Name: Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metody badania sorpcji złota przez białka S-warstwy z Lysinibacillus sphaericus przy użyciu QCM-D, ICP-MS i AFM. Techniki te umożliwiają wykrywanie adsorpcji nanocząstek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecna praca została częściowo sfinansowana przez IGF-projekt "S-Sieve" (490 ZBG/1) finansowany przez BMWi oraz BMBF-projekt "Aptasens" (BMBF/DLR 01RB0805A). Specjalne podziękowania dla Tobiasa J. Günthera za jego cenną pomoc podczas studiów AFM oraz dla Erika V. Johnstone'a za przeczytanie rękopisu jako native speakera języka angielskiego. Ponadto autor tego artykułu pragnie podziękować Aline Ritter i Sabrinie Gurlit (z Institute for Resource Ecology za pomoc w pomiarach ICP-MS), Manji Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava oraz grupie biotechnologicznej z Helmholtz-Institute Freiberg for Resource Technology.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy badano wiązanie Au z białkami warstwy S przy użyciu kombinacji różnych metod analitycznych. W szczególności wiązanie Au jest bardzo atrakcyjne nie tylko dla odzysku Au z wód kopalnianych lub roztworów procesowych, ale także dla budowy materiałów, np . powierzchni sensorycznych. Do badań interakcji Au (Au(III) i Au(0)-NPs) z zawieszoną i rekrystalizowaną monowarstwą Slp1 białko musiało zostać wyizolowane. Dlatego badanie to wykazało udaną hodowlę szczepu bakterii Gram-dodatnich L. sphaericu...

Ze względu na rosnące wykorzystanie złota do wielu zastosowań, takich jak elektronika, katalizatory, biosensory czy instrumenty medyczne, popyt na ten cenny metal wzrósł w ciągu ostatnich kilku lat o 6-9. Złoto, podobnie jak wiele innych metali szlachetnych i ciężkich, jest uwalniane do środowiska poprzez ścieki przemysłowe w rozcieńczonych stężeniach, poprzez działalność wydobywczą i utylizację odpadów 7,8,10, chociaż większość zanieczyszczeń środowiska metalami ciężkimi lub szlachetnymi jest procesem ciągłym, spowodowanym głównie działalnością technologiczną. Prowadzi to do znacznej ingerencji w naturalne ekosystemy i może potencjalnie zagrozić zdrowiu ludzi 9 . Wiedza o tych negatywnych skutkach sprzyja poszukiwaniu nowych technik usuwania metali z zanieczyszczonych ekosystemów i poprawie recyklingu metali ze ścieków przemysłowych. Dobrze znane metody fizykochemiczne, takie jak wytrącanie lub wymiana jonowa, nie są tak skuteczne, zwłaszcza w mocno rozcieńczonych roztworach 7,8,11. Biosorpcja, zarówno z żywą, jak i martwą biomasą, jest atrakcyjną alternatywą dla oczyszczania ścieków 10,12. Stosowanie takich materiałów biologicznych może zmniejszyć zużycie toksycznych chemikaliów. Opisano wiele mikroorganizmów, które gromadzą lub unieruchamiają metale. Na przykład komórki Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 wykazały wysoką zdolność wiązania metali szlachetnych, np. Pd(II), Pt(II), Au(III) i innych metali toksycznych, takich jak Pb(II) lub U(VI) 4,13, komórki Bacillus megaterium dla Cr(VI) 14, komórki Saccharomyces cerevisiae dla Pt(II) i Pd(II) 15 oraz Chlorella vulgar dla Au(III) i U(VI) 16,17. Wiązanie poprzednich metali, takich jak Au(III), Pd(II) i Pt(II) zostało również zgłoszone dla Desulfovibrio desulfuricans18 i dla L. sphaericus JG-B53 19,20. Niemniej jednak nie wszystkie drobnoustroje wiążą duże ilości metali, a ich zastosowanie jako materiału sorpcyjnego jest ograniczone 12,21. Ponadto zdolność wiązania metali zależy od różnych parametrów, np. składu komórki, zastosowanego biokomponentu, czy warunków środowiskowych i doświadczalnych (pH, siła jonowa, temperatura itp.). Badanie izolowanych fragmentów ściany komórkowej 22,23, takich jak lipidy błonowe, peptydoglikan, białka lub inne składniki, pomaga zrozumieć procesy wiązania metali w złożonych zbudowanych całych komórkach 8,21.
