Name: Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii. Wykorzystuje się analizę fenotypową, immunohistochemię i mikroskopię elektronową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Matthew Kelley, Tizianie Cogliati, Jessice Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivce Levron, Violi Kretschmer i Zoe Mann za ich krytyczną ocenę manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Sofję Kovalevskaya Award (Fundacja Humbodlt) oraz Uniwersytet Johannesa-Gutenberga w Moguncji w Niemczech.

<ol><li>Waters, A. M., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%3A+an+expanding+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies: an expanding disease spectrum.</a> Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1, 7(2012).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Ezan, J., Montcouquiol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+planar+cell+polarity+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting planar cell polarity in the inner ear.</a> Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).</li>
<li>Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Noncanonical+Wnt+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways.</a> Cell. 131, 1378(2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37, 980-985 (2005).</li>
<li>Montcouquiol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Vangl2+and+Scrb1+as+planar+polarity+genes+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals.</a> Nature. 423, 173-177 (2003).</li>
<li>May-Simera, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+Bbs8+and+Ift20+promote+planar+cell+polarity+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea.</a> Development. 142, 555-566 (2015).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nat Genet. 40, 69-77 (2008).</li>
<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hearing research. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+hair+bundle+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the hair bundle and mechanotransduction.</a> The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+deveoping+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse.</a> J. Neurocytol. , 821-835 (1999).</li>
<li>Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinocilium+of+auditory+hair+cells+and+evidence+for+its+morphogenetic+role+during+the+regeneration+of+stereocilia+and+cuticular+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates.</a> Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+developing+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse.</a> Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).</li>
<li>van Dam, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SYSCILIA+gold+standard+%28SCGSv1%29+of+known+ciliary+components+and+its+applications+within+a+systems+biology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium.</a> Cilia. 2, 7(2013).</li>
<li>Blacque, O. E., Sanders, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+within+a+compartment%3A+what+C.+elegans+can+tell+us+about+ciliary+subdomain+composition%2C+biogenesis%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease.</a> Organogenesis. 10, 126-137 (2014).</li>
<li>Wallingford, J. B., Mitchell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strange+as+it+may+seem%3A+the+many+links+between+Wnt+signaling%2C+planar+cell+polarity%2C+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia.</a> Genes & development. 25, 201-213 (2011).</li>
<li>Borovina, A., Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFT88+plays+a+cilia-+and+PCP-independent+role+in+controlling+oriented+cell+divisions+during+vertebrate+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development.</a> Cell reports. 5, 37-43 (2013).</li>
<li>Huang, P., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dampened+Hedgehog+signaling+but+normal+Wnt+signaling+in+zebrafish+without+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia.</a> Development. 136, 3089-3098 (2009).</li>
<li>Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+not+required+for+normal+canonical+Wnt+signaling+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo.</a> PloS one. 4, e6839(2009).</li>
<li>Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%3A+preparation+and+imaging+for+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM.</a> Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Celsr1+disrupts+planar+polarity+of+inner+ear+hair+cells+and+causes+severe+neural+tube+defects+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse.</a> Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Frizzled3+and+Frizzled6+in+neural+tube+closure+and+in+the+planar+polarity+of+inner-ear+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).</li>
<li>Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+planar+polarity+proteins+in+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).</li>
<li>May-Simera, H., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+planar+cell+polarity+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).</li>
<li>Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+phenotypes+between+different+vangl2+mutants+demonstrates+dominant+effects+of+the+Looptail+mutation+during+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development.</a> PloS one. 7, e31988(2012).</li>
<li>Rachel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Cep290+and+Mkks+ciliopathy+alleles+in+mice+rescues+sensory+defects+and+restores+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis.</a> J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).</li>
<li>Jagger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+Syndrome+protein+ALMS1+localizes+to+basal+bodies+of+cochlear+hair+cells+and+regulates+cilium-dependent+planar+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity.</a> Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).</li>
<li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alstrom+Syndrome+Protein%2C+ALMS1%2C+Interacts+with+alpha-Actinin+and+Components+of+the+Endosome+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway.</a> PloS one. 7, e37925(2012).</li>
<li>Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+refinement+of+auditory+hair+cell+planar+polarity+deficits+occurs+in+the+absence+of+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).</li>
<li>Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usher+syndrome+protein+network+functions+in+the+retina+and+their+relation+to+other+retinal+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies.</a> Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).</li>
<li>Hebert, J. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cre+to+the+Foxg1+%28BF-1%29+locus+mediates+loxP+recombination+in+the+telencephalon+and+other+developing+head+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures.</a> Dev Biol. 222, 296-306 (2000).</li>
<li>Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Measurement+of+the+auditory+brainstem+response+%28ABR%29+to+study+auditory+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).</li>
<li>Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Assessment+of+cochlear+function+in+mice%3A+distortion-product+otoacoustic+emissions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).</li>
<li>Finetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+required+for+polarized+recycling+of+the+TCR%2FCD3+complex+to+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse.</a> Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).</li>
<li>Sedmak, T., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+molecules+in+ciliary+and+nonciliary+cells+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina.</a> J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons%3A+ciliary+proteins+reach+beyond+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia.</a> Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).</li>
<li>Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+blueprint+at+the+apical+surface+establishes+planar+asymmetry+in+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells.</a> Developmental cell. 27, 88-102 (2013).</li>
<li>Ezan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+migration+depends+on+G-protein+signalling+control+of+subapical+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton.</a> Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Przygotowując tkankę ślimaka do analizy, należy pamiętać o kilku kluczowych kwestiach. Po pierwsze, różnice w tle genetycznym mogą modyfikować fenotyp ślimaka, co sprawia, że konieczne jest analizowanie i porównywanie tylko kontroli z miotu. Po drugie, całkowite usunięcie błony tektorialnej jest wymagane w celu uzyskania najlepszych obrazów za pomocą immunohistochemii i jest niezbędne dla SEM. Błona tektorialna jest nieprzezroczystą strukturą i może zasłaniać komórki nabłonka czuciowego bezpośrednio pod nią, co utrudnia ...

