Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie ślimaka myszy z mutacją rzęsek pod kątem fenotypów polaryzacji komórek płaskich. Techniki te pozwalają na obszerne uszczegółowienie fenotypu ślimaka, co doprowadzi do dokładniejszego zrozumienia udziału rzęsek w ustanawianiu sygnalizacji PCP u kręgowców. Główną zaletą tego protokołu jest to, że po opanowaniu, wypreparowany nabłonek ślimaka może być wykorzystany do wielu różnych rodzajów analizy fenotypowej.

Po przygotowaniu odczynników i tkanek pochodzących od zwierząt doświadczalnych, w stadium rozwojowym od E16.5 do p3, użyj ostrza skalpela lub małej pary nożyczek, aby wypreparować głowę wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od nosa i przedłużając liścienie. Usuń mózg z każdej połowy czaszki za pomocą kleszczy. Następnie zidentyfikuj kości skroniowe, które zawierają rozwijające się błędniki kostne ucha wewnętrznego.

Podczas pracy z próbką pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby odciąć kostne labirynty od czaszki, delikatnie przesuwając kleszcze pod kostnymi labiryntami. Po rozbiorze użyj końcówki kleszczy preparacyjnych, aby oczyścić owalne i okrągłe okna i zrobić mały otwór w wierzchołku spirali ślimakowej. Następnie umocuj kostne labirynty w 1,5 mililitra 4% paraformaldehydu przez pięć minut na lodzie, aby umożliwić łatwe usunięcie membrany tektorialnej.

Teraz umieść kostne labirynty w czarnym naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym zawierającym PBS, aby ułatwić sekcję. Użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć zewnętrzną chrząstkę, odsłaniając przewód ślimakowy. Zacznij od owalnego okienka, włóż dolną końcówkę kleszczyków do owalnego okienka i delikatnie podważ chrząstkę, powoli przesuwając się w górę w kierunku wierzchołka.

Następnie użyj cienkiej pary kleszczy, aby ścisnąć błonę Reissnera u podstawy przewodu ślimakowego i oderwij ją ruchem w górę. Wizualizuj grzbietowy aspekt przewodu ślimakowego, w tym nabłonek czuciowy. Następnie użyj kleszczyków numer 55, aby uszczypnąć błonę tektorialną u podstawy ślimaka i oderwać w górę w kierunku wierzchołka.

Całkowite usunięcie błony tektorialnej jest wymagane do uzyskania najlepszych obrazów immunohistochemicznych i jest niezbędne w skaningowej mikroskopii elektronowej. Po naświetleniu narządu Cortiego należy następnie utrwalić tkankę i przeprowadzić immunohistochemię lub przygotować się do skaningowej mikroskopii elektronowej, jak opisano w pisemnej części protokołu. Po wybarwieniu tkanki umieścić próbkę w czarnym naczyniu z elastomeru silikonowego, zawierającym PBS.

Za pomocą cienkich kleszczy usuń obszar przedsionkowy ze spirali ślimakowej. Następnie bardzo ostrożnie usuń leżącą pod spodem chrząstkę i mezenchymę ze spirali ślimakowej. Pozostała spirala ślimakowa zawiera bruzdę wewnętrzną, narząd Cortiego i bruzdę zewnętrzną.

Przenieś spiralę ślimakową do kropli PBS umieszczonej na szkiełku mikroskopowym. Odsunąć PBS za pomocą chłonnej chusteczki lub kawałka bibuły filtracyjnej i delikatnie ponownie ułożyć spiralę ślimakową, jeśli nabłonek przesunął się i zachodzi na siebie. Dodać kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na próbkę ślimaka i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe bezpośrednio na próbkę, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Użyj epifluorescencyjnego lub laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej, aby uchwycić obrazy wierzchołkowej powierzchni komórki rzęsatej ślimaka. Użyj dolnych obiektywów, aby wykonać nakładające się obrazy spirali ślimakowej w celu ilościowego określenia długości przewodu ślimakowego. Poniższe obrazy przedstawiają barwienie immunofluorescencyjne ślimaka podstawnego, po urodzeniu pierwszego dnia.

Faloidyna znakuje aktynę nitkowatą w stereorzęskach i aktynę korową na obrzeżach komórki. Miozyna VIIA jest markerem wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych. ZO_1 oznacza ścisłe połączenia między komórkami, dzięki czemu jest doskonałym markerem do rozróżniania granic komórek.

Acetylowana alfa-tubulina jest używana jako marker kinocilium na wierzchołku wiązki, jak wskazuje biała strzałka. Mikrotubule wewnętrzne są również oznaczone acetylowaną alfa-tubuliną, która jest szczególnie obfita w komórkach filarowych, na co wskazują białe gwiazdki. Ten obraz wypreparowanych przewodów ślimakowych w E18,5, barwionych acetylowaną tubuliną, pokazuje wyraźne skrócenie przewodów ślimakowych z warunkowym nokautem IFT20 w porównaniu z kontrolą.

Poniższy obraz przedstawia całościowe przygotowanie podstawowego skrętu ślimaka u myszy z nokautem BBS8 w dniu zero po urodzeniu. Pęczki stereorzęskowe w ślimakach z nokautem BBS8 są zmiennie obracane, jak wskazuje strzałka w prawo, lub spłaszczone i błędnie zlokalizowane, jak wskazano strzałką środkową. Kinocilia są nieprawidłowo zlokalizowane lub brakuje aksonemów, jak wskazuje strzałka w lewo.

Przygotowując fenotyp ślimaka do analizy, należy pamiętać, że różnice w tle genetycznym mogą modyfikować fenotyp ślimaka. Dlatego ważne jest, aby do analizy używać kontrolek z rodzeństwem z miotu. Dalsze analizy obejmują badania audiometryczne i hodowlę eksplantatów ślimakowych, co pozwala na leczenie różnymi aktywatorami lub inhibitorami sygnalizacji, przyczyniając się w ten sposób do mechanistycznego zrozumienia procesów rozwojowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować tkankę ślimaka do analizy roli składników rzęskowych i ich wyraźnego wpływu na sygnalizację PCP.