Komponenty komórkowe, na których skupiono się w tym badaniu, to białka warstwy S. Białka warstwy S są częścią zewnętrznej otoczki komórkowej wielu bakterii i archeonów i stanowią około 15 - 20% całkowitej masy białkowej tych organizmów. Jako pierwszy interfejs ze środowiskiem, te związki komórkowe silnie wpływają na właściwości sorpcyjne bakterii 3. Białka warstwy S o masie cząsteczkowej od czterdziestu do setek kDa są wytwarzane w komórce, ale są składane na zewnątrz, gdzie są w stanie tworzyć warstwy na błonach lipidowych lub polimerowych składnikach ściany komórkowej. Po wyizolowaniu prawie wszystkie białka warstwy S mają wewnętrzną właściwość spontanicznego samoorganizowania się w zawiesinie, na granicy faz lub na powierzchniach tworzących płaskie lub rurkowate struktury 3. Grubość monowarstwy białkowej zależy od bakterii i mieści się w zakresie 5 - 25 nm 24. Ogólnie rzecz biorąc, utworzone struktury białkowe warstwy S mogą mieć symetrię ukośną (p1 lub p2), kwadratową (p4) lub sześciokątną (p3 lub p6) ze stałymi sieci od 2,5 do 35 nm 3,24. Tworzenie sieci wydaje się być w wielu przypadkach zależne od kationów dwuwartościowych, a głównie od Ca2 + 25,26, Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Niemniej jednak pełna kaskada reakcji fałdowania monomeru, oddziaływania monomer-monomer, tworzenia sieci oraz rola różnych metali, zwłaszcza kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+ i Mg2+, nadal nie są w pełni poznane.
Gram-dodatni szczep L. sphaericus JG-B53 (przemianowany z Bacillus sphaericus po nowej klasyfikacji filogenetycznej) 27 został wyizolowany ze składowiska odpadów wydobywczych uranu "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saksonia, Niemcy) 4,28,29. Jego funkcjonalne białko warstwy S (Slp1) ma kwadratową siatkę, masę cząsteczkową 116 kDa 30 i grubość ≈ 10 nm na żywych komórkach bakteryjnych 31. W poprzednich badaniach tworzenie in vitro zamkniętej i stabilnej warstwy białkowej o grubości około 10 nm osiągnięto w czasie krótszym niż 10 minut19. Pokrewny szczep L. sphaericus JG-A12, również izolat ze stosu "Haberland", ma wysoką zdolność wiązania metali, a jego izolowane białko warstwy S wykazało wysoką stabilność chemiczną i mechaniczną oraz dobre wskaźniki sorpcji dla metali szlachetnych, takich jak Au(III), Pt(II) i Pd(II) 4,32,33. To wiązanie metali szlachetnych jest mniej lub bardziej specyficzne dla niektórych metali i zależy od dostępności grup funkcyjnych na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni białka polimeru oraz w jego porach, sile jonowej i wartości pH. Istotnymi grupami funkcyjnymi dla interakcji białek z metalami są COOH-, NH2-, OH-, PO4-, SO4- i SO-. Zasadniczo, zdolności wiązania metali otwierają szerokie spektrum zastosowań,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)).np. jako składniki biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania rozpuszczonych metali toksycznych lub cennych, matryce do syntezy lub określonego osadzania nanocząstek metalicznych (NP) o regularnej strukturze do katalizy oraz inne materiały bioinżynieryjne, takie jak warstwy biosensoryczne 3,5,18,33. Regularnie rozmieszczone macierze NP, takie jak Au(0)-NPs, mogą być wykorzystywane do głównych zastosowań, takich jak elektronika molekularna i biosensory, urządzenia do przechowywania o ultrawysokiej gęstości i katalizatory do CO-oksydacji 34-37. Rozwój takich zastosowań i inteligentne projektowanie tych materiałów wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wiązania metali.
