Name: Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę generowania pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogona myszy. Protokół umożliwia przechowywanie tkanek w temperaturze pokojowej do 10 dni, co ułatwia badania w biologii komórkowej i onkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NRD HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Myszy były trzymane w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi do czasu eutanazji (wytyczne Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Narodowym Uniwersytecie Singapuru oraz wytyczne Krajowego Komitetu Doradczego ds. Badań na Zwierzętach Laboratoryjnych (NACLAR)).
1. Myszy
<ol>
	<li>Zamów jedną mysz o odpowiednim tle genetycznym. Protokół ten opiera się na tkance pochodzącej z jednej myszy C57BL/6.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kompletnego podłoża
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę, dodając następujące składniki do pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: 10% płodowa surowica cielęca (FCS), 50 μM 2-merkaptoetanolu, 100 μM asparagina, 2 mM glutamina, 1% roztwór penicyliny i streptomycyny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów enzymatycznych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kolagenazy D w probówce o stożkowym dnie o pojemności 15 ml.
	<ol>
		<li>Odważyć 10 mg kolagenazy D. Kolagenazę D rozpuścić w 4 ml kompletnej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór pronazy w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
	<ol>
		<li>Odważyć 10 mg pronazy.</li>
		<li>Dodać 5 μl 1 M buforu Tris (pH 8,0). Dodać 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0).</li>
		<li>Uzupełnij 494 μl sterylnej wody.</li>
		<li>Inkubować roztwór pronazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie mieszanki D-pronazy kolagenowej (≤2 ogonki)
Uwaga: Wykonaj kolejne kroki w sterylnym kapturze do hodowli komórek.
<ol>
	<li>Dodać 250 μl roztworu pronazy do 4 ml roztworu kolagenazy D.</li>
	<li>Przepuścić mieszaninę D-pronazy kolagenazy przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do sterylnej probówki o stożkowym dnie o pojemności 15 ml.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja fibroblastów z tkanek uszu i ogona
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Umieść autoklawowane narzędzia chirurgiczne (nożyczki i kleszcze) w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodaj 10 ml kompletnej pożywki do dwóch naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm każda.</li>
	<li>Odetnij nożyczkami uszy (promień ~1 cm) i 5 cm ogona (od czubka ogona) myszy i inkubuj przez 5 minut w 40 ml 70% etanolu w sterylnej probówce ze stożkowym dnem o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wysuszyć uszy i ogon na powietrzu, umieszczając je w otwartym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych w kapturze na 5 minut. Po wysuszeniu przenieść kawałki uszu i ogona do dwóch szalek hodowlanych oznaczonych jako "uszy" i "ogon", zawierających 10 ml kompletnej pożywki, jak opisano w kroku 5.3.</li>
	<li>Usuń włosy z uszu i ogona za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Pokrój uszy i ogon na kawałki o wielkości mniejszej niż 3 mm za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Przenieść pocięte tkanki do fiolek z krioprobówką o pojemności 1,8 ml oznaczonych jako "uszy" i "ogonek" i dodać tyle roztworu D-pronazy kolagenazy, aby objętość osiągnęła oznaczenie 1,8 ml na fiolce.</li>
	<li>Umieścić fiolki z krioprobówkami poziomo na wytrząsarce i wstrząsać próbkami z prędkością 200 obr./min przez 90 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 90 minutach inkubacji wyjąć fiolki z krioprobówką z wytrząsarki i umieścić fiolki w kapturze.</li>
	<li>Dodać 10 ml kompletnej pożywki do dwóch 10 cm naczyń do hodowli komórkowych, z których każde są oznaczone jako "uszy" i "ogon", a następnie umieścić w każdym naczyniu sitko do komórek o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Umieścić strawione tkanki ucha i ogona w sitku do komórek o wielkości 70 μm w odpowiednio oznakowanych naczyniach przygotowanych w kroku 5.11 i mocno rozdrabniać tkanki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml przez >5 minuty. Od czasu do czasu wstrząsać sitkiem do komórek w pożywce, aby wypłukać komórki z sitka do komórek.</li>
	<li>Zawiesinę komórek z każdej płytki należy pobrać pipetą do dwóch probówek o stożkowym dnie o pojemności 15 ml oznaczonych jako "uszy" i "ogon". Umyj naczynie i sitko dodatkowymi 10 ml kompletnego podłoża i dodaj pożywkę do odpowiednich probówek ze stożkowym dnem o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować zawiesinę komórkową przez 7 minut w temperaturze ~580 x g i 4 °C za pomocą wirówki komórkowej z chłodzeniem.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad, dodać 10 ml kompletnego podłoża do osadu komórkowego w stożkowej probówce dolnej o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.14 i 5.15.</li>
</ol>
6. Hodowla mieszaniny komórek
<ol>
	<li>Usunąć supernatant. Upewnij się, że osad komórkowy pozostaje nienaruszony.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnej pożywki i dodać odpowiednią mieszaninę do dwóch 10-centymetrowych szalek do hodowli komórkowych oznaczonych "uszy" i "ogon".</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu amfoterycyny B (roztwór podstawowy: 250 μg/ml) do hodowli.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Trzeciego dnia zastąpić pożywkę 10 ml świeżej, kompletnej pożywki zawierającej 10 μl amfoterycyny B w celu usunięcia zanieczyszczeń (ryc. 1 i 2).</li>
</ol>
7. Subkultura fibroblastów
<ol>
	<li>Gdy hodowla osiągnie około 70% konfluencji (3-4 dzień hodowli), usuń pożywkę i umyj komórki 5 ml sterylnego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 2 ml sterylnego 1x roztworu trypsyny-EDTA do komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Po 5 minutach delikatnie postukaj w naczynie hodowlane i dodaj 6 ml kompletnej pożywki do komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze ~450 x g i temperaturze 4 °C za pomocą wirówki komórkowej z chłodzeniem.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnego podłoża</li>.
	<li>Wysiewać 2 x 105 komórek w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez 3-4 dni, a następnie powtórzyć kroki 7.1 do 7.6.</li>
</ol>
8. Przygotowanie uszu do wysyłki
Uwaga: Wykonaj kolejne kroki w sterylnym kapturze do hodowli komórek.
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Umieść autoklawowane nożyczki i kleszcze w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodać 50 ml kompletnej pożywki do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wytnij nożyczkami uszy (promień ~1 cm) myszy.</li>
	<li>Przenieś uszy do stożkowej probówki dolnej o pojemności 50 ml (przygotowanej w kroku 3) za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Stożkową probówkę o pojemności 50 ml należy zapieczętować parafilmem przed wysyłką w RT w odpowiednim pudełku.</li>
</ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lim, J., Dobson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+transfection+of+HUVEC+and+MEF+cells+using+DNA+complexes+with+magnetic+nanoparticles+in+an+oscillating+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet%22%5BJournal%5D)">Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field.</a> J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).</li>
<li>Patel, M., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+reprogramming+somatic+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+luman+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
<li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
<li>Shen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-derived+cytosolic+DNA+mediates+type+I+interferon-dependent+rejection+of+B+cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells.</a> Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Baglole, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+phenotypic+characterization+of+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts.</a> Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).</li>
<li>Alt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+share+mesenchymal+phenotypes+with+stem+cells%2C+but+lack+their+differentiation+and+colony-forming+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential.</a> Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+culture+of+cells+from+mouse+tail+biopsies%3A+brief+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication.</a> J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).</li>
<li>Moore, C. B., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ear+fibroblast+derivation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary ear fibroblast derivation from mice.</a> Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Tutaj zapewniamy prostą, niedrogą i szybką procedurę eksperymentalną do ustalenia pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Ekstrakcja powinna skutkować przylegającymi i szybko dzielącymi się fibroblastami w ciągu 3 dni po wyizolowaniu tkanki. Ważnym ograniczeniem komórek pierwotnych jest starzenie się, trwałe zatrzymanie wzrostu15. Korzystając z protokołu, kultury fibroblastów mogą być pasażowane od 5 do 6 razy, zanim fibroblasty staną się stare, co wskazuje na spłaszczenie komórek, wzrost rozmia...

