Name: Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwienia całej góry i immunofluorescencji dorosłej ślimaka myszy. Technika izoluje trzy nienaruszone zwoje ślimaka, zachowując strukturę trójwymiarową organu Cortiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant z Biura Badań Marynarki Wojennej (N000141310569). Sprzęt Ośrodka Obrazowania Badawczego Southern Illinois University School of Medicine był wspierany przez National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Southern Illinois University School of Medicine.
1. Ekstrakcja kości skroniowych
<ol>
	<li>Zidentyfikuj kości skroniowe u podstawy czaszki myszy13 i zeskrob nerwy czaszkowe za pomocą kleszczy o standardowym wzorze.</li>
	<li>Umieść kleszcze o standardowym wzorze na końcu torebki usznej i kciukiem przeciwnej ręki naciśnij tylny kanał półkolisty, aby usunąć zamknięty ślimak.</li>
	<li>Uwolnij dolną połowę kości skroniowej od czaszki ręcznie kciukiem i palcem wskazującym lub za pomocą cienkich nożyczek o długości 10,5 cm.</li>
</ol>
2. Kości skroniowe po naprawie
<ol>
	<li>Umieścić kości skroniowe w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml zawierających 250 - 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w 10 mM buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 - 20 godz. 
	UWAGA: Nie jest konieczne otwieranie wierzchołkowej pokrywy ani wstrzykiwanie PFA do okrągłego lub owalnego okienka. Zaleca się stosowanie PFA bez metanolu, ultraczystego PFA do mikroskopii elektronowej (EM), który można kupić w stężeniu 16% w szklanych fiolkach. Po otwarciu fiolki i rozcieńczeniu jej w stosunku 1:4 w PBS, tworząc 4% roztwór, można ją stosować do 2 tygodni, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 oC (niektóre przeciwciała wymagają krótkiego utrwalenia, a inne mogą tolerować utrwalenie O/N (O/N)).</li>
</ol>
3. Odwapnić kości skroniowe
<ol>
	<li>Po utrwaleniu usunąć PFA za pomocą pipety i zastąpić 120 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), nieco ponad 2 ml. Upewnij się, że wypełniłeś całą probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, gdy probówka jest zamknięta.
	<ol>
		<li>Jeśli nie zostanie natychmiast odwapnione, zastąp PFA 10 mM PBS o pH 7,4 i przechowuj próbki w temperaturze 4 oC. 
		UWAGA: Po utrwaleniu kości skroniowe mogą być przechowywane przez różny czas przed odwapnieniem, w zależności od badanych antygenów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść probówki na rotatorze typu end-over-end i obracaj z prędkością 4 obr./min przy prędkości obrotowej. Codziennie zmieniaj roztwór EDTA za pomocą pipety. Czas trwania odwapnienia zależy od wieku próbki i preferencji naukowca przeprowadzającego sekcję.
	<ol>
		<li>Inkubuj kości skroniowe w EDTA, korzystając z następujących wytycznych dotyczących czasu inkubacji: 
		Dla próbek po urodzeniu (P) od 8 do P15: 2 - 4 godziny; Dla próbek od P15 do P21: O/N; Dla próbek od P21 do P30: 2 O/N; Dla próbek starszych niż P30: 3 lub więcej O/N. 
		UWAGA: Czas odwapnienia zależy od preferencji użytkowników i może zostać wydłużony w razie potrzeby. Czas odwapnienia można skrócić, zmieniając roztwór EDTA dwa razy dziennie w odstępie około 8 godzin. Niektóre laboratoria dodają 1% PFA do roztworu EDTA podczas odkamieniania przez okres dłuższy niż 3 dni, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ustalić, czy próbka jest odpowiednio odwapniona, umieść kości skroniowe na naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym i delikatnie dociśnij kleszcze do ślimaka w kształcie ślimaka. Jeśli tkanka jest gąbczasta, odwapnienie jest zakończone.</li>
	<li>Po zakończeniu odwapniania usuń EDTA za pomocą pipety i dodaj 500 -1,000 μl 10 mM PBS pH 7,4. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 oC do czasu przygotowania ich do sekcji.</li>
</ol>
4. Stwórz naczynie preparacyjne pokryte elastomerem silikonowym
<ol>
	<li>Połącz bazę i utwardzacz zestawu do kapsułkowania z elastomeru silikonowego zgodnie z instrukcjami producenta i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj około 2 - 3 łyżki sproszkowanego węgla drzewnego, aż roztwór stanie się i dobrze wymieszaj. 
