Indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo
31 marca 2016
Ta procedura wykonuje długotrwałe wewnątrzkomórkowe zapisy in vivo z pojedynczych neuronów podczas fizjologicznie istotnych stanów mózgowych i po całkowitym zniesieniu trwających czynności elektrycznych, co skutkuje izoelektrycznym stanem mózgu. Stałe fizjologiczne zwierzęcia są dokładnie monitorowane podczas przejścia w stan sztucznej śpiączki.
Ogólnym celem tego protokołu jest wywołanie ogólnego stanu bezczynności mózgu in vivo w celu zbadania właściwości zintegrowanych pojedynczych neuronów przy braku wejść synaptycznych. Metoda, którą tu prezentujemy, może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurofizjologii, takie jak ocena wpływu aktywności sieci na obliczenia pojedynczych komórek czy badanie responsywności neuronów w stanach śpiączki. Główną zaletą tej techniki jest to, że właściwości neuronalne można badać w izolacji od sieci w nienaruszonym preparacie in vivo.
Aby rozpocząć tę procedurę, umieść w pełni znieczulonego szczura na kocu grzewczym. Włóż sondę doodbytniczą do zwierzęcia, aby utrzymać temperaturę rdzenia około 37 stopni Celsjusza. Aby umieścić cewnik w jamie otrzewnej, aby ułatwić późniejsze wstrzyknięcie środków znieczulających, najpierw usuń włosy z niewielkiego obszaru w prawym lub lewym kwadrancie żołądka za pomocą kremu do depilacji.
Po wstrzyknięciu środka znieczulającego miejscowo wysterylizuj miejsce operacyjne i wykonaj dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie na skórze ostrymi nożyczkami. Za pomocą nożyczek usuń warstwy tłuszczu i mięśni, aż jama otrzewnej będzie widoczna. Następnie wprowadź około jednego do dwóch centymetrów małego cewnika do jamy i zamknij ranę klejem chirurgicznym.
Zrób pętlę i przyszyj cewnik do skóry, aby zabezpieczyć go na miejscu. Aby zainstalować rurkę dotchawiczą w celu kontrolowania wentylacji podczas sztucznego oddychania, usuń włosy, wysterylizuj miejsce i nacij skórę nad tchawicą tuż nad brzuchem. rozkrój pierwszą warstwę tłuszczu i mięśni.
Odsuń gruczoł ślinowy na bok i odsłoń tchawicę, delikatnie preparując ostatnią warstwę mięśni. Ostrożnie odizoluj tchawicę i wsuń nić pod nią za pomocą małych kleszczyków. Następnie wykonaj luźny węzeł chirurgiczny za pomocą nici.
Naciąć tchawicę poprzecznie między dwoma pierścieniami chrzęstnymi. Następnie włóż rurkę dotchawiczą o odpowiedniej średnicy i zaciśnij węzeł gwintu, aby zabezpieczyć rurkę. Aby uzyskać dodatkową stabilność, gwint można dodatkowo przymocować do wyższego punktu rurki tchawicy.
Zszyj lub użyj zszywek chirurgicznych, aby zamknąć ranę. Następnie przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej i nałóż maść do oczu, aby uniknąć wysuszenia. Następnie umieść odpowiednie sondy, aby monitorować jego zmienne fizjologiczne, takie jak elektrokardiogram, nasycenie krwi tlenem i końcowe ciśnienie pływowego dwutlenku węgla.
Następnie usuń włosy ze skóry głowy i wysterylizuj miejsce operowane. Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie wzdłużne i wytnij tkanki łączne pokrywające czaszkę za pomocą skalpela. Następnie nałóż klej chirurgiczny na czaszkę i tkanki, aby ustabilizować preparat.
Następnie wykonaj małą kraniotomię o średnicy 1,5 milimetra w obszarze zainteresowania za pomocą wiertła dentystycznego. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczy i nożyczek do żył, aby delikatnie zrobić mały otwór w oponie twardej. Rezerwa 0,5 milimetra w obrębie trepanacji czaszki na umieszczenie elektrody elektrokortykograficznej.
Upewnij się, że kora mózgowa jest wilgotna 0,9% roztworem chlorku sodu lub aCSF. Następnie umieść elektrodę referencyjną na przeciwległym mięśniu skóry głowy i umieść elektrodę elektrokortykograficzną o niskiej impedancji na oponie twardej. Dostosuj system sztucznej wentylacji tak, aby częstotliwość i objętość oddechu były podobne do spontanicznego oddychania szczura.
Jeśli wszystkie zmienne fizjologiczne i wzorce elektrokortykograficzne mieszczą się w normalnych wartościach, wstrzyknij trietiodek galaminy w każdą nogę, aby sparaliżować zwierzę. Następnie podłącz wentylację mechaniczną do rurki dotchawiczej i sprawdź, czy klatka piersiowa jest prawidłowo napompowana po obu stronach. Na tym etapie wyciągnij szklaną mikropipetę z końcówką o średnicy 0,2 mikrometra i napełnij ją dwoma molowymi roztworami octanu potasu.