Pierwotne rzęski to długie, oparte na mikrotubulach wyrostki, które wystają z powierzchni większości komórek ssaków. Rzęski pierwotne są często mylone z rzęskami ruchliwymi, których zawsze jest wiele na komórkę i których celem jest przemieszczanie płynu po powierzchniach błony. Z kolei rzęski pierwotne przyjmują role sensoryczne i w związku z tym są również określane jako rzęski czuciowe. Niegdyś dawno zapomniane, organelle te zostały niedawno "ponownie odkryte" w wyniku ich związku z wieloma chorobami genetycznymi człowieka1. Wykazano, że pierwotna rzęska, idealnie umieszczona jako organella sygnałowa, reguluje liczne szlaki sygnałowe, z których wiele jest ważnych nie tylko w homeostazie tkanek i chorobie, ale także podczas rozwoju2.
Jednym z pierwszych szlaków sygnałowych, które okazały się być związane z dysfunkcją rzęsek, był niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt, znany również jako szlak biegunowości komórek planarnych (PCP)3. Ta kaskada sygnalizacyjna początkowo zidentyfikowana u Drosophila ma kluczowe znaczenie dla embriogenezy; W szczególności dla procesów konwergencji i wydłużenia oraz dla prawidłowej orientacji komórek w płaszczyźnie nabłonka4. Sekwencyjna sygnalizacja rdzeniowego zestawu białek regulatorowych tłumaczy sygnały kierunkowe, które ostatecznie prowadzą do przegrupowań cytoszkieletu i skutkują skoordynowaną polaryzacją komórek nabłonka w płaszczyźnie5. Proces konwergencji i wydłużania jest absolutnie konieczny do wydłużenia przewodu ślimakowego i prawidłowego wzorca komórkowego6. Ponieważ jest to regulowane poprzez aktywację szlaku PCP, jednym z najbardziej uderzających fenotypów mutantów PCP ślimaka jest skrócony przewód ślimakowy ze zdezorganizowanym nabłonkiem czuciowym7. Podobnie mutanty myszy, które nie mają rzęsek, również wykazują taki fenotyp konwergencji i rozszerzenia8,9, chociaż dokładnie, w jaki sposób jest to regulowane, pozostaje do wyjaśnienia.
Ponieważ procesy konwergencji i rozszerzania są kluczowe dla rozwoju przewodu ślimakowego i komórkowego wzorca nabłonka czuciowego w przewodzie ślimakowym, rozwijający się ślimak jest idealnym organem do badania sygnalizacji PCP podczas rozwoju kręgowców. Narząd Cortiego, termin nadany wyspecjalizowanemu nabłonkowi czuciowemu wyściełającemu przewód ślimakowy, składa się z nieczuciowych komórek podporowych i mechanosensorycznych komórek rzęsatych, które muszą być równomiernie zorientowane, aby ślimak mógł funkcjonować10. Mechanosensoryczne komórki rzęsate są tak nazywane ze względu na stereorzęskowe wiązki, które rozciągają się od płytki naskórkowej (powierzchni wierzchołkowej) każdej czuciowej komórki rzęsatej11. Działają one jako główne przetworniki mechanosensacji i pomimo ich nomenklatury jako stereocilia, w rzeczywistości składają się ze zmodyfikowanych mikrokosmków opartych na włóknach aktynowych. Wewnątrz każdej wiązki włosów w kształcie szewronu, trzy rzędy stereocilii są zorganizowane w wysoce uporządkowany i regularny wzór w sposób przypominający schody. Prawdziwe rzęski oparte na mikrotubulach, zwane kinociliami, są wymagane do rozwoju i orientacji wiązek stereorzęskowych12. Na każdej komórce rzęsatej jedno pojedyncze kinocilium jest fizycznie przymocowane do wiązki stereocilia, znajdującej się centralnie w sąsiedztwie najwyższego rzędu stereocilii. Dokładna funkcja kinocilium jest niejasna, a jedna z hipotez mówi, że kinocilium "przyciąga" stereocilia do kształtu, gdy dojrzewają z mikrokosmków12. U kręgowców kinorzęski w ślimaku są obecne tylko przejściowo i wycofują się z komórek rzęsatych u myszy przed pojawieniem się słuchu11,13,14.
Całkowita utrata rzęsek w rozwijającym się ślimaku skutkuje znacznie skróconymi przewodami ślimakowymi, nieprawidłowo uformowanymi i źle zorientowanymi wiązkami stereorzęskowymi, a także nieprawidłowo ustawionymi ciałami podstawnymi8,9. Funkcjonalna rzęska składa się nie tylko z aksonemu rzęskowego. Wiele białek związanych z funkcją rzęsek występuje w kompleksach zlokalizowanych w poddomenach związanych z rzęskami, takich jak ciało podstawne, strefa przejściowa lub aksonem rzęskowy15. Ciało podstawne, pochodzące z macierzystej centrioli centrosomu, jest również centrum organizującym mikrotubule dla mikrotubul rozciągających się od rzęski do ciała komórki i może regulować transport wewnątrzkomórkowy, a także transport rzęskowy. Strefa przejściowa rzęsek to kolejny region, w którym funkcja rzęsek jest regulowana pod względem organizacji importu i eksportu związków rzęskowych16.
Wiele badań zidentyfikowało związek między rzęskami a niekanonicznym Wnt (sygnalizacja PCP), chociaż dokładny mechanizm jest niejasny17. Redundancja genów rzęskowych i PCP oraz wrażliwość polaryzacji komórek na uogólnione nieprawidłowości komórkowe utrudniają bezpośrednie powiązanie mutacji z deficytami specyficznymi dla PCP. Jednym z odczytów sygnalizacji PCP jest umiejscowienie ciała podstawnego i rzęski pierwotnej, dlatego oddzielenie wad pierwotnych od wtórnych jest trudne. Niektóre badania na mutantach danio pręgowanego i myszy sugerują brak związku między rzęskami a sygnalizacją Wnt18-20. Rozbieżności w danych mogą odzwierciedlać zależne od gatunku, tkanki lub czasu różnice w udziale rzęsek w sygnalizacji Wnt. Co więcej, normalna reaktywność Wnt może zostać zachowana, jeśli podstawowe ciała pozostają funkcjonalne. Głębszy wgląd w rolę białek rzęskowych w komórkowych szlakach sygnałowych i innych zjawiskach biologicznych ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia biologii komórkowej i rozwojowej, a także dla opracowania ukierunkowanych strategii leczenia.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia/Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy - Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td>Patrz uwaga 2</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji - proste ostrze</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze (nr 5 i 55) i kleszcze</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny.</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe ze szkła niepowlekanego</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe do mikroskopów (22 mm & razy; 40 mm & razy; 0,15 mm)</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety transferowe</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szpilki Minutien</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki SEM</td><td>tousimis</td><td>8762</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do skaningowej mikroskopii elektronowej</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Zakładki: Klej węglowy</td><td>TED PELLA</td><td>16084-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chusteczki Kimwipe&nbsp;</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>drobne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do pędzli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp; (PFA) (Klasa EM wymagana dla EM)</td><td>Różne</td><td></td><td>Przygotuj 4% roztwór w 1 i razy; PBS za każdym razem świeży. Klasa EM wymagana dla EM.</td></tr><tr><td>2,5% Aldehyd glutarowy Grade1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7,5)</td> <td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>affiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Media montażowe</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>10 razy; Hanksa' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Tetroksynek osmu (OsO4 )</td><td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty Arl13b</td><td>Protein Tech</td><td>17711-1-AP</td><td>Sugerowane stężenie 1:1,000</td></tr><tr><td>anty acetylowana tubulina (611-B1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>Sugerowane stężenie 1:800</td></tr><tr><td>anty gamma tubulina (GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td>Sugerowane stężenie 1:200</td></tr><tr><td>anty Zo_1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>40-2300</td><td>Sugerowane stężenie 1:500</td></tr><tr><td>Myosin VI</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6791</td><td>Sugerowane stężenie 1:1000</td></tr><tr><td>Myosin VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td>Sugerowane stężenie 1:1,000</td></tr><tr><td>anty Vangl2</td><td>Merk Millipore</td><td>ABN373</td><td>Sugerowane stężenie 1:250</td></tr><tr><td>anty G&alpha; i3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4040</td><td>Sugerowane stężenie 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Sugerowane stężenie 1:300 - 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Sugerowane stężenie 1:300 - 1,000</td></tr></tbody></table>

ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

W ostatnich latach, pierwotne rzęski stały się kluczowymi regulatorami rozwoju i choroby, wpływając na liczne szlaki sygnałowe. Jednym z najwcześniejszych szlaków sygnałowych, które okazały się związane z funkcją rzęsek, był niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt, określany również jako sygnalizacja o płaskiej polaryzacji komórek (PCP). Jednym z najlepszych miejsc do badania wpływu sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP) podczas rozwoju kręgowców jest ślimak ssaków. Zakłócenie sygnalizacji PCP w ślimaku myszy zaburza rozrost ślimaka, wzorzec komórkowy i orientację komórek rzęsatych, z których wszystkie są dotknięte dysfunkcją rzęsek. Celem tego protokołu jest opisanie analizy sygnalizacji PCP w rozwijającym się ślimaku ssaków za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej. Wady konwergencji i wydłużenia objawiają się skróceniem przewodu ślimakowego i/lub zmianami we wzorcach komórkowych, które można określić ilościowo po rozbiorze z rozwijających się mutantów myszy. Zmiany w orientacji pęczka stereorzęskowego i długości lub położeniu kinocilii można obserwować i oznaczać ilościowo za pomocą immunofluorescencji lub skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Głębszy wgląd w rolę białek rzęskowych w komórkowych szlakach sygnałowych i innych zjawiskach biologicznych ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia biologii komórkowej i rozwojowej, a także dla opracowania ukierunkowanych strategii leczenia.

Disekcja ślimaka i przygotowanie tkanki
Po usunięciu mózgu, w następstwie cięcia strzałkowego w linii środkowej głowy myszy P0, można zwizualizować (Rysunek 1A, biała strzałka) i usunąć błędnik kostny widoczny od tyłu. Rysunek 1B przedstawia wyizolowane błędniki kostne z komórkami rzęsistymi ślimaka skierowanymi do góry, w widoku brzuszno-strronnym (lewo) oraz grzbietowym, od ty...