	UWAGA: Płynny atrament lub płynny węgiel drzewny nie mieszają się z roztworem i nie można ich używać. Zestawy do kapsułkowania z elastomeru silikonowego można kupić w kolorze czarnym, co pozwala na pominięcie kroku 4.2.</li>
	<li>Wlej roztwór do szklanych lub plastikowych szalek Petriego o średnicy 60 mm, wypełniając tyle, aby pokryć dno. Jeśli obecne są bąbelki, zaciągnij się powietrzem na powierzchni. Odstawić na co najmniej 24 godziny w temperaturze RT, aby stężać. 
	UWAGA: Naczynia pokryte elastomerem silikonowym mogą być używane wielokrotnie przez lata. Nie używaj jednak etanolu do czyszczenia, ponieważ spowoduje to pękanie elastomeru silikonowego.</li>
</ol>
5. Cała sekcja górnika ślimaka (dla P7 i starszych próbek)
<ol>
	<li>Oddziel zwój podstawowy od zwojów środkowych/wierzchołkowych
	<ol>
		<li>Umieść jedną odwapnioną kość skroniową w naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym, wypełnionym w dwóch trzecich 10 mM PBS o pH 7,4 i użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego do wykonania następujących czynności.</li>
		<li>Przytrzymaj kość skroniową w okolicy przedsionkowej za pomocą prostych kleszczy jubilerskich #4 lub #5 i za pomocą 5 mm nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen odetnij nadmiar tkanki torebki usznej po bokach i powyżej wierzchołka.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas 2,5 mm włóż jedno ostrze do owalnego okienka i wykonaj kilka małych nacięć wzdłuż spiralnego więzadła/bocznej ściany skrętu podstawy.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen o średnicy 5 mm włóż jedno ostrze w obszar właśnie wycięty, a drugie ostrze umieść na zewnątrz kości skroniowej, przyśrodkowo do owalnego okienka. To cięcie oddziela zwój podstawowy od zwojów środkowych i wierzchołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowite rozwarstwienie zwoju podstawowego.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas o średnicy 2,5 mm przetnij włókna nerwowe spiralnego zwoju, które łączą się z modiolusem, aby uwolnić napięcie w zwoju podstawy i przeciąć poniżej zwoju podstawy, aby oddzielić się od narządów przedsionkowych.</li>
		<li>Używając 2,5 mm nożyczek sprężynowych Vannas, wykonaj serię małych nacięć, aby usunąć spiralne więzadło/ścianę boczną zarówno z góry, jak i z dołu narządu Cortiego. Użyj prostych kleszczyków jubilerskich #4 lub #5, aby poprowadzić tkankę. Przypnij włókna nerwowe spiralnego zwoju do naczynia preparacyjnego pokrytego elastomerem silikonowym, ale nie trzymaj się tego obszaru, ponieważ tkanka się rozerwie.</li>
		<li>Podczas poprzednich etapów część błony Reissnera będzie często usuwana. Jeśli coś jeszcze pozostało, chwyć membranę Reissnera prostymi kleszczami jubilerskimi #4 lub #5 i oderwij od narządu Cortiego. 