Pierwotne komórki pochodzą z żywej tkanki i są hodowane w warunkach in vitro. Na ogół przyjmuje się, że komórki pierwotne bardziej przypominają stan fizjologiczny i tło genetyczne tkanki, z której pochodzą, niż unieśmiertelnione lub nowotworowe linie komórkowe1. Z tego powodu komórki pierwotne stanowią użyteczny model do badania zagadnień biologicznych2,3. Jednak w przeciwieństwie do ustalonych linii komórkowych, które rosną w nieskończoność, komórki pierwotne ostatecznie ulegają starzeniu w hodowli i muszą być często odtwarzane.
Powszechnie używane komórki pierwotne obejmują fibroblasty, komórki nabłonkowe, komórki śródbłonka, limfocyty T, limfocyty B, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) i komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC). Fibroblasty są często wykorzystywane jako podstawowy model hodowli komórek. Oferują one kluczowe zalety w porównaniu z innymi ogniwami pierwotnymi. Hodowle komórkowe są łatwe do założenia, łatwe w utrzymaniu i nie wymagają oczyszczania komórek przed hodowlą. Charakteryzują się szybką początkową proliferacją i nie wymagają specjalistycznych pożywek ani protokołów aktywacji. Fibroblasty mogą być skutecznie transfekowane przy użyciu protokołów biologicznych, chemicznych i fizycznych4,5. Istnieje możliwość przechowywania uszu do 10 dni w RT przed założeniem hodowli komórkowych. Hodowle fibroblastów sprzyjają wizualizacji procesów cytoplazmatycznych i nadają się do przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS)6.
Fibroblasty są ważnymi komórkami tkanki łącznej, które wydzielają białka kolagenu i macierz zewnątrzkomórkową7. Stanowią one szkielet strukturalny w wielu tkankach8 i odgrywają zasadniczą rolę w gojeniu się ran i naprawie tkanek9,10.
Tutaj opisujemy prosty i szybki (<4 godziny) protokół tworzenia kultur fibroblastów z uszu i ogona myszy11. Protokół wymaga minimalnego doświadczenia myszy w pobieraniu tkanek (w przeciwieństwie do innych protokołów12,13) i może być stosowany do tworzenia kultur z uszu przechowywanych w pożywce w temperaturze RT przez okres do 10 dni.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa cielęca</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon penicyliny/streptomycyny</td><td></td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolut do analizy</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche Diagnostyka</td><td>11088866001</td><td>Z Clostridium histolyticum, liofilizowana, niesterylna</td></tr><tr><td>proteaza pronazy</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>Z Streptomyces griseus&nbsp; Bufor </td></tr><tr><td>Tris (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td>Ultra czysty</td></tr><tr><td>gatunek 0,5M EDTA (pH 8)</td><td>1.</td><td>BAZA BUF-1053</td><td>Klasa biotechnologiczna</td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>1. BAZA</td><td>BUF-2040-10X4L</td><td>Ultra czysty</td></tr><tr><td>roztwór trypsyny-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0,5% trypsyna, 0,2% EDTA, gamma trypsyny napromieniowana metodą SER-TAIN, bez czerwieni fenolowej, w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; g/ml w wodzie dejonizowanej, sterylnie filtrowane</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; M filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtr siatkowy do komórek M</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Tłok strzykawkowy</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Probówka kriowialna</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 10 cm</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Naczynie poddane hodowli komórkowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa denna 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubacyjna</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Zeiss Axiovert 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Komórki pierwotne pochodzą bezpośrednio z tkanki i są uważane za bardziej reprezentatywne dla fizjologicznego stanu komórek in vivo niż ustalone linie komórkowe. Jednak pierwotne hodowle komórkowe mają zwykle skończoną długość życia i muszą być często odtwarzane. Fibroblasty są łatwo dostępnym źródłem komórek pierwotnych. Tutaj omawiamy prostą i szybką procedurę eksperymentalną mającą na celu ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Protokół może być stosowany do tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni. Jeśli protokół jest dokładnie przestrzegany, w niektórych przypadkach jest mało prawdopodobne, aby doszło do skażenia, pomimo użycia niesterylnej tkanki przechowywanej przez dłuższy czas. Fibroblasty szybko namnażają się w kulturze i mogą zostać rozszerzone do znacznych liczb przed ulegnięciem starzeniu replikacyjnemu.