Warunkiem wstępnym dla rozwoju takich materiałów pochodzenia biologicznego jest niezawodna implementacja warstwy interfejsu między biomolekułą a powierzchnią techniczną 38,39. Na przykład polielektrolity zestawione techniką warstwa po warstwie (LbL) 40,41 zostały wykorzystane jako warstwa graniczna do rekrystalizacji białek warstwy S 39. Taki interfejs oferuje stosunkowo łatwy sposób na wykonanie powłoki białkowej w sposób powtarzalny i ilościowy. Przeprowadzając różne eksperymenty z modyfikacją i bez modyfikacji promotorów adhezyjnych, możliwe jest sformułowanie stwierdzeń dotyczących kinetyki powłoki, stabilności warstwy i interakcji metali z biomolekułami 19,42,Raff, J. i wsp. Nanokompozyty na bazie warstwy S do zastosowań przemysłowych w nanostrukturach inżynieryjnych opartych na białkach. (red. Tijana Z. Grove i Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (złożony)). Jednak złożony mechanizm adsorpcji białek i interakcji białko-powierzchnia nie jest w pełni zrozumiały. W szczególności nadal brakuje informacji na temat konformacji, orientacji wzoru i gęstości powłoki.
Technika mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D) przyciągnęła uwagę w ostatnich latach jako narzędzie do badania adsorpcji białek, kinetyki powlekania i procesów interakcji w skali nanometrowej 19,43-45. Technika ta pozwala na szczegółowe wykrywanie adsorpcji masy w czasie rzeczywistym i może być stosowana jako wskaźnik procesu samoorganizacji białek i sprzężenia funkcjonalnych cząsteczek na sieciach białkowych 19,20,42,46-48. Ponadto pomiary QCM-D otwierają możliwość badania procesów interakcji metali z warstwą białkową w naturalnych warunkach biologicznych. W niedawnym badaniu badano interakcję białka warstwy S z wybranymi metalami, takimi jak Eu(III), Au(III), Pd(II) i Pt(II) i Pt(II) za pomocą QCM-D 19,20. Zaadsorbowana warstwa białkowa może służyć jako uproszczony model ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Badania nad tym pojedynczym składnikiem mogą przyczynić się do głębszego zrozumienia interakcji metali. Jednak wyłącznie eksperymenty z QCM-D nie pozwalają na stwierdzenie struktury powierzchniowej i wpływu metali na białko. Do uzyskania takich informacji niezbędne są inne techniki. Jedną z możliwości obrazowania bio-nanostruktur i uzyskania informacji o właściwościach strukturalnych jest mikroskopia sił atomowych (AFM).
Celem prezentowanego badania było zbadanie sorpcji złota (Au(III) i Au(0)-NPs) do białek warstwy S, w szczególności Slp1 L. sphaericus JG-B53. Eksperymenty przeprowadzono z zawieszonymi białkami w skali partii w zakresie pH 2,0 - 5,0 przy użyciu ICP-MS oraz z unieruchomionymi warstwami S przy użyciu QCM-D. Dodatkowo zbadano wpływ roztworu soli metalu na stabilność sieci w kolejnych badaniach AFM. Połączenie tych technik przyczynia się do lepszego zrozumienia procesów interakcji metali in vitro jako narzędzia pozwalającego dowiedzieć się więcej o zdarzeniach wiązania całych komórek bakteryjnych w odniesieniu do określonych powinowactw do metali. Wiedza ta ma kluczowe znaczenie nie tylko dla opracowania odpowiednich materiałów filtracyjnych do odzysku metali w celu ochrony środowiska i zachowania zasobów 49, ale także dla opracowania matryc wysoce uporządkowanych metalicznych nanocząsteczek do różnych zastosowań technicznych.

