i użyć hemocytometru do pomiaru stężenia komórek. Zobacz komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w obiektyw 10x.
Następnie oblicz aktualne stężenie komórek i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia ćwierć miliona komórek na mililitr. Następnie użyj sterylnej strzykawki o pojemności 20 mililitrów, aby wstrzyknąć 2,5 mililitra zawiesiny komórkowej do zewnętrznego portu każdego kanału biochipa. Pozwól, aby dodatkowa zawiesina komórkowa wypłynęła z rurki do pojemnika na odpady.
Następnie utwórz zamkniętą pętlę dla każdego kanału biochipa, wkładając wolny koniec węża ze złączką luer do zewnętrznego portu dla każdego kanału. Następnie zwilż ręcznik papierowy 70% etanolem i użyj go do wytarcia nadmiaru mediów z zamkniętych pętli. Następnie umieść biochipy z powrotem w plastikowym pudełku.
W czwartym i siódmym dniu wyjmij biochipy z inkubatora. I zmień pożywkę w biochipach na zrównoważoną temperaturowo kompletną pożywkę do hodowli komórek L-15. Po karmieniu w siódmym dniu wyjmij i wyrzuć węże z wiórów i włóż korki spustowe autoklawu do biochipów.
Umieść biochipy w pudełku w inkubatorze o temperaturze sześciu stopni Celsjusza, aż zostaną użyte do testów. Wyjmij czytnik testowy ECIS i materiały eksploatacyjne z walizki, a następnie włącz czytnik. Wyjmij również jeden z przygotowanych biochipów z inkubatora o temperaturze sześciu stopni Celsjusza i połóż go na ręczniku papierowym.
Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki dozuj 10 mililitrów wody kontrolnej do oznaczonego przezroczystego plastikowego słoika kontrolnego o pojemności 0,5 uncji. Pamiętaj, aby usunąć bąbelki, aby uzyskać dokładny pomiar. Następnie użyj osobnej strzykawki i wlej 10 mililitrów próbki testowej do przezroczystego plastikowego słoika testowego o pojemności 0,5 uncji.
Następnie wyjąć dwie fiolki ze sproszkowaną pożywką. Otworzyć jedną z fiolek ze sproszkowaną pożywką i wlać całą zawartość jednej fiolki do słoika z wodą kontrolną, wrzucając całą fiolkę również do roztworu. Powtórz tę procedurę ze słoikiem testowym.
Następnie zakręć słoiki i potrząśnij nimi, aby upewnić się, że proszek całkowicie się rozpuścił. Napełnij niebieską strzykawkę o pojemności 10 mililitrów dziewięcioma mililitrami roztworu kontrolnego. I czerwona 10-mililitrowa strzykawka z dziewięcioma mililitrami roztworu testowego z odpowiednich fiolek.
Usunąć wszelkie istniejące pęcherzyki powietrza ze strzykawek. Następnie wyjmij zaślepki z portów biochipa i podłącz odpływ. Umieścić biochip w wyjmowanej plastikowej tacce w czytniku ECIS, zamknąć pokrywę, a następnie przymocować napełnione strzykawki do zewnętrznych portów biochipa.
Na koniec założyć tłoki strzykawki. Na ekranie głównym czytnika wybierz przycisk Dalej, aby rozpocząć test wstępny. Oprogramowanie sprawdzi następnie początkowe impedancje.
Jeśli impedancje mieszczą się w zakresie, na ekranie zostanie zarejestrowany komunikat Cartridge passed" i poinstruuje użytkownika, aby wybrał przycisk Dalej. Następnie wprowadź przykładowe informacje za pomocą klawiatury programowej, a następnie wybierz pozycję Zaakceptuj po zakończeniu. W tym momencie z włożonego biochipa zostaną zebrane dwie minuty danych o impedancji, a zegar ekranowy będzie odliczał czas.
Po dwóch minutach naciśnij Dalej. Po wyświetleniu monitu przez zielone pole, aby wstrzyknąć próbki teraz, wstrzyknij jednocześnie pożywkę kontrolną i testową z dołączonych strzykawek do kanałów biochipa. Po zakończeniu pozostawić strzykawki na miejscu na biochipach.
Jeśli oprogramowanie czytnika ECIS stwierdzi, że kanał badawczy różni się statystycznie od kanału kontrolnego w dowolnym momencie badania, wyświetlacz ekranowy wskaże, że próbka jest zanieczyszczona. W przeciwnym razie będzie to oznaczać, że pod koniec okresu monitorowania nie wykryto żadnego zanieczyszczenia. Zapisz wyniki testu jako zanieczyszczone "lub nieskażone" dla każdej próbki.