Izolacja fibroblastów z tkanki skutkuje powstaniem znacznej ilości debris tkankowych (Rysunek 1). W przeciwieństwie do debris tkankowych, fibroblasty przylegają do plastikowych powierzchni naczyń hodowlanych między 1. a 3. dniem hodowli. Połziewkę w hodowlach fibroblastów można bezpiecznie wymienić w 3. dniu hodowli, co powinno znacząco zmniejszyć poziom obecnych w kulturze debris (Rysunek 2). Fibroblasty charakteryzują się wydłużoną morfologią i wyraźnie widoczną cytoplazmą (Rys...

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak różnice między komórkami zdrowymi a rakowymi. Główną zaletą tego badania jest możliwość wygenerowania fibroblastów z uszu, które były przechowywane w medium w temperaturze pokojowej do 10 dni przed izolacją komórek.Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w biologię myszy, może ona być zastosowana również u innych organizmów ssaków, takich jak szczury i króliki. Przed pobraniem tkanek należy napełnić 10 centymetrowe płytki hodowlane 10 mililitrami pełnej pożywki. Następnie, po uśpieniu myszy, należy przystąpić do pobrania próbek tkanek przy użyciu sterylnych narzędzi.Pobrać tkanki ucha o promieniu około jednego centymetra oraz około pięciu centymetrów tkanki ogona. Przenieść tkanki do probówki stożkowej zawierającej 40 ml 70% etanolu. Pozostawić do namoczenia przez pięć minut, a następnie suszyć na powietrzu przez pięć minut w otwartej 10-centymetrowej płytce hodowlanej w dygestorium.Po wyschnięciu tkanek przenieś je na płytkę z podłożem. Następnie, używając nożyczek, odetnij

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Opisujemy tutaj protokół generowania iCM za pomocą retrowirusowego dostarczania Gata4, Tbx5 i Mef2c w konstrukcji policistronicznej. Protokół ten daje stosunkowo jednorodną populację przeprogramowanych komórek o zwiększonej wydajności i jakości, co jest cenne dla przyszłych badań nad przeprogramowaniem iCM.

Ulepszone wytwarzanie indukowanych kardiomiocytów przy użyciu konstruktu politronicznego wyrażającego optymalny stosunek Gata4, Mef2c i Tbx5

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Poznaj metodę generowania pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogona myszy. Protokół umożliwia przechowywanie tkanek w temperaturze pokojowej do 10 dni, co ułatwia badania w biologii komórkowej i onkologii.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Przeglądaj więcej filmów