Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Ogólnym celem całej tej metody preparacji wierzchowca jest wyizolowanie obszaru czuciowego zwapniałego dorosłego ślimaka jako trzech nienaruszonych zwojów: wierzchołka, środka i podstawy. Ta metoda preparacji zachowuje trójwymiarową strukturę narządu Cortiego i umożliwia wizualizację wszystkich komórek w połączeniu z barwieniem immunologicznym i mikroskopią konfokalną w celu zobrazowania w różnych płaszczyznach osi Z. W porównaniu z poprzednimi metodami preparacji stosujemy inną strategię, która generuje trzy zwoje ślimaka, które są większe i mniej prawdopodobne, że zostaną utracone lub uszkodzone w procesie barwienia immunologicznego.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sekcja jest trudna do nauczenia. Ponieważ narząd Cortiego jest delikatny, istnieje niewielki margines błędu podczas usuwania więzadła spiralnego. Po eutanazji zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami i usunięciu mózgu, zacznij od zidentyfikowania kości skroniowych w podstawie czaszki myszy.

Następnie zeskrob nerwy czaszkowe za pomocą standardowych kleszczy. Umieść kleszcze na końcu torebki usznej i użyj kciuka przeciwnej ręki, aby docisnąć tylny kanał półkolisty, aby usunąć zamknięty ślimak. Uwolnij dolną połowę kości skroniowej od czaszki ręcznie kciukiem i palcem wskazującym lub za pomocą cienkich nożyczek o długości 10,5 centymetra i umieść w mikroskopii elektronowej wolnej od metanolu klasy 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia.

Po utrwaleniu należy odwapnić kości skroniowe zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu. Aby ustalić, czy próbka jest odpowiednio odwapniona, umieść kości skroniowe na naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym i delikatnie dociśnij kleszcze do ślimaka w kształcie ślimaka. Jeśli tkanka jest gąbczasta, odwapnienie jest zakończone.

Dodaj PBS do naczynia preparacyjnego, a następnie podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy numer cztery lub pięć, aby przytrzymać kość skroniową w okolicy przedsionkowej i pięciomililitrowych nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen, aby odciąć nadmiar tkanki torebki usznej wzdłuż boków i powyżej wierzchołka. Za pomocą 2,5-mililitrowych nożyczek sprężynowych Vannas włóż jedno ostrze do owalnego okienka i wykonaj kilka małych nacięć wzdłuż spiralnego więzadła podstawy. Teraz włóż jedno ostrze pięciomililitrowych nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen do właśnie wyciętego obszaru, a drugie ostrze umieść na zewnątrz kości skroniowej, przyśrodkowo do owalnego okienka.

To cięcie oddziela zwój podstawowy od zwojów środkowych i wierzchołkowych. Następnie, aby zakończyć sekcję zwoju podstawy, użyj 2,5-mililitrowych nożyczek sprężynowych, aby przeciąć spiralne włókna nerwowe zwoju, które łączą się z modiolusem, aby uwolnić napięcie w zwoju podstawowym. Wytnij poniżej podstawowego zwoju, aby oddzielić od narządów przedsionkowych.

Użyj kleszczyków, aby poprowadzić tkankę i przypiąć spiralne włókna zwojowe do naczynia pokrytego elastomerem silikonowym. Wykonaj serię małych nacięć, aby usunąć więzadło spiralne zarówno z góry, jak i poniżej narządu Cortiego. Z włóknami spiralnego zwoju przypiętymi do naczynia pokrytego elastomerem silikonowym, użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą błonę Reissnera z narządu Cortiego.

Wykonaj kilka nacięć, aby zmniejszyć grubość aksonów spiralnych zwojów. Następnie chwyć pozostałe aksony spiralnego zwoju kleszczami i przenieś wypreparowany zwój podstawowy na 48-dołkową płytkę zawierającą około 500 mikrolitrów PBS. Teraz oddziel środkowy i wierzchołkowy zwój, kładąc najpierw pozostałe dwie trzecie wierzchołka ślimaka stroną do dołu.

Następnie włóż jedno ostrze nożyczek o pojemności 2,5 mililitra do podłoża scala, w którym środkowy obrót był wcześniej połączony ze zwojem podstawowym, i wykonaj kilka nacięć wzdłuż spiralnego więzadła środkowego zwoju. Za pomocą pięciomililitrowych nożyczek włóż jedno ostrze do obszaru cięcia, tak aby środkowy obrót znajdował się na górze ostrza. Umieść drugie ostrze na zewnątrz kostnego labiryntu, pod kątem 90 stopni od wierzchołkowego końca.

To cięcie oddziela zwój środkowy od zwoju wierzchołkowego. Następnie zakończ sekcję środkowego zwoju, usuwając więzadło spiralne z narządu Cortiego. Przenieś wypreparowany zwój na płytkę 48-dołkową, jak poprzednio.

Teraz użyj 2,5-mililitrowych nożyczek sprężynowych Vannas, aby otworzyć nasadkę zakrywającą skręt wierzchołkowy i powtórz procedurę, aby usunąć więzadło spiralne wierzchołkowe z narządu Cortiego. Przenieś wypreparowany zwój na płytkę 48-dołkową, jak poprzednio. Aby rozpocząć procedurę barwienia immunologicznego, najpierw odessać PBS z każdej studzienki, a następnie zastąpić 200 do 300 mikrolitrami roztworu blokującego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D.

Po upływie czasu inkubacji usunąć roztwór blokujący i zastąpić go 100 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego, odpowiednio rozcieńczonego w roztworze nośnika. Inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze 3D. Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyj każdą studzienkę 500 mikrolitrami PBS przez co najmniej pięć minut za każdym razem, w temperaturze pokojowej.

Powtórz pranie dwa razy. Po ostatnim praniu należy zassać PBS i uważać, aby nie zassać wypreparowanego zwoju końcówki pipety. Zastąp 100 mikrolitrami na studzienkę fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze nośnika.

Umieść 48-dołkową płytkę w czarnym pudełku w celu ochrony przed światłem i umieść na rotatorze 3D w celu inkubacji przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć trzykrotnie PBS, tak jak poprzednio. Po usunięciu ostatniego płukania dodać 100 mikrolitrów Hoechst do oznaczonych jąder.

Chronić przed światłem i inkubować przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. Na koniec usunąć roztwór Hoechst i przemyć trzykrotnie PBS, tak jak poprzednio. Po oznaczeniu każdego szkiełka należy odpipetować 50 mikrolitrów podłoża montażowego na każde szkiełko.

Następnie, używając prostych kleszczy jubilerskich numer cztery lub pięć, chwyć aksony spiralnego zwoju i delikatnie przenieś jeden obrót ślimaka z płytki 48-dołkowej na podłoże montażowe. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że wypreparowany zwój nie jest zagięty ani skręcony. Umieść jeden koniec szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i delikatnie zwolnij, aby szkiełko nakrywkowe spadło.

Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że skręt ślimaka nie znajduje się w pobliżu pęcherzyka powietrza. W takim przypadku delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe do przodu i do tyłu, aby zmienić położenie zwoju ślimaka. Powtórz procedurę dla pozostałych zwojów ślimaka.

Zamontuj jeden obrót ślimaka na szkiełko, aby zapobiec ekspozycji na światło i wybielaniu zdjęć podczas procesu obrazowania. Umieść slajdy w folderze slajdów tak, aby leżały płasko. Chronić przed światłem i pozostawić media montażowe do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze pokojowej lub 20 stopniach Celsjusza do momentu zobrazowania. Ten obraz wycinka konfokalnego pokazuje środkowy skręt ślimaka odizolowany od myszy p15. Obrazy 420X zostały nałożone, aby zrekonstruować cały środkowy zakręt.

Komórki rzęsate, znakowane pierwszorzędowym przeciwciałem anty-miozyny królika VIIa i sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym Alexa 647, wydają się purpurowe. Komórki podporowe, oznaczone kozim przeciwciałem pierwszorzędowym anty-SOX2 i sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym Alexa 568, są zielone na zielono. Jądra stają się niebieskie z powodu barwienia Hoechsta.

Pasek skali reprezentuje 100 mikronów. To zdjęcie przedstawia przekrój optyczny środkowego zwoju odizolowany od sześciotygodniowej myszy w płaszczyźnie X, Z. Ponownie, komórki rzęsate są znakowane magentowym fluoroforem, a komórki podporowe fluoroforem, który wydaje się zielony.

Jest to powiększenie poprzedniego obrazu, z usuniętym celownikiem. Pasek skali reprezentuje 20 mikronów. Poniższe cztery ilustracje pokazują niektóre z problemów, które mogą wystąpić podczas całego rozwarstwiania mocowania lub podczas montażu ślimaka włączającego suwaki.

Tutaj, po lewej stronie obrazu, tkanka ślimaka została przecięta obok ostatniego rzędu zewnętrznych komórek rzęsatych, co spowodowało, że wiele z tych komórek zostało zamontowanych pod różnymi kątami. Na tym zdjęciu fragment narządu Cortiego po lewej stronie został odcięty. W zewnętrznym obszarze komórki rzęsatej pośrodku obrazu znajduje się otwór

Tutaj organy Cortiego są złożone w kilku miejscach. Po opanowaniu całej techniki preparacji wierzchowca można ukończyć w ciągu 20 do 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać umieszczania kleszczy na narządzie Cortiego oraz unikać ciągnięcia lub chwytania więzadła spiralnego.

Zamiast tego zamknij kleszcze i przypnij spiralne włókna zwojowe do naczynia pokrytego elastomerem silikonowym. Próbki od myszy w wieku od jednego do trzech tygodni są bardziej wyrozumiałe i przydatne do nauki metody sekcji. Ponadto próbki z uszkodzonymi komórkami rzęsatymi są trudniejsze do wypreparowania, a tkanki narażone na hałas są szczególnie trudne i delikatne.

Po tej procedurze preparacji można wykonać inne metody, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa. Potrzebny jest jednak inny utrwalacz. Ponadto wprowadziliśmy niewielkie modyfikacje do tego protokołu dotyczącego sekcji tkanki ślimaka szczura, a w przyszłości mamy nadzieję na dalsze modyfikacje w zakresie sekcji ślimaka od szynszyli, myszoskoczka i świnki morskiej.