Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ustanowienie pierwotnych kultur fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak różnice między komórkami zdrowymi a rakowymi. Główną zaletą tego badania jest możliwość wygenerowania fibroblastów z uszu, które były przechowywane w medium w temperaturze pokojowej do 10 dni przed izolacją komórek.

Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w biologię myszy, może ona być zastosowana również u innych organizmów ssaków, takich jak szczury i króliki. Przed pobraniem tkanek należy napełnić 10 centymetrowe płytki hodowlane 10 mililitrami pełnej pożywki. Następnie, po uśpieniu myszy, należy przystąpić do pobrania próbek tkanek przy użyciu sterylnych narzędzi.

Pobrać tkanki ucha o promieniu około jednego centymetra oraz około pięciu centymetrów tkanki ogona. Przenieść tkanki do probówki stożkowej zawierającej 40 ml 70% etanolu. Pozostawić do namoczenia przez pięć minut, a następnie suszyć na powietrzu przez pięć minut w otwartej 10-centymetrowej płytce hodowlanej w dygestorium.

Po wyschnięciu tkanek przenieś je na płytkę z podłożem. Następnie, używając nożyczek, odetnij włosy ze wszystkich tkanek, a potem pokrój tkanki na kawałki o rozmiarze mniejszym niż 3 mm. Przenieś poszatkowaną tkankę do probówek kriogenicznych, a następnie napełnij probówki roztworem kolagenazy D i pronazy do poziomu 1,8 ml.

Następnie inkubuj tkanki w temperaturze 37 °C, przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm przez 90 minut. W dygestorium przygotuj naczynie z 10 ml pożywki kompletnej. Na naczyniu umieść sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm, a po zakończeniu inkubacji przelej zawiesinę po trawieniu tkanki przez sitko.

Teraz należy rozetrzeć tkanki w sitku za pomocą tłoka. Czynność tę należy powtarzać przez co najmniej pięć minut. Co jakiś czas należy potrząsać sitkiem nad medium, aby wypłukać zdysocjowane komórki.

Ważne jest, aby odpowiednio dokładnie rozetrzeć trawione tkanki ucha i ogona, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek. Należy również pamiętać o potrząśnięciu sitkiem do komórek po rozcieraniu tkanek. Pozwoli to na wypłukanie z sitka dodatkowych komórek.

Następnie zebrać zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Potem przemyć sitko 10 ml medium i dodać roztwór płuczący do zebranej zawiesiny. Teraz przeprowadzić przemywanie komórek.

W pierwszej kolejności należy odwirować komórki w wirówce chłodzącej. Po drugie, należy usunąć supernatant. Po trzecie, należy zawiesić komórki w 10 milliliters pełnej pożywki.

Powtórz płukanie jeszcze raz, a następnie zakończ procedurę, umieszczając komórki w pełnej pożywce, gotowej do hodowli. Aby wyhodować komórki, najpierw przenieś zawiesiny komórkowe do 10 mililitrowych naczyń hodowlanych. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu amfoterycyny B do każdej hodowli.

Następnie inkubuj komórki przez trzy dni. Trzeciego dnia wymień medium na świeże medium kompletne z amfoterycyną B. Wkrótce kultury osiągną 70% konfluencji. W tym momencie usuń medium i opłucz kulturę pięcioma mililitrami 1X PBS.

Następnie zastąp PBS dwiema mililitrami roztworu 1X trypsyny z EDTA i inkubuj komórki przez pięć minut. Po krótkiej inkubacji delikatnie opukaj płytki i dodaj sześć mililitrów świeżej pożywki kompletnej do każdej z nich. Teraz przenieś za pomocą pipety uwolnione komórki z płytki do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów.

Następnie odwiruj zawartość probówek przez pięć minut przy 450 Gs w wirówce chłodzącej. Resuspenduj osady w pięciu mililitrach pełnej pożywki i zmierz gęstość komórkową zawiesin. Teraz przenieś komórki do naczyń o średnicy 10 centymetrów w zagęszczeniu 200 000 komórek na naczynie.

Inkubuj te komórki przez trzy do czterech dni, aż osiągną 70% konfluencji, a następnie powtórz proces zbierania i ponownego wysiewania komórek z określoną gęstością. Mogą być one w ten sposób hodowlane do 25 dni. Trzy dni po ekstrakcji komórek w kulturze pojawiły się znaczące ilości zanieczyszczeń przed wymianą medium.

Szczątki komórkowe są zaznaczone białymi strzałkami. Pasek skali odpowiada 100 mikronom. Nowe medium znacząco zredukowało ilość szczątków komórkowych.

Trzydniowe hodowle przygotowane z tkanki przechowywanej w temperaturze pokojowej przez 10 dni wykazały, że fibroblasty są dość wytrzymałe. Z takich tkanek uzyskano 70-80% konfluencji fibroblastów po pięciu lub sześciu dniach. Komórki zostały znakowane markerem fibroblastów, wimentyną, widoczną na czerwono.

Do znakowania jąder komórkowych użyto DAPI, co widoczne jest w kolorze niebieskim. Pasek skali wynosi 10 µm. Jednolite barwienie sugeruje, że hodowla fibroblastów jest czysta.

Opisany protokół rutynowo pozwala na uzyskanie takiego rezultatu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo osiągnąć ten końcowy efekt w zakresie szybkiego i niezawodnego wytwarzania pierwotnych kultur fibroblastów. Podczas wykonywania tej procedury należy zwrócić szczególną uwagę na etap wyodrębniania fibroblastów z tkanek, ponieważ niewystarczające rozcieranie tkanki spowoduje uzyskanie mniejszej liczby komórek.