Umieść pipetę w specjalnym uchwycie z drutem ze srebra/chlorku srebra, aby podłączyć roztwór pipety do wzmacniacza wewnątrzkomórkowego. Następnie umieść elektrodę referencyjną srebra/chlorku srebra na mięśniach szyi szczura. Umieść pipetę nad obszarem zainteresowania.
Powoli włóż pipetę do mózgu na żądaną głębokość za pomocą przycisku brzęczenia amplifier, aby w razie potrzeby wyczyścić pipetę. Kompensacja rezystancji pipety poprzez wyzerowanie spadków napięcia w odpowiedzi na kroki prądu za pomocą obwodu mostka wzmacniacza. Następnie użyj bawełnianych wacików lub syntetycznych trójkątów absorpcyjnych, aby wysuszyć kraniotomię i przykryj ją elastomerem silikonowym lub 4% agarozą, aby zmniejszyć ruchy mózgu.
Następnie obniżaj pipetę w krokach co jeden lub dwa mikrometry, aż jej opór wzrośnie podczas zbliżania się do komórki. Użyj funkcji brzęczenia wzmacniacza, aby wniknąć do neuronu. Gdy zapis jest stabilny, skompensuj rezystancję elektrody, dostosowując parametr mostka, podczas gdy małe kroki prądów są wstrzykiwane do neuronu.
Następnie wykonaj odpowiedni protokół eksperymentalny, taki jak wstrzyknięcie prądu wewnątrzkomórkowo w celu wydobycia wewnętrznych właściwości neuronu lub wykonaj stymulacje sensoryczne. Następnie wstrzyknąć wysoką, ale podśmiertną dawkę pentobarbitalu sodu przez linię dootrzewnową. W ciągu 15 do 20 minut aktywność wewnątrzkomórkowa i elektrokortykograficzna powinna zwolnić z przerywaną ciszą elektryczną, aby przejściowo osiągnąć tak zwany profil tłumienia impulsów, który stopniowo zapada się do pełnego stanu izoelektrycznego.
Oczekuje się, że tętno znacznie zwolni, ale SPO2 i EtCO2 powinny pozostać względnie stabilne. Następnie powtórz protokół stymulacji, aby porównać wpływ dynamiki sieci na zarejestrowane właściwości integracyjne neuronów. Po zaprzestaniu wstrzykiwań znieczulających, elektryczna aktywność mózgu powinna w pełni odzyskać w ciągu czterech godzin.
Rysunek ten pokazuje spontaniczne czynności wewnątrzkomórkowe i elektrokortykogram w dwóch stanach znieczulających, naśladując dynamikę kory mózgowej generowaną endogennie we wczesnych fazach snu lub podczas czuwania. Stan podobny do snu jest wywoływany przez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu, a stan podobny do czuwania przez fentanyl. W obu przypadkach późniejsze wstrzyknięcie dużej dawki pentobarbitalu sodu skutkowało całkowitym zniesieniem spontanicznej aktywności w ECOG i jednocześnie zarejestrowanych neuronach, stąd określenie izoelektryczność.
Tłumienie trwającej aktywności synaptycznej spowodowało istotną hiperpolaryzację potencjału błony neuronalnej w badaniu. Odpowiedzi wywołane prądem mogą być generowane przed i po indukcji stanu izoelektrycznego. Pozwala to na porównanie różnych czynności mózgowych w funkcji transferu sygnału wejściowego i wyjściowego neuronów, wyrażonej jako główna wywołana szybkość wyzwalania w odpowiedzi na bieżące kroki o rosnącej intensywności.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu zwierzęcia w jak najlepszych warunkach fizjologicznych, aby uzyskać dobrej jakości zapis związany z naszą wiarygodną dynamiką mózgową. Podejście to może być dalej wykorzystywane jako model do badania reakcji neuronów w nieodwracalnych lub odwracalnych stanach głębokiej śpiączki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza procedura obejmuje długotrwałe wewnątrzkomórkowe rejestracje in vivo z pojedynczych neuronów podczas fizjologicznie istotnych stanów mózgu oraz po całkowitym zniesieniu trwającej aktywności elektrycznej, co prowadzi do stanu izoelektrycznego mózgu. Stałe fizjologiczne zwierzęcia są starannie monitorowane podczas przejścia w sztuczny stan śpiączki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurofizjologia
- Techniki rejestracji in vivo
- Nieaktywność mózgowa
Wprowadzenie
- Zrozumienie właściwości pojedynczego neuronu jest kluczowe dla neurofizjologii.
- Badanie neuronów w izolacji od aktywności sieciowej dostarcza unikalnych informacji.
- Wywołanie stanu śpiączki pozwala na badanie odpowiedzi neuronalnych bez sygnałów synaptycznych.
- Utrzymanie stałych parametrów fizjologicznych jest niezbędne podczas przeprowadzania doświadczeń.
Cel badania
- Badanie zintegrowanych właściwości pojedynczego neuronu w warunkach braku sygnałów synaptycznych.
- Ocena wpływu aktywności sieci na obliczenia w pojedynczej komórce.
- Badanie reaktywności neuronów w stanach śpiączki.