		UWAGA: Membrana tektorialna jest rzadko widoczna i zazwyczaj unosi się bez konieczności wykonania określonego kroku w celu usunięcia.</li>
		<li>Na koniec wykonaj kilka nacięć, aby zmniejszyć grubość aksonów spiralnych zwojów, aby zwój był jak najbardziej płaski i użyj prostych kleszczyków jubilerskich #4 lub #5, aby przenieść wypreparowany zwój podstawny, chwytając pozostałe aksony zwoju spiralnego, na 48-dołkową płytkę (lub szkiełko komorowe) zawierające ~ 500 μl 10 mM PBS pH 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielne zwoje środkowe i wierzchołkowe
	<ol>
		<li>Umieść pozostałe dwie trzecie ślimaka wierzchołkową stroną do dołu.</li>
		<li>Używając nożyczek sprężynowych Vannas 2,5 mm, włóż jedno ostrze do podłoża scala, w którym środkowy zwój był połączony ze zwojem podstawowym, i wykonaj kilka małych nacięć wzdłuż więzadła spiralnego/bocznej ściany środkowego zwoju.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas-Tubingen o średnicy 5 mm włóż jedno ostrze w obszar właśnie przecięty ze środkowym zwojem umieszczonym na górze ostrza, a drugie ostrze umieść na zewnątrz kostnego labiryntu, pod kątem 90o od wierzchołkowej końcówki. To oddziela skręt środkowy od zwoju wierzchołkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończyć rozbiór środkowego zwoju w podobny sposób jak skręt podstawowy (patrz kroki 5.2.2 do 5.2.4).</li>
	<li>Całkowite rozwarstwienie zwoju wierzchołkowego.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas 2,5 mm otwórz nasadkę zakrywającą skręt wierzchołkowy. Zakończ rozbiór w podobny sposób jak w przypadku zwoju podstawowego (patrz kroki 5.2.2 do 5.2.4). 
		UWAGA: Wypreparowane zwoje ślimaka można przechowywać w 10 mM PBS o pH 7,4 na 48-dołkowej płytce (lub szkiełku podstawowym) w temperaturze 4 oC przez kilka tygodni przed barwieniem immunologicznym. Jednak PBS wyparuje i musi być okresowo uzupełniany, a przechowywanie dłuższe niż 2-3 tygodnie może spowodować rozwój bakterii lub grzybów na tkance, co może obniżyć jakość obrazu. Zalecamy długotrwałe przechowywanie próbek w postaci niewypreparowanych kości skroniowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne za pomocą fluorescencyjnie oznaczonych przeciwciał
<ol>
	<li>Po rozbiorze należy przechowywać każdy obrót ślimaka w osobnej studzience na 48-dołkowej płytce (lub szkiełku komorowym), zanurzonej w ~500 μl 10 mM PBS pH 7,4. W każdym z poniższych kroków skręt ślimaka powinien być zanurzony w płynie, nie unosząc się na wierzchu ani nie przyklejony do boku studzienki. 
	UWAGA: Podczas wyjmowania płynu z każdej studzienki łatwo jest zgubić obroty ślimaka lub zassać go do końcówki pipety. Zmiana roztworów za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl za pomocą lunety do preparacji pomoże temu zapobiec.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń PBS z każdej studzienki i zastąp ~200 - 300 μl na studzienkę roztworu blokującego/przepuszczalnego (1% Triton X-100, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 10% normalnej surowicy koziej (NGS) rozcieńczonej w 10 mM PBS pH 7,4). Inkubuj 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. 
	UWAGA: Jeśli jakiekolwiek użyte przeciwciało pierwszorzędowe zostało wytworzone u gospodarza kozy, wówczas potrzebne będzie drugorzędowe przeciwciało przeciwko kozie i NGS NIE należy stosować do żadnego z etapów. Normalna surowica końska może być stosowana jako zamiennik NGS.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący/przepuszczalny za pomocą pipety i zastąpić ~100 μl na studzienkę roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (0,1% Triton X-100, 1% BSA i 5% NGS rozcieńczone w 10 mM PBS pH 7,4). Współczynnik rozcieńczenia dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego jest różny. Inkubować O/N (minimum 14 godzin) w temperaturze 4 oC na rotatorze 3D. 