<table><tbody><tr><td>sprzęt i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor, system pilotażowy Steam In Place 70L</td><td>Applikon Biotechnology, Holandia</td><td>Z6X</td><td>Zawiera czujniki pH dO2, czujniki pH Applikon Biotechnology i oprogramowanie BioXpert V2</td></tr><tr><td>Nieinwazyjny monitor biomasy BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td></td> <td>Spektrometr --- Z9X</td></tr><tr><td> Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Wielka Brytania</td><td>80-2109-10</td><td>Firma teraz GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td></tr><tr><td>MiniStar mikrowirówka</td><td>VWR, Niemcy</td><td>521-2844</td><td>Do wirowania próbek hodowlanych</td></tr><tr><td>Mikroskop systemu badawczego BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Niemcy</td><td>037006</td><td>Mikroskop w połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania</td></tr><tr><td>Cell^P (wersja 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml; nster, Niemcy---</td><td></td><td>razem z mikroskopem</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Floryda, USA</td><td>9010PLT</td><td>Do zbioru biomasy</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Niemcy</td><td>431-2601</td><td>Do usuwania wici i homogenizacji próbki</td></tr><tr><td>Wirówka Superspeed Sorvall Evolution RC</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>Stosowany w izolacji białek</td></tr><tr><td>Mobilny procesor płynów szybkotnących, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, USA</td><td>M110EH30K</td><td>Używany do pękania komórek</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC Liofilizator</td><td>Martin Christ Liofilizatory LLC, Osterode, Niemcy</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS spektrofotometria (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Do oznaczania białka stężenie</td></tr><tr><td>Pionowa komora do elektroforezy Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy</td><td>165-3322</td><td>Do SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Monachium, Niemcy</td><td>1708030</td><td>Służy do obrazowania żeli SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>Do oznaczania stężenia metalu</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire, Wielka Brytania</td><td>ZEN3600</td><td>Do oznaczania wielkości nanocząstek</td></tr><tr><td>Urządzenie Q-Sense E4&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja</td><td>QS-E4</td><td>zamówiony przez LOT quantum design (oprogramowanie dołączone do platformy E4)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (rejestracja danych)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (ocena i modelowanie danych)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduły przepływu QCM-D QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja</td><td>QS-QFM401</td><td>zamówiony przez LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 SiO2 piezoelektryczne czujniki kwarcowe AT-cut</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Szwecja</td><td>QS-QSX303</td><td>zamówione przez LOT quantum design</td></tr><tr><td>Komora do czyszczenia ozonu</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA</td><td>QS-ESA006</td><td>zamówione przez LOT quantum design</td></tr><tr><td>Mikroskop sił atomowych MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Oprogramowanie do pomiarów i obrazowania AFM</td> <td>MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AFM Asylum Research AR Version 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td></td>---<td>oprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 Oprogramowanie</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td></td>---<td>oprogramowanie do obrazowania zawarte w Cat. Nie. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Podgrzewacz</td><td>próbek do pomiarów AFM</td></tr><tr><td>Mini wspornik Biolever,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Niemcy LLC, Niemcy</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Preferowany wspornik do pomiarów AFM</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , Hiszpania</td><td>darmowe</td><td>oprogramowanie do analizy</td></tr> <tr><td>AFMNazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Detergenty i inne akcesoria </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas kwaśny, 100 % rocznie</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Niebezpieczne, łatwopalne i ciecze i pary. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu.</td></tr><tr><td>Przeciwpieniący 204</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A6426</td><td>Do tłumienia piany</td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza II ze śledziony świńskiej</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV , 2,000 - 6,000&nbsp; Kunitz jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>Etanol, 95%</td><td>VWR, Niemcy</td><td>20827.467</td><td>Niebezpieczeństwo, gliceryna łatwopalna</td></tr><tr><td>, p.a.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Niebezpieczeństwo; , używany do regulacji pH</td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>Liofilizowany proszek, białko = 90 %, = 40 000 jednostek/mg białka (Sigma)&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Niemcy</td><td>504.10100.00</td><td>Standardowe mieszadło w eksperymencie</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>Kwas azotowy (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Niebezpieczeństwo; Utleniający,</td></tr><tr><td>PageRuler Niebarwiona drabinka białkowa</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poli(4-styrenosulfonian sodu) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>243051</td><td>Średnia Mw ~ 70 000</td></tr><tr><td>Polietyleninina (PEI), oddział</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Ostrzeżenie; Szkodliwy, drażniący, niebezpieczny dla środowiska; średnia Mw ~ 25 000</td></tr><tr><td>Węglan potasu bezwodny (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Ostrzeżenie; Szkodliwa</td></tr><tr><td>rybonukleaza A z trzustki bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.</td><td>R5503</td><td>Typ I-AS, 50 - 100 jednostek Kunitza/mg białka&nbsp;</td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>Niebezpieczeństwo; bardzo toksyczny i niebezpieczny dla środowiska</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr> <tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L-5750</td><td>Niebezpieczeństwo; toksyczny</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Niebezpieczeństwo; , stosowane do regulacji pH w uprawie i regulacji pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, membrana do dializy, MWCO 50 000&nbsp;</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Niebezpieczeństwo; , stosowany do regulacji pH w uprawie</td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Ostrzeżenie; Szkodliwe, niebezpieczne dla środowiska</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50 000 MWCO Rurki ultrafiltracyjne</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>M6250</td><td>Niebezpieczeństwo, toksyczny</td></tr></tbody></table>

interakcja au polimerów slp1 i monowarstwy z lysinibacillus sphaericus jg-b53 - qcm-d, icp-ms i afm jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

W tej publikacji opisano zachowanie sorpcji złota białek warstwy powierzchniowej (warstwy S) (Slp1) Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Te biomolekuły układają się w parakrystaliczne dwuwymiarowe układy na powierzchniach, wiążą metale, a zatem są interesujące dla kilku zastosowań biotechnicznych, takich jak materiały biosorpcyjne do usuwania lub odzyskiwania różnych pierwiastków ze środowiska i procesów przemysłowych. Osadzanie nanocząstek Au(0) na warstwach S, zarówno poprzez syntezę ukierunkowaną warstwy S1, jak i adsorpcję nanocząstek, otwiera nowe możliwości dla różnorodnych zastosowań sensorycznych. Chociaż liczne badania opisały właściwości biosorpcyjne warstw S 2-5, głębsze zrozumienie interakcji białko-białko i białko-metal nadal pozostaje wyzwaniem. W poniższym badaniu zastosowano spektrometrię mas sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) do wykrywania sorpcji metali przez zawieszone warstwy S. Zostało to skorelowane z pomiarami mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem rozpraszania (QCM-D), która umożliwia wykrywanie online tworzenia się monowarstw białkowych i osadzania metali, a tym samym bardziej szczegółowe zrozumienie wiązania metali.
Wyniki ICP-MS wskazują, że wiązanie Au(III) z zawieszonymi polimerami warstwy S jest zależne od pH. Maksymalne wiązanie Au(III) uzyskano przy pH 4,0. Badania QCM-D umożliwiły wykrycie sorpcji Au(III), a także osadzanie Au(0)-NPs w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów in situ. Co więcej, metoda ta pozwoliła na zbadanie wpływu wiązania metali na stabilność sieci białkowej Slp1. Właściwości strukturalne i stabilność warstwy białkowej można było zobrazować bezpośrednio po eksperymencie QCM-D przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Podsumowując, połączenie tych różnych metod zapewnia głębsze zrozumienie wiązania metali przez bakteryjne białka warstwy S w zawiesinie lub w postaci monowarstw na komórkach bakteryjnych lub zrekrystalizowanych powierzchniach.