Pod koniec przebiegu testowego wyjmij i wyrzuć biochip. Wypłucz i wysusz na powietrzu strzykawki, fiolki testowe i wyjmowaną plastikową tackę, w której znajdował się biochip podczas testów. Do testów wybrano 13 substancji chemicznych, które zostały wybrane jako przedstawiciele szerokiego spektrum toksycznych związków przemysłowych, które mogą być potencjalnymi zanieczyszczeniami wody pitnej.
Podczas testów dziewięć z 13 wykryto za pomocą czujnika impedancji podłoża ogniwa elektrycznego w ciągu godziny, w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego. Typowe wyjścia, które byłyby widoczne po teście wykrywania impedancji podłoża ogniwa elektrycznego, przedstawiono tutaj. Zanieczyszczone próbki mają znacznie niższy poziom impedancji w porównaniu z kontrolnymi próbkami czystej wody.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biochip z monowarstwą komórek nabłonka skrzeli pstrąga tęczowego, a następnie użyć tego biochipa w teście toksyczności opartym na impedancji do oceny toksyczności wody pitnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o aseptycznej pracy podczas przygotowywania biochipów, a także o przechowywaniu biochipów w lodówce do momentu ich użycia. Każdy biochip może być użyty tylko raz, a następnie należy go wyrzucić.
Po opanowaniu przygotowanie biochipa można wykonać w około 10 minut. Jest to dane szacunkowe, ponieważ chipsy są przygotowywane partiami. Badanie impedancji próbki, w tym przygotowanie próbki, trwa około godziny i 10 minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak chemia analityczna, na próbce, która dała zanieczyszczony wynik, w celu zidentyfikowania podejrzanej substancji chemicznej lub chemikaliów. Opracowanie tej techniki toruje drogę naukowcom zainteresowanym wykrywaniem toksyczności wody do wykorzystania technologii wykorzystującej komórki nabłonkowe skrzeli pstrąga tęczowego i wykrywanie impedancji. Mamy nadzieję, że techniki te okażą się przydatne i z niecierpliwością czekamy na przyszłe innowacje, które te nowe możliwości mogą pomóc ułatwić.
Dziękuję i życzę miłego dnia.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę przygotowania biochipów mikrofluidycznych z wykorzystaniem komórek nabłonka skrzeli pstrąga tęczowego, które są stosowane w przenośnym elektrycznym czujniku impedancji komórka-podłoże do szybkiego badania toksyczności wody pitnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Toksykologia środowiskowa
- Biologia komórki
- Bioinżynieria
Wstęp
- Toksyczność wody pitnej stanowi krytyczny problem dla zdrowia ludzi.
- Biosensory mogą zapewnić szybką ocenę jakości wody.
- Komórki skrzeli pstrąga tęczowego służą jako biologiczny wskaźnik toksyczności.
- Przenośne sensory polowe zwiększają dostępność testów toksyczności.
Cel badania
- Zaprezentowanie sposobu przygotowania biochipów do badań toksyczności.
- Ocena skuteczności biosensora w wykrywaniu toksyczności chemicznej.
- Przedstawienie protokołu szybkiego testowania w warunkach terenowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie biochipów z komórkami nabłonka skrzeli pstrąga tęczowego.
- Wykorzystanie biosensora impedancyjnego do oceny toksyczności.
- Przechowywanie biochipów w warunkach chłodniczych przez dłuższy czas.
- Szczegółowy protokół wysiewania komórek i przeprowadzania testów.
Główne wyniki
- Biosensor może wykrywać toksyczność chemiczną istotną dla zdrowia ludzi.
- Biochipy pozostają zdolne do testowania po przechowywaniu w niskiej temperaturze.
- Szybkie testy mogą być przeprowadzane w warunkach terenowych.
- Pomiary impedancji dostarczają wiarygodnych danych do oceny toksyczności.
Wnioski
- Opracowany biosensor jest skuteczny w szybkim badaniu toksyczności.
- Przenośne biochipy mogą znacząco usprawnić monitorowanie jakości wody.