	UWAGA: Jeśli stosuje się więcej niż jedno przeciwciało pierwszorzędowe, wszystkie można połączyć w ten sam roztwór do inkubacji, po prostu upewnij się, że każde przeciwciało pierwszorzędowe ma innego gospodarza.</li>
	<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała za pomocą pipety i wykonać 3 płukania 10 mM PBS pH 7,4 przy ~ 500 μl na studzienkę. Każde mycie inkubuje minimum 5 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D.</li>
	<li>Usunąć ostatnie płukanie PBS za pomocą pipety i zastąpić ~100 μl na studzienkę wtórnego roztworu przeciwciał (0,1% Triton X-100, 1% BSA i 5% NGS rozcieńczone w 10 mM PBS pH 7,4). Współczynnik rozcieńczenia dla każdego fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała drugorzędowego wynosi zwykle 1:500 lub 1:1,000. Umieść 48-dołkową płytkę w czarnym pudełku, aby chronić znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe przed światłem. Inkubacja 2 - 3 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. 
	UWAGA: Jeśli potrzebne jest więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe, można je połączyć w ten sam roztwór do inkubacji. Upewnij się, że nie ma możliwości znakowania krzyżowego (np. przy użyciu drugorzędowych przeciwciał przeciwko królikom i kurczakom przeciwko kozom)</li>
	<li>Usunąć wtórny roztwór przeciwciała za pomocą pipety i wykonać 3 przemycia 10 mM PBS pH 7,4 przy ~ 500 μl na studzienkę. Inkubuj każde pranie przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. Przechowywać 48-dołkową płytkę w czarnym pudełku w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Usunąć ostatnie płukanie PBS za pomocą pipety i zastąpić ~100 μl na studzienkę Hoechst 33342 (rozcieńczony 1:2,000 w 10 mM PBS pH 7,4) w celu oznaczenia jąder. Inkubacja 15 - 20 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. Przechowywać 48-dołkową płytkę w czarnym pudełku w celu ochrony przed światłem. NIE inkubować dłużej niż 20 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór Hoechsta za pomocą pipety i wykonać 3 płukania 10 mM PBS pH 7,4 przy ~500 μl na studzienkę. Inkubuj każde pranie przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze 3D. Przechowywać 48-dołkową płytkę w czarnym pudełku w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>W razie potrzeby wszystkie etapy można przedłużyć, z wyjątkiem inkubacji Hoechsta, o kilka godzin. Aby wstrzymać reakcję na dowolnym etapie, wystarczy zanurzyć próbki w ~500 ul 10mM PBS pH7,4 i przechowywać 48-dołkową płytkę (lub szkiełko komorowe) w temperaturze 4 oC, aż będzie gotowa do wznowienia protokołu godzin lub 1-2 dni później. 
	 </li>
</ol>
7. Mount Cochlear włącza zjeżdżalnie
<ol>
	<li>Szkiełka z etykietami z istotnymi informacjami o użytej próbce i przeciwciałach.</li>
	<li>Odpipetować ~50 μl podłoża montażowego na każde szkiełko i uważać, aby nie powstały pęcherzyki. Odwirować probówkę zawierającą pożywkę montażową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.</li>
	<li>Używając prostych kleszczyków jubilerskich #4 lub #5, chwyć aksony spiralnego zwoju, aby delikatnie przenieść jeden obrót ślimaka z 48-dołkowej płytki na szkiełko i umieścić w podłożu montażowym. Zamontuj jeden obrót ślimaka na szkiełko, aby zapobiec ekspozycji na światło i fotowybielaniu podczas procesu obrazowania.</li>
	<li>Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że skręt ślimaka nie jest zagięty, skręcony ani nie znajduje się w pobliżu pęcherzyków powietrza. Jeśli wystąpi którykolwiek z tych warunków, użyj prostych kleszczy jubilerskich #4 lub #5, aby zmienić położenie skrętu ślimaka.</li>
	<li>Umieść jeden koniec szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i delikatnie zwolnij, aby szkiełko nakrywkowe spadło.</li>
	<li>Użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że skręt ślimaka nie jest zagięty, skręcony lub w pobliżu pęcherzyków powietrza. Jeśli wystąpi którykolwiek z tych warunków, delikatnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe do przodu i do tyłu, aby zmienić położenie skrętu ślimaka.</li>
	<li>Umieść slajdy w folderze slajdów tak, aby leżały płasko. Poczekaj, aż media montażowe utwardzą się w temperaturze RT (przechowywać w CIEMNOŚCI)</li>
	<li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze RT lub -20 oC do momentu uzyskania obrazu. Slajdy można przechowywać w folderze slajdów lub pudełku na slajdy. 