Kulturyzacja mikroorganizmów i charakterystyka białka Slp1
Zarejestrowane dane dotyczące wzrostu bakterii wskazują na zakończenie fazy wzrostu wykładniczego po około 5 godzinach. Poprzednie badania wykazały, że Slp1 można wyizolować w tym punkcie zbioru (4,36 g/L masy wilgotnej (≈ 1,45 g/L (BDW)) z maksymalnym wydajnością19. Niemniej jednak optymalizacja hodowli poprzez zastosowanie zdefiniowanych skł...

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie właściwości sorpcji złota przez białka warstwy S zaprezentowanego szczepu bakteryjnego z punktu widzenia ekologicznego i technologicznego. Metody te pozwalają odpowiedzieć na kluczowe pytania w naukach środowiskowych, takich jak procesy sorpcji oraz usuwanie i odzyskiwanie metali. Główną zaletą tych technik jest możliwość wykrycia sorpcji metali i adsorpcji nanocząsteczek w różnych zakresach skal.Dzięki zastosowaniu QCM-D możliwe jest wykrycie tego zjawiska w pomiarze w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyposażyć cele przepływowe w atrapy sensorów. Przez system QCM-D i układ rurek należy przepompować co najmniej 20 mililitrów na moduł 2% alkalicznego środka czyszczącego w wodzie ultrapurej.Następnie, zgodnie z protokołem producenta, przepompuj przez system pięciokrotność objętości każdego modułu wody ultrapurej z przepływem do 300 microliters per minute. Oczyść czujniki z dwutlenku krzemu znajdujące się poza modułami przepływowymi poprzez inkubację w 2% roztworze sodium dodecyl sulfate przez co najmniej 20 minut. Następnie kilkukrotnie wypłucz czujniki wodą ultrapurej.Po osuszeniu kryształów filtrowanym sprężonym powietrzem, należy umieścić je w komorze do czyszczenia ozonem na 20 minut. Następnie należy dwukrotnie powtórzyć procedurę czyszczenia, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia organiczne. W celu usunięcia metali związanych z powierzchni sensora, należy przepłukać sensory jednomolowym kwasem azotowym.Następnie należy kilkakrotnie przepłukać czujniki wodą ultrapure. W kolejnym kroku modyfikuje się czujniki, nanosząc naprzemienne warstwy polietyleniminy i polistyrenosulfonianu w stężeniu 3 g/L metodą dip coating z wykorzystaniem techniki warstwa po warstwie (LBL). Czujniki umieszcza się w odpowiednim roztworze polielektrolitu w płytkach głębokich i inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wyjmij czujniki z roztworu polielektrolitu i intensywnie płucz je wodą ultrapure przed każdym kolejnym etapem powlekania metodą dip-coatingu. Po zakończeniu modyfikacji zewnętrznej umieść czujniki w module przepływowym. Przed rozpoczęciem eksperymentów przeprowadź równoważenie czujników, płucząc je wodą ultrapure.Na tym etapie rozpuścić wcześniej wyizolowane i oczyszczone białko Slp1 w moczniku w celu konwersji polimerów w monomery. Odwirować zmonomeryzowane białka z prędkością 15 000 ×g w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę, aby usunąć większe agregaty białkowe. Wymieszać znadfiltrat rozpuszczonego i odwirowanego białka Slp1 z buforem do rekrystalizacji, aby uzyskać końcowe stężenie białka 0,2 g/L.Po pomyślnej rekrystalizacji białka na powierzchni sensorów zmodyfikowanych polielektrolitem wewnątrz modułów przepływowych, intensywnie płucz pokryte sensory buforem do rekrystalizacji z szybkością przepływu 125 µL/min, aż do wykrycia stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i dyssypacji. Po pomyślnym pokryciu warstwą Slp1 w modułach przepływowych, intensywnie płucz uzyskaną warstwę Slp1 buforem cytrynianowym 1,6 mM o pH 5,0, aż do wykrycia stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i dyssypacji. Następnie pompuj wcześniej przygotowany 1 mM roztwór nanocząstek do modułów