- Metoda ta stanowi praktyczne rozwiązanie w zakresie oceny stanu zdrowia środowiska.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten biosensor oparty na impedancji umożliwia szybkie, terenowe badanie toksyczności wody pitnej z wykorzystaniem biologicznie istotnego modelu komórkowego, co wspiera wczesną identyfikację zagrożeń w programach monitoringu środowiska. Dzięki dostarczeniu ilościowych odczytów impedancji w ciągu godziny, system ten ułatwia terminowe podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu procesu w ramach ocen bezpieczeństwa wody, zmniejszając zależność od wolniejszych metod laboratoryjnych. Kompatybilność systemu z biochipami gotowymi do użycia i przechowywanymi w niskich temperaturach zwiększa elastyczność operacyjną w zdecentralizowanych punktach testowych, w tym w ramach wojskowego i miejskiego nadzoru nad wodą.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną ocenę odpowiedzi komórkowych na toksykanty, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku związków o potencjalnych efektach poza celem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny, ilościowy odczyt zmian w adhezji komórek do podłoża, co pozwala na obiektywne porównanie warunków badawczych i kontrolnych.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezetykietowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym, które odzwierciedlają efekty cytotoksyczne dla szerokiego spektrum substancji chemicznych organicznych i nieorganicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez zautomatyzowane porównanie statystyczne kanałów kontrolnych i testowych, co minimalizuje zmienność zależną od użytkownika.
- Wartość naukowa: Wykorzystuje dobrze scharakteryzowaną linię komórek nabłonkowych (RTgill-W1) do modelowania funkcji barierowej, co jest istotne dla przewidywania uszkodzeń tkanek indukowanych przez związki chemiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy wyniki badań in vitro z zastosowaniami w obszarze zdrowia środowiskowego poprzez wykrywanie toksyczności w stężeniach odpowiadających ekspozycji ludzi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybką segregację próbek, pozwalając na przeprowadzenie dalszych analiz chemicznych wyłącznie w przypadku wyników presumptywnie dodatnich, co zwiększa wydajność pracy.
- Wartość naukowa: Wspiera pewność predykcyjną w badaniach przesiewowych zagrożeń poprzez korelację zmian impedancji z ekspozycją na znane toksykanty.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków jako narzędzie do funkcjonalnego screeningu cytotoksyczności, stosowane po syntezie związków, a przed szczegółowym profilowaniem mechanistycznym, w celu priorytetyzacji związków na podstawie ich aktywności biologicznej.
- Biologia odkrywcza: Pomiar impedancji jako funkcjonalny odczyt integralności komórkowej, wspierający testowanie hipotez dotyczących zaburzeń błony lub adhezji indukowanych przez związki chemiczne.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki odpowiednie do średnioprzepustowego przesiewu bibliotek chemicznych lub próbek środowiskowych.
- Analityka: Generuje szeregi czasowe danych impedancji analizowane przez automatyczne oprogramowanie w celu wykrycia statystycznie istotnych odchyleń od kontroli, co umożliwia obiektywną ocenę kontaminacji.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi komórkowe z oceną ryzyka środowiskowego, wspierając ciągłość przejścia od przesiewu laboratoryjnego do monitoringu terenowego.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Biochipy mogą być produkowane w partiach, przechowywane przez długi czas i wdrażane na żądanie, co wspiera wykorzystanie platformy wielokrotnego użytku w wielu kampaniach testowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia wgląd w mechanizmy dysfunkcji komórkowej indukowanej związkami chemicznymi poprzez śledzenie impedancji w czasie rzeczywistym, co zmniejsza niejednoznaczność w profilowaniu wczesnej toksyczności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu dozowaniu płynów, zautomatyzowanej analizie i minimalnemu nakładowi pracy ręcznej podczas testowania.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza ramy czasowe wykrywania zagrożeń, umożliwiając szybszą interwencję i ograniczając potencjalne ryzyko ekspozycji w programach bezpieczeństwa wody.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację opartą na ryzyku poprzez szybką identyfikację próbek wymagających dalszych badań, co optymalizuje alokację zasobów w monitoringu środowiska.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych w celu utrzymania i wysiewania monowarstw RTgill-W1, aby zapewnić spójną funkcję barierową.
- Metoda jest zależna od instrumentacji kompatybilnej z systemem ECIS oraz systemów obsługi płynów w celu precyzyjnego dostarczania próbek i pomiaru impedancji.
- Konieczne jest ujednolicone przeszkolenie w zakresie aseptycznego przygotowania biochipów i iniekcji próbek, aby zachować integralność testu niezależnie od użytkownika.
- Należy uwzględnić konieczność przechowywania w łańcuchu chłodniczym (6°C) w celu zachowania żywotności biochipów, co ogranicza możliwość zastosowania w warunkach bez dostępu do chłodzenia.
- Ograniczona czułość na pestycydy hamujące cholineasterazę może wymagać zastosowania metod ortogonalnych w celu kompleksowego screeningu pestycydów, zgodnie z informacjami w źródle.