	UWAGA: Szkiełka można przechowywać przez długi czas w temperaturze -20 oC lub -80 oC, a fluorescencja utrzyma się przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Obraz jest przenoszony za pomocą mikroskopu konfokalnego o odpowiedniej długości fali w oparciu o przeciwciała drugorzędowe stosowane podczas procedury barwienia immunologicznego. Regulację jasności i kontrastu można wykonać za pomocą oprogramowania do obrazowania dostarczonego przez dostawcę konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka krytycznych etapów udanego rozwarstwienia całego wierzchowca i barwienia immunologicznego. Jednak zanim którakolwiek z tych metod zostanie wykonana, konieczne jest odpowiednie utrwalenie tkanki ślimaka. Zalecamy stosowanie niezawierającego metanolu, ultra czystego PFA klasy EM. PFA wykonany z proszku może mieć śladowe ilości metanolu i niestabilne pH, co obniża jakość immunofluorescencji. Inne grupy wykazały również, że podobne sekcje są możliwe przy użyciu utrwalaczy, które nie zawierają formaldehydu...

Ślimak w kształcie ślimaka ucha wewnętrznego, zawarty w kości skroniowej, mieści narząd Cortiego, narząd końcowy czuciowy u ssaków. Ślimak jest zorganizowany tonotopowo i zwykle dzieli się na zwoje wierzchołkowe, środkowe i podstawowe odpowiadające różnym obszarom częstotliwości z detekcją dźwięku o wysokiej częstotliwości w podstawie i detekcją niskiej częstotliwości w wierzchołku1. Komórki rzęsate, komórki mechanosensoryczne narządu Cortiego, biegną wzdłuż ślimaka, który u myszy ma około 6 mm długości2,3. Komórki te przekształcają energię mechaniczną fal dźwiękowych, które są przesyłane przez wypełniony płynem błoniasty labirynt, w sygnały neuronowe, które są przetwarzane przez centralne struktury słuchowe. Opisana tutaj technika zapewnia metodę przygotowania całych wierzchowców narządu Cortiego po całkowitym zwapnieniu ślimaka (dla próbek w wieku od jednego tygodnia do dorosłości). Przedstawiamy również metodę barwienia immunologicznego całej zamontowanej tkanki ślimaka. Całe mocowania ślimaka mają kluczowe znaczenie dla wizualizacji wszystkich komórek rzęsatych i otaczających je komórek podporowych w ich naturalnym układzie przestrzennym i umożliwiają analizę w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Doktorzy Hans Engstrom i Harlow Ades pierwotnie opisali całą metodę sekcji ślimaka w 1966 roku. Szczegółowo opisali technikę szybkiego naprawiania i preparowania zwapniałych ślimaków zanurzonych w płynie pochodzących od różnych ssaków, zachowując krótkie, nienaruszone segmenty narządu Cortiegodo analizy mikroskopowej. Sekcja nieutrwalonego, zwapniałego ślimaka szczura została również zilustrowana w filmie instruktażowym5. Doktorzy Barbara Bohne i Gary Harding z Uniwersytetu Waszyngtońskiego dokonali kilku ważnych modyfikacji tej metody. W ich wersji metody ślimaka z całym mocowaniem kości skroniowej odkamieniono, zatopiono w plastiku, a następnie wycięto pięć półobrotów lub dziesięć ćwiartek obrotu6,7. Dr Charles Liberman i jego koledzy z Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, zmodyfikowali tę technikę tak, że osadzanie plastiku niebyło wymagane. Dalsza modyfikacja techniki miała miejsce w laboratorium dr Jian Zuo w St. Jude Children's Research Hospital9-12, co wpłynęło na zaprezentowaną tutaj metodę sekcji. Używamy innej strategii, aby uzyskać dostęp do narządu Cortiego niż Bohne i Liberman, która pozwala na izolację pełnych zwojów wierzchołkowych, środkowych i podstawnych. W ten sposób wypreparowana tkanka jest większa i mniej podatna na utratę lub uszkodzenie podczas procesów rozwarstwiania lub barwienia immunologicznego. Ponadto obecna metoda ułatwia pomiar odległości od końcówki wierzchołkowej lub haka podstawowego w celu zidentyfikowania obszaru częstotliwości.