Zastosowane metody
- Indukcja ogólnego stanu nieaktywności mózgowej in vivo.
- Długotrwałe rejestracje wewnątrzkomórkowe z pojedynczych neuronów.
- Monitorowanie parametrów fizjologicznych podczas procedury.
- Stosowanie środków anestetycznych w celu podtrzymania stanu śpiączki.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja właściwości neuronalnych od wpływów sieciowych.
- Wgląd w zachowanie neuronów w warunkach wywołanego stanu śpiączki.
- Wykazanie skuteczności metody w badaniu pojedynczych neuronów.
- Wkład w zrozumienie roli wejść synaptycznych w obliczeniach neuronalnych.
Wnioski
- Technika ta umożliwia szczegółowe badanie właściwości neuronów in vivo.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań nad zachowaniem neuronów w stanach zmienionych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wnioski z tych odkryć w zakresie neurofizjologii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wyizolowanie wewnętrznych właściwości neuronów poprzez tłumienie endogennej aktywności sieci, zapewniając kontrolowany model do ograniczania ryzyka w procesie walidacji celów w neurofarmakologii. Porównując integracyjne właściwości neuronów w fizjologicznym i izoelektrycznym stanie mózgu, badacze mogą ocenić wpływ związków na obliczenia na poziomie pojedynczej komórki, niezależnie od zakłócających sygnałów synaptycznych. Podejście to wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków, wyjaśniając, czy obserwowane efekty działania leku wynikają z bezpośredniej modulacji neuronów, czy z zjawisk pośredniczących w sieci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez oddzielenie wewnętrznej pobudliwości neuronów od modulacji sterowanej przez sieć.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne przygotowanie in vivo do rozróżnienia bezpośredniego działania związku na neurony od pośrednich działań pośredniczonych przez sieć.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę pewności celu poprzez wykazanie, czy efekt związku utrzymuje się w przypadku braku endogennej aktywności synaptycznej.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników elektrofizjologicznych (np. częstotliwości wyładowań wywołanych w odpowiedzi na skoki prądu) w kontrolowanych warunkach wyciszenia sieci.
- Wartość operacyjna: Ustanawia zstandardowaną linię bazową dla przesiewu związków poprzez wyeliminowanie zmienności wynikającej z spontanicznej dynamiki mózgowej.
- Gotowość testu: Umożliwia wiarygodne porównanie funkcji przejścia wejście-wyjście w różnych warunkach testowych, co wspiera skalowalną ocenę modulatorów neuronalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy ostre fenotypy neuronalne in vivo z systemami istotnymi dla choroby, wyjaśniając wkład wewnętrzny w przeciwieństwie do wkładu zależnego od sieci w obliczenia neuronalne.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pomaga odróżnić docelowe efekty neuronalne od pozadocelowej modulacji sieci podczas optymalizacji wiodących związków.
- Pewność predykcyjna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez walidację, czy efekty związku są zachowane w stanie pozbawionym synaps.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając analizę mechanistyczną przed kampaniami przesiewowymi fenotypowymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolowanie właściwości neuronalnych w celu wyjaśnienia mechanizmów działania związków neuroaktywnych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych wyników ilościowych (np. częstotliwość wyładowań w funkcji natężenia prądu) w warunkach standaryzowanej nieaktywności mózgu.
- Analityka: Zapewnia pomiary elektrofizjologiczne (funkcje przejścia wejście-wyjście), które umożliwiają obiektywne porównanie odpowiedzi neuronalnych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy ostre fenotypy neuronalne z walidacją przedkliniczną poprzez odróżnienie bezpośredniego oddziaływania na cel od efektów pośredniczonych przez sieć.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę elektrofizjologiczną do oceny różnych klas związków w ramach wielu projektów neurofarmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w neurofarmakologii, umożliwiając bezpośrednią ocenę wpływu związków na pojedyncze neurony.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację fenotypowania neuronalnego poprzez tłumienie zmiennej endogennej aktywności sieci.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie mechanizmów oddziaływania na cel, redukując ryzyko niepowodzenia na późnym etapie z powodu nieoczekiwanych zależności sieciowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez walidację, czy efekty związku są immanentne dla celu, czy zależne od stanu sieci.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii in vivo, przygotowania chirurgicznego oraz zarządzania znieczuleniem.
- Zależne od stabilnego monitorowania parametrów fizjologicznych (temperatury, natlenienia, wentylacji) w celu zachowania integralności danych podczas długotrwałych pomiarów.
- Wymaga precyzyjnego umieszczania elektrod wewnątrzczaszkowych oraz zastosowania technik rejestracji wewnątrzkomórkowej w celu stabilnego dostępu do pojedynczych neuronów.
- Wiąże się z wyzwaniami technicznymi w zakresie utrzymania nieaktywności mózgu przy jednoczesnym zapewnieniu dobrostanu zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu.
- Ograniczone do ostrych okien eksperymentalnych ze względu na wywołany głęboki stan fizjologiczny, co uniemożliwia zastosowanie podłużnych planów badań.
