Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Ogólnym celem eksperymentu jest zbadanie zachowania się białka warstwy S prezentowanego szczepu bakterii przez sorpcję złota z ekologicznego i technologicznego punktu widzenia. Metody te mogą odpowiedzieć na kluczowe pytanie w naukach związanych z ochroną środowiska w takich dziedzinach jak procesy sorpcyjne oraz usuwanie i odzysk metali. Główną zaletą tych technik jest to, że można wykryć sorpcję metali i adsorpcję nanocząstek w innym zakresie skali.

Dzięki zastosowaniu QCM-D możliwe jest wykrycie tego w pomiarze w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć tę procedurę, wyposaż komórki płynu w manekiny czujników. Przepompuj co najmniej 20 mililitrów na moduł 2% alkalicznego płynnego środka czyszczącego w ultraczystej wodzie przez QCM-D i system rurek.

Następnie przepompuj przez system pięciokrotną objętość ultraczystej wody na moduł o natężeniu przepływu do 300 mikrolitrów na minutę zgodnie z protokołem producenta. Wyczyść czujniki dwutlenku krzemu na zewnątrz modułów przepływowych przez inkubację w 2% roztworze dodecylosiarczanu sodu przez co najmniej 20 minut. Następnie kilkakrotnie przepłucz czujniki ultraczystą wodą.

Po wysuszeniu kryształów przefiltrowanym sprężonym powietrzem umieść je w komorze do czyszczenia ozonem na 20 minut. Następnie powtórz procedurę czyszczenia dwukrotnie, aby usunąć całą zawartość organiczną. Aby usunąć związane metale z powierzchni czujnika, przepłucz czujniki jednym molowym kwasem azotowym.

Następnie kilkakrotnie przepłucz czujniki ultraczystą wodą. Następnie zmodyfikuj czujniki za pomocą trzech gramów na litr naprzemiennych warstw polietylenininu i sulfonianu polistyrenu poprzez powlekanie zanurzeniowe warstwa po warstwie lub techniką LBL. Umieść czujniki w odpowiednim roztworze polielektrolitu na płytkach głębinowych i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie wyjmij czujniki z roztworu polielektrolitu i intensywnie przepłucz je między każdym etapem powlekania zanurzeniowego wodą ultraczystą. Po zakończeniu modyfikacji zewnętrznej umieść czujniki wewnątrz modułu przepływu. Zrównoważ czujniki, przepłukując je ultraczystą wodą przed rozpoczęciem eksperymentów.

W tym momencie rozpuść wcześniej wyizolowany i oczyszczony Slp1 w formule mocznikowej w celu przekształcenia polimerów w monomery. Odwiruj monomeryzowane białka w temperaturze 15 000 g i 4 stopni Celsjusza przez godzinę, aby usunąć większe aglomeraty białkowe. Wymieszać rozpuszczony i odwirowany supernatant Slp1 z buforem rekrystalizacyjnym do końcowego stężenia białka 0,2 grama na litr.

Po udanej rekrystalizacji białek na czujnikach zmodyfikowanych polielektrolitem wewnątrz modułów przepływowych, należy intensywnie przepłukać powlekane czujniki buforem rekrystalizacyjnym z natężeniem przepływu 125 mikrolitrów na minutę, aż do wykrycia stabilnych wartości częstotliwości i przesunięć dyssypacji. Po udanym pokryciu Slp1 w modułach przepływowych, otrzymaną warstwę Slp1 należy intensywnie przepłukać 1,6 milimolowym buforem cytrynianowym o pH 5,0, aż do wykrycia stabilnych wartości przesunięć częstotliwości i rozpraszania. Następnie pompuj wcześniej przygotowany jednomilimolowy roztwór nanocząstek do modułów przepływowych o natężeniu przepływu 125 mikrolitrów na minutę.

Następnie śledź adsorpcję masy do warstwy Slp1. Po zakończeniu interakcji nanocząstek metalu przepłucz warstwę buforem wolnym od nanocząstek, aby usunąć słabo związane metale lub nanocząstki. Za pomocą mikroskopu sił atomowych lub AFM z odwróconym mikroskopem optycznym rejestruj obrazy w cieczy za pomocą ultraczystej wody bezpośrednio na powlekanych czujnikach QCM-D.

Po eksperymentach QCM-D przepłucz czujniki ultraczystą wodą i umieść je w komorze płynu AFM. Użyj wspornika o częstotliwości rezonansowej około 25 kiloherców w wodzie i sztywności mniejszej niż 0.1 niutona na metr. Dostosuj prędkość skanowania w zakresie od 2,5 do 10 mikrometrów na sekundę.

Rób zdjęcia w dynamicznym trybie kontaktowym, gdy wspornik jest wzbudzany przez piezoelektryczny o częstotliwości rezonansowej. Na koniec określ odległość wspornika od powierzchni za pomocą tłumienia oscylacji. Maksymalne zdolności wiązania metalu przez zawieszony Slp1 złota wskazują, że było ono stabilnie związane podczas 24-godzinnej inkubacji w badanym zakresie pH.

Natychmiastowy spadek częstości wskazuje na szybką adsorpcję i wysokie powinowactwo białek do powierzchni zmodyfikowanej polielektrolitem. Rozpraszanie również wzrasta natychmiast, co wskazuje na adsorpcję cząsteczek lepkosprężystych na powierzchni z powodu szybkiego tłumienia, co skutkuje wzrostem wartości rozpraszania. Wstępnie zsyntetyzowane nanocząstki złota zero inkubowano z Slp1 i analizowano za pomocą SDS-PAGE, który zweryfikował dane QCM-D pokazujące, że nanocząstki nie zaburzają struktury Slp1.

Adsorpcja wstępnie zsyntetyzowanych metalicznych nanocząstek złota zerowego pokazano w eksperymentach QCM-D na wykresach delta F-delta D oraz jako profile grubości i masy. Sieć białkowa Slp1 rekrystalizowana na czujnikach modyfikowanych polielektrolitem jest pokazana tutaj. Stałą sieci określono na 13 do 14 nanometrów, a grubość warstwy stwierdzono na 10 plus minus dwa nanometry.

Badania AFM potwierdziły, że po interakcji złotej trójki sieć Slp1 pozostała całkowicie nienaruszona, co potwierdza wyniki QCM-D, które przewidywały stabilność powłoki. AFM weryfikuje adsorpcję nanocząstek złota zero na sieci Slp1, ale ze względu na wielkość cząstek nie są one zgodne z symetrią p4 Slp1. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia roboczego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podążając za tymi metodami, można wykonać inne techniki, takie jak spektroskopia w podczerwieni lub mikroskopia jonów helu, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, takie jak specyficzne widoki wiązania lub interakcja ze złotem lub nanocząstkami złota. Zaprezentowana technika utorowała drogę uzrachemowi do badania oddziaływań biomolekuł z metalami oraz na przykład zachowania adsorpcji i dysorpcji na różnego rodzaju powierzchniach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak badać interakcje metali z rozpuszczalnikami biologicznymi i nie zapomnij użyć okularów, fartucha laboratoryjnego i oczywiście rękawiczek, gdy korzystasz z tej metody.