Chociaż wiele laboratoriów przeprowadza barwienie immunologiczne tkanki ślimaka, nie jest jasne, skąd wzięła się ta metoda. W związku z tym istnieją różne receptury blokujących i inkubacji przeciwciał, które mogą wpływać na działanie poszczególnych przeciwciał pierwszorzędowych. W tym miejscu przedstawiamy jedną metodę barwienia immunologicznego przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, która ma zastosowanie do najczęściej stosowanych przeciwciał w polu słuchowym.
Skomplikowany kształt ślimaka, delikatna struktura narządu Cortiego i kostna powłoka stanowią wyzwanie dla analizy histologicznej i biochemicznej. W dziedzinie słuchu stosuje się obecnie różne techniki, aby przezwyciężyć te trudne cechy i uwidocznić komórki w narządzie Cortiego, a każda technika ma swoje zalety i wady. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na pełną sekcję ślimaka dorosłej myszy i, z niewielkimi modyfikacjami, może być potencjalnie wykorzystany do zbadania krytycznych struktur w ślimaku z wielu innych organizmów modelowych stosowanych w terenie.

<table><tbody><tr><td>Standardowe&nbsp; kleszcze wzorcowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki 10,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>16% formaldehydu, bez metanolu, ultra czysty, klasa EM</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC - nosić rękawice i nie można go wyrzucać do zlewu. Można kupić od innych dostawców.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>rotator rurowy typu end-over-end</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Zestaw silikonowych kapsułek Dow Corning Sylgard 184</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>węgiel aktywny</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr> stereoskopowy <tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas 2,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>zakrzywione&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe 5 mm Vannas-Tubingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>proste</td></tr><tr><td>płytki 48-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Szkiełka 8-dołkowe Fisher</td><td></td><td>1256518</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>BSA, frakcja V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Rotator 3D</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Pudełko do inkubacji Western blot XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Przedłużone złote nośniki montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>można kupić u innych dostawców, ale nośniki montażowe różnią się zdolnością do ochrony przed fotowybielaniem</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>można kupić od innych sprzedawców</td></tr><tr><td>przezroczysty lakier do paznokci</td><td>Lokalna apteka</td><td></td><td>można kupić od innych sprzedawców</td></tr><tr><td>tekturowy folder na slajdy</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>można kupić od innych sprzedawców</td></tr><tr><td>plastikowe pudełko na slajdy</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>można kupić u innych sprzedawców</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Narząd Cortiego, znajdujący się w ślimaku ucha wewnętrznego, zawiera mechanosensoryczne komórki rzęsate i otaczające je komórki pomocnicze, które są zorganizowane w spiralny kształt i mają gradient tonotopowy do wykrywania dźwięku. Ślimak myszy ma około 6 mm długości i często jest podzielony na trzy zwoje (wierzchołek, środek i podstawa) do analizy. Do badania utraty komórek, podziału komórek lub ekspresji genów mozaiki przydatne jest całe przygotowanie mocowania lub powierzchni ślimaka. Ta metoda preparacji umożliwia wizualizację wszystkich komórek w narządzie Cortiego w połączeniu z barwieniem immunologicznym i mikroskopią konfokalną w celu zobrazowania komórek w różnych płaszczyznach osi z. Z tych obrazów z-stack można również uzyskać wiele przekrojów optycznych. Ponadto do skaningowej mikroskopii elektronowej można zastosować metodę rozwarstwienia całego mocowania, chociaż potrzebna jest inna metoda utrwalania. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolowania narządu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Metoda ta może być stosowana u myszy w wieku od jednego tygodnia życia do dorosłości i różni się od techniki stosowanej w przypadku próbek noworodków, w których zwapnienie ślimaka jest niekompletne. Nieco zmodyfikowaną wersję można wykorzystać do wypreparowania ślimaka szczura. Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Przedstawiamy metodę izolacji organu Cortiego w postaci trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołkowego, środkowego i podstawowego) z tkanki ślimaka, która uległa zwapnieniu, przy czym kluczowe etapy preparacji przedstawiono na Rysunku 1. W ciągu pierwszego postnatalnego tygodnia rozwoju zwapnienie ślimaka myszy jest niepełne i można zastosować prostszą metodę preparacji13. Zastosowanie metody preparacji całego preparatu (whole mount) dla noworodków w prz...