przepływowych z szybkością przepływu 125 µL/min.Następnie monitoruj adsorpcję masy do warstwy Slp1. Po zakończeniu oddziaływania z nanocząsteczkami metalu przepłucz warstwę buforem wolnym od nanocząsteczek, aby usunąć słabo związane metale lub nanocząsteczki. Używając mikroskopu sił atomowych (AFM) z odwróconym mikroskopem optycznym, zarejestruj obrazy w cieczy przy użyciu wody ultraczystej bezpośrednio na powlekonych sensorach QCM-D.Po zakończeniu eksperymentów QCM-D opłukać sensory wodą ultrapure i umieścić je w celi płynnej AFM. Użyć wspornika o częstotliwości rezonansowej w wodzie wynoszącej około 25 kHz i sztywności poniżej 0,1 N/m. Prędkość skanowania ustawić w zakresie od 2,5 do 10 µm/s.Należy wykonać obrazy w dynamicznym trybie kontaktowym, podczas gdy wspornik jest wzbudzany przez piezoelektryk z jego częstotliwością rezonansową. Na koniec należy określić odległość wspornika od powierzchni na podstawie tłumienia oscylacji. Maksymalne pojemności wiązania metalu dla złota trzy z zawieszonym Slp1 wskazują, że było ono stabilnie związane podczas 24-godzinnej inkubacji w badanym zakresie pH.Natychmiastowy spadek częstotliwości wskazuje na szybką adsorpcję oraz wysokie powinowactwo białek do powierzchni modyfikowanej polielektrolitem. Dyssypacja również gwałtownie wzrasta, co świadczy o adsorpcji cząsteczek wiskoelastycznych na powierzchni ze względu na szybkie tłumienie skutkujące wzrostem wartości dyssypacji. Wstępnie zsyntetyzowane nanocząsteczki złota inkubowano z Slp1, a następnie poddano analizie SDS-PAGE, co zweryfikowało dane QCM-D, wykazując, że nanocząsteczki nie zaburzają struktury Slp1.Adsorpcja wcześniej zsyntetyzowanych nanocząsteczek złota metalicznego o rozmiarze zero została przedstawiona dla eksperymentów QCM-D na wykresach delta F-delta D oraz w postaci profili grubości i masy. Przedstawiono tutaj sieć białkową Slp1 rekrystalizowaną na sensorach modyfikowanych polielektrolitem. Stałą sieci określono na 13 do 14 nanometrów, a grubość warstwy wyniosła 10 plus lub minus dwa nanometry.Badania AFM potwierdziły, że po interakcji z Au(III) sieć Slp1 pozostała całkowicie nienaruszona, co potwierdza wyniki QCM-D przewidujące stabilność powłoki. AFM potwierdza adsorpcję nanocząsteczek Au(0) na sieci Slp1, jednak ze względu na rozmiar cząsteczek nie zachowują one symetrii p4 białka Slp1. Po opanowaniu metody, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia roboczego.Po zastosowaniu tych metod można przeprowadzić inne techniki, takie jak spektroskopia w podczerwieni lub mikroskopia jonowa helu, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, np. dotyczące specyficznych miejsc wiązania lub oddziaływań ze złotem bądź nanocząsteczkami złota. Przedstawiona technika utorowała drogę uzrachem do badania oddziaływań biomolekuł z metalami, a na przykład zachowania adsorpcji i desorpcji na różnych rodzajach powierzchni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać oddziaływania metali z rozpuszczalnikami biologicznymi; prosimy, aby podczas stosowania tej metody nie zapominać o używaniu okularów ochronnych, fartucha laboratoryjnego oraz oczywiście rękawiczek.

au-interaction-slp1-polymers-monolayer-from-lysinibacillus-sphaericus

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.

In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Poznaj metody badania sorpcji złota przez białka S-warstwy z Lysinibacillus sphaericus przy użyciu QCM-D, ICP-MS i AFM. Techniki te umożliwiają wykrywanie adsorpcji nanocząstek w czasie rzeczywistym.

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali (Wideo) | JoVE Journal

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Przeglądaj więcej filmów