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest badanie ślimaka u myszy z mutacją rzęsek w celu wykrycia fenotypów polarności komórkowej w płaszczyźnie (PCP). Techniki te pozwalają na szczegółowe opisanie fenotypu ślimaka, co doprowadzi do dokładniejszego zrozumienia roli rzęsek w ustanawianiu sygnalizacji PCP u kręgowców. Główną zaletą tego protokołu jest fakt, że po opanowaniu metody wypreparowane nabłonki ślimaka mogą być wykorzystane do różnych rodzajów analiz fenotypowych.Po przygotowaniu odczynników i tkanek od zwierząt doświadczalnych w stadium rozwojowym od E16.5 do p3, należy użyć ostrza skalpela lub małych nożyczek, aby rozciąć głowę wzdłuż linii pośrodkowej strzałkowej, zaczynając od nosa i kończąc na potylicy. Za pomocą pęsety należy wyjąć mózg z każdej połowy czaszki. Następnie należy zidentyfikować kości skroniowe, w których znajdują się rozwijające się kostne labirynty ucha wewnętrznego.Podczas pracy z próbką pod mikroskopem stereoskopowym, należy użyć pęsety, aby oddzielić błędniki kostne od czaszki, delikatnie przesuwając pęsetę pod nimi. Po sekcji, za pomocą końcówki pęsety sekcyjnej, należy oczyścić okno owalne i okno okrągłe oraz wykonać niewielki otwór w wierzchołku spirali ślimaka. Następnie błędniki kostne należy utrwalić w 1.5 milliliters 4%paraformaldehyde przez pięć minut w lodzie, aby umożliwić łatwe usunięcie błony tectorial.Teraz należy umieścić labirynty kostne w czarnej szalce sekcyjnej powleczonej elastomerem silikonowym z PBS, aby ułatwić sekcję. Używając pęsety numer pięć, należy usunąć chrząstkę zewnętrzną, odsłaniając kanalik ślimaka. Rozpoczynając od okna owalnego, należy wsunąć końcówkę pęsety do okna owalnego i delikatnie podważyć chrząstkę, powoli przesuwając się w górę w kierunku wierzchołka.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć błonę Reissnera u podstawy przewodu ślimaka i oderwij ją ruchem ku górze. Zwizualizuj grzbietową stronę przewodu ślimaka, w tym nabłonek sensoryczny. Następnie użyj pęsety nr 55, aby chwycić błonę otorectorialną u podstawy ślimaka i oderwać ją, przesuwając się w górę w kierunku wierzchołka.Całkowite usunięcie błony tectorial jest niezbędne do uzyskania najlepszych obrazów w immunohistochemii oraz jest kluczowe dla skaningowej mikroskopii elektronowej. Po odsłonięciu narządu Cortiego należy dodatkowo utrwalić tkankę i przeprowadzić immunohistochemię lub przygotować próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej, zgodnie ze szczegółowym opisem w części pisemnej protokołu. Po zabarwieniu tkanki należy umieścić próbkę w czarnej naczyniu z elastomeru silikonowego zawierającym PBS.Za pomocą pęsety precyzyjnej usuń obszar przedsionka ze spirali ślimaka. Następnie bardzo ostrożnie usuń leżącą poniżej chrząstkę oraz mezenchym ze spirali ślimaka. Pozostała spirala ślimaka zawiera bruzdę wewnętrzną, organ Cortiego oraz bruzdę zewnętrzną.Przenieś spiralę ślimaka do kropli PBS umieszczonej na szkiełku mikroskopowym. Odsącz PBS za pomocą chłonnej chusteczki lub kawałka papieru filtracyjnego i delikatnie popraw położenie spirali ślimaka, jeśli nabłonek przesunął się i nałożył na siebie. Dodaj kroplę medium montażowego bezpośrednio na próbkę ślimaka, a następnie ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkę bezpośrednio na próbkę, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.Należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem, wyposażonego w obiektywy o dużym powiększeniu i wysokiej aperturze numerycznej, aby zarejestrować obrazy powierzchni apikalnej komórki rzęskowej ślimaka. Do wykonania nakładających się obrazów spirali ślimaka w celu określenia długości przewodu ślimaka należy użyć obiektywów o mniejszym powiększeniu. Poniższe obrazy przedstawiają barwienie immunofluorescencyjne podstawowego zwoju ślimaka w pierwszym dniu po urodzeniu.Faloidyna znakuje aktynę filamentową w stereociliach oraz aktynę kortikalną na obwodzie komórki. Miozyna VIIA jest markerem wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęskowych. ZO_1 znakuje połączenia ścisłe pomiędzy komórkami, co czyni go doskonałym markerem do rozróżniania granic komórek.Acetylowana alfa-tubulina jest wykorzystywana jako marker kinocilium w wierzchołku wiązki, co wskazuje biała strzałka. Acetylowana alfa-tubulina znakuje również wewnętrzne mikrotubule, które występują w szczególnej obfitości w komórkach filarowych, co wskazują białe gwiazdki. Ten obraz wypreparowanych przewodów ślimakowych w stadium E18.5, barwionych na acetylowaną tubulinę, wykazuje wyraźne skrócenie przewodów ślimakowych u warunkowych knockoutów IFT20 w porównaniu z grupą kontrolną.Poniższy obraz przedstawia preparat całego fragmentu podstawowego zwoju ślimaka u myszy z nokautem genu BBS8 w zerowym dniu po urodzeniu. Pęczki stereocyli w ślimakach z nokautem BBS8 są w różnym stopniu obrócone, co wskazuje prawa strzałka, lub spłaszczone i nieprawidłowo zlokalizowane, co wskazuje środkowa strzałka. Kinocylia są nieprawidłowo zlokalizowane lub aksonemy są nieobecne, co wskazuje lewa strzałka.Podczas przygotowywania fenotypu ślimaka do analizy należy pamiętać, że różnice w tle genetycznym mogą modyfikować ten fenotyp. Dlatego do analizy istotne jest wykorzystanie kontroli z tego samego miotu. Dalsze analizy obejmują badania audiometryczne oraz hodowlę eksplantów ślimaka, co umożliwia zastosowanie różnych aktywatorów lub inhibitorów sygnalizacji, przyczyniając się tym samym do zrozumienia mechanizmów procesów rozwojowych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować tkankę ślimaka do analizy roli składników rzęsek oraz ich odrębnego wpływu na sygnalizację PCP.

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem umożliwiającym izolację i badanie specyficznych populacji komórek. Niniejszy protokół opisuje etapy izolacji komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ślimaka noworodków myszy transgenicznych. Przed rozdzieleniem metodą cytometrii przepływowej, zdysocjowane komórki ślimaka zostały znakowane przy użyciu substratów β-galaktozydazy sprzężonych z fluorochromami.

Izolacja komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przedstawiamy protokół izolowania pęcherza słuchowego, torebki i kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia całego wierzchowca i analizy histologicznej.

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

Trójwymiarowe organotypowe hodowle mysiej łagiewki i ślimaka w optycznie czystych żelach kolagenowych I zachowują wrodzoną morfologię tkanek, pozwalają na mechaniczną stymulację poprzez dostosowanie sztywności matrycy i umożliwiają dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa.

Trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

To badanie opisuje, jak rozciąć worek endolimfatyczny z wewnętrznego ucha myszy w różnym wieku. Wynik podobnej sekcji pokazano w mysim modelu powiększenia worka endolimfatycznego Slc26a4-zero. Transgeniczna mysz z fluorescencyjnym reporterem wyrażonym w woreczku endolimficznym jest prezentowana jako model do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego i narzędzie edukacyjne.

Wypreparowanie worka endolimfatycznego od myszy

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Poznaj metodę oceny fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii. Wykorzystuje się analizę fenotypową, immunohistochemię i mikroskopię elektronową.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Przeglądaj więcej filmów