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Ogólnym celem tej metody sekcji całego preparatu jest wyizolowanie obszaru sensorycznego skalcyfikowanej ślimaki dorosłego osobnika w postaci trzech nienaruszonych zwojów: wierzchołkowego, środkowego i podstawowego. Metoda sekcji ta pozwala zachować trójwymiarową strukturę narządu Cortiego i umożliwia wizualizację wszystkich komórek w połączeniu z immunobarwieniem oraz mikroskopią konfokalną w celu obrazowania w różnych płaszczyznach osi Z. W porównaniu z poprzednimi metodami sekcji, stosujemy inną strategię, która pozwala na uzyskanie trzech zwojów ślimaka, które są większe i rzadziej ulegają zagubieniu lub uszkodzeniu podczas procesu immunobarwienia.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ technika sekcji jest trudna do opanowania. Ze względu na delikatność narządu Cortiego, margines błędu podczas usuwania więzadła spiralnego jest niewielki. Po eutanazji zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami i usunięciu mózgu, należy zidentyfikować kości skroniowe u podstawy czaszki myszy.Następnie należy zdrapać nerwy czaszkowe, używając standardowych pęsety anatomicznej. Umieść pęsetę na czubku torebki słuchowej i użyj kciuka przeciwnej ręki, aby nacisnąć tylny kanał p

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Tutaj opisujemy metodę obrazowania w całości w całej skórze ucha dorosłej myszy, która pozwala nam na wizualizację rozgałęzionej morfogenezy i wzoru nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także rozmieszczenia komórek odpornościowych.

Mikroskopia konfokalna z pełnym mocowaniem dla skóry ucha osoby dorosłej: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień nerwowo-naczyniowych i dystrybucji komórek odpornościowych

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Tutaj prezentujemy protokół dla mysiego modelu ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL). Aby wywołać NIHL, opracowaliśmy nowe i proste urządzenie wykorzystujące tekturę falistą, klatkę pułapkę na szczury i głośnik. Odpowiedź słuchowa pnia mózgu i obrazowanie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do oceny odpowiednio funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych.

Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych

Mikroskop z arkuszami świetlnymi został opracowany do obrazowania i digitalizacji całego ślimaka.

Obrazowanie starzejącego się ślimaka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszach świetlnych

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Ten protokół, przeznaczony dla początkujących użytkowników tkanek ucha wewnętrznego myszy, szczegółowo opisuje etapy przetwarzania uszu wewnętrznego myszy na różnych etapach rozwoju w celu barwienia immunologicznego sekcji.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Poznaj metodę rozwarstwienia całej góry i immunofluorescencji dorosłej ślimaka myszy. Technika izoluje trzy nienaruszone zwoje ślimaka, zachowując strukturę trójwymiarową organu Cortiego.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów