Name: Indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę indukcji izoelektrycznego stanu mózgu u szczurów w celu badania właściwości pojedynczych neuronów bez wpływu aktywności sieciowej. Technika ta umożliwia analizę pobudliwości komórek nerwowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fondation de France, Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, Uniwersytetu Pierre & Marie Curie oraz programu 'Investissements d'avenir' ANR-10-IAIHU-06.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej (dyrektywa 2010/63/UE) i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Charlesa Darwina ds. Doświadczeń na Zwierzętach. Opisujemy tutaj procedurę, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium, jednak większość kroków można dostosować do konkretnych potrzeb każdego.
1. Przygotowanie chirurgiczne
Uwaga: Wszystkie miejsca nacięcia i nacisku powinny być wielokrotnie nakłuwane miejscowo środkiem znieczulającym (lidokaina lub bupiwakaina). Obecna procedura jest ostateczna, jeśli wymagane jest przygotowanie aseptyczne, należy wprowadzić kilka modyfikacji.
<ol>
	<li>Znieczulić szczura pentobarbitalem sodu (40 mg/kg) i ketaminą (50 mg/kg) w dwóch miejscowo oddzielonych wstrzyknięciach dootrzewnowych (IP).</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu przejść pod znieczulenie ogólne i wielokrotnie sprawdzaj, czy osiągnięto chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (brak reakcji na szczypanie palca). Umieść szczura na kocu grzewczym ze sprzężeniem zwrotnym i włóż sondę doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę rdzenia około 37 °C.</li>
	<li>Umieścić cewnik w jamie otrzewnej, aby ułatwić późniejsze wstrzyknięcie środków znieczulających i uniknąć perforacji narządów przez wielokrotne nakłucia igłą 30.
	<ol>
		<li>Przypnij włosy na małym (~2 - 3 mm) obszarze nad obszarem znajdującym się w prawym lub lewym dolnym kwadrancie brzucha. 
		Uwaga: Można również użyć kremu do depilacji. </li>
		<li>Wykonaj nacięcie na skórze o średnicy 2-3 mm ostrymi nożyczkami lub skalpelem. Za pomocą rozwarstwienia usuń warstwy tłuszczu i mięśni, aż do zaobserwowania jamy otrzewnej.</li>
		<li>Wprowadzić około 1 - 2 cm małego cewnika do jamy i zamknąć ranę klejem chirurgicznym. 
		Uwaga: Średnica i całkowita długość cewnika powinny być minimalne (np. 2 francuskie - co odpowiada 0,043 mm średnicy wewnętrznej), aby zmniejszyć martwe objętości. Najbardziej odpowiednie są rurki poliuretanowe.</li>
		<li>Zrób pętlę i przyszyj cewnik do skóry, aby zabezpieczyć go na miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj rurkę dotchawiczą, aby kontrolować wentylację podczas sztucznego oddychania.
	<ol>
		<li>Podobnie jak w poprzednim kroku, przygotuj obszar zainteresowania (1 - 2 cm nad tchawicą tuż nad brzuchem), usuń włosy i naciąć skórę.</li>
		<li>Tępo rozetnij pierwsze warstwy tłuszczu i mięśni, a następnie odsuń gruczoł ślinowy na bok i odsłoń tchawicę, delikatnie preparując ostatnią warstwę mięśni.</li>
		<li>Ostrożnie usuń tkanki z tchawicy i wsuń nić pod nią za pomocą małych kleszczyków. Zrób węzeł chirurgiczny za pomocą nici, ale jeszcze go nie zaciskaj.</li>
		<li>Naciąć tchawicę poprzecznie między dwoma chrzęstnymi pierścieniami. Wymaz krew z tchawicy, jeśli występuje.</li>
		<li>Włóż rurkę dotchawiczą o odpowiedniej średnicy i dokręć węzeł gwintu, aby stabilnie zabezpieczyć rurkę. Aby uzyskać dodatkową stabilność, gwint można dodatkowo przymocować w wyższym punkcie rurki tchawicy.</li>
		<li>Zszyj ranę, zamknij lub użyj zszywek chirurgicznych. Unikaj kleju chirurgicznego, jeśli rurka dotchawicza ma być ponownie użyta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj zwierzę w ramie stereotaktycznej i uważnie monitoruj następujące zmienne fizjologiczne: ECoG, SpO2, EtCO2, tętno (za pomocą elektrokardiogramu, EKG) i temperaturę wewnętrzną. Monitoruj i dostosowuj te zmienne, aby utrzymać odpowiednią głębokość znieczulenia i stan fizjologiczny. W szczególności należy uzupełnić znieczulenie małą dawką (10 mg/kg) pentobarbitalu sodu, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia. Przypnij włosy do skóry głowy, wykonaj podłużne nacięcie (~2 cm) i wytnij tkanki łączne pokrywające czaszkę za pomocą skalpela lub kirety.</li>
	<li>Wykonaj małą (~1,5 mm średnicy) kraniotomię w obszarze zainteresowania za pomocą wiertła dentystycznego. 
	Uwaga: Tutaj celowane jest pole beczkowe pierwotnej kory somatosensorycznej (7 - 8 mm przed linią międzyuszną, 4,5 - 5,5 mm bocznie do linii środkowej 31). Płucz kilkakrotnie, aby rozproszyć ciepło.</li>
	<li>Użyj bardzo cienkich kleszczy, aby delikatnie zrobić mały otwór w oponie twardej. Zarezerwuj obszar ~0,5 mm w trepanacji czaszki, aby umieścić elektrodę ECoG (patrz następny krok). Stale utrzymuj wilgotną korę mózgową za pomocą 0,9% roztworu NaCl (lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego).</li>
	<li>Umieść srebrną elektrodę o niskiej impedancji (~60 kΩ) (elektrodę ECoG) na oponie twardej, omijając obszar korowy niepokryty oponami mózgowymi, a następnie umieść elektrodę odniesienia na mięśniu skóry głowy po drugiej stronie głowy.</li>
	<li>Na tym etapie (30 min po ostatnim wstrzyknięciu pentobarbitalu sodu) należy utrzymać znieczulenie poprzez wielokrotne wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (10-15 mg/kg/h) lub fentanylu (3-6 μg/kg/h) przez cewnik IP. To pierwsze spowoduje powolny, oscylacyjny, podobny do snu wzorzec ECoG, podczas gdy drugi spowoduje zdesynchronizowany, podobny do czuwania profil korowy.</li>
	<li>Dostosuj system sztucznej wentylacji tak, aby częstotliwość i objętość oddechu były podobne do spontanicznego oddychania szczura (normalny zakres 70 - 115 oddechów/min 32). Następnie należy podłączyć wentylację mechaniczną do rurki dotchawiczej i sprawdzić, czy klatka piersiowa jest prawidłowo napompowana (po obu stronach). Jeśli nie, wyreguluj położenie rurki wentylacyjnej w osi tchawicy. W razie potrzeby odessać wydzielinę znajdującą się w tchawicy za pomocą cewnika podłączonego do strzykawki lub pompy próżniowej.</li>
	<li>Jeśli wszystkie zmienne fizjologiczne 32-35 i wzorce ECoG 29,36 odzwierciedlają stabilną chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, wykonaj domięśniowe wstrzyknięcie trietiodku galaminy w każdą nogę, aby sparaliżować szczura, 40 mg / kg w pierwszym wstrzyknięciu, a następnie 20 mg / kg, co 2 godziny 19,29,36,50.</li>
</ol>
2. Nagrania wewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>Wyciągnąć szklaną mikropipetę (ostrą mikroelektrodę) z końcówką ~0,2 μm, tak aby jej rezystancja mieściła się w zakresie od 50 do 80 MΩ po napełnieniu 2 M octanem potasu (KAc).</li>
	<li>Umieść pipetę w specjalnym uchwycie z przewodem srebrnym/chlorku srebra (Ag/AgCl), aby podłączyć roztwór pipety do wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (za pomocą stopnia głównego). Uchwyt powinien być przymocowany do mikromanipulatora. Umieść elektrodę referencyjną Ag/AgCl na mięśniach szyi szczura.</li>
	<li>Powoli włóż pipetę do mózgu w dół do obszaru zainteresowania i sprawdź jej rezystancję, monitorując spadki napięcia w odpowiedzi na bieżące kroki. Użyj przycisku brzęczenia (lub trzasku) amplifier, aby w razie potrzeby wyczyścić pipetę.</li>
	<li>Użyj bawełnianych wacików lub syntetycznych trójkątów absorpcyjnych, aby wysuszyć kraniotomię (należy uważać, aby nie dotknąć elektrod ECoG lub wewnątrzkomórkowych) przed pokryciem go elastomerem silikonowym lub 4% agarozą, aby zmniejszyć ruchy mózgu.</li>
	<li>Zmniejszaj pipetę w krokach co 1–2 μm, aż jej opór wzrośnie podczas zbliżania się do celi. Następnie użyj funkcji brzęczenia wzmacniacza, aby przeniknąć do neuronu.</li>
</ol>
3. Indukuj stan izoelektryczny
<ol>
	<li>Na tym etapie należy wykonać odpowiedni protokół eksperymentalny (np. reakcje na impulsy wstrzykiwane wewnątrzkomórkowo, relacje prąd-napięcie, reakcje na bodźce sensoryczne), jednocześnie monitorując potencjał błonowy neuronu, ECoG i zmienne fizjologiczne.</li>
	<li>Upewnij się, że elektroda wewnątrzkomórkowa jest stabilna w komórce, analizując stabilność zarówno potencjału błonowego, jak i właściwości potencjału czynnościowego przez cały czas trwania sesji nagraniowej. Jeśli nie, nie przechodź do następnego kroku i poczekaj, aż nagranie ponownie się ustabilizuje lub poszukaj innego neuronu.</li>
	<li>Wstrzyknąć wysoką, ale podśmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (~90 mg/kg, może wynosić nawet 35 mg/kg w stanie początkowym pentobarbitalu i do 155 mg/kg w stanie początkowym fentanylu) za pośrednictwem linii IP. 
	Uwaga: W ciągu 15 - 20 minut przebiegi wewnątrzkomórkowe i ECoG powinny zwolnić z przerywaną ciszą elektryczną, aby przejściowo osiągnąć tak zwany profil "tłumienia impulsów" 37,38, który stopniowo zapada się do pełnego stanu izoelektrycznego. Oczekuje się, że tętno znacznie zwolni (o ~10 - 20%), ale SpO2 i EtCO2 powinny pozostać stosunkowo stabilne.</li>
	<li>Jeśli stan izoelektryczny nie zostanie osiągnięty, wstrzyknąć niewielką ilość pentobarbitalu sodu (~10% dawki z kroku 3.1). Odczekaj 15 minut przed dodaniem większej ilości środka znieczulającego, jeśli stan izoelektryczny nadal nie został osiągnięty.</li>
	<li>Powtórz protokół eksperymentalny, aby porównać wpływ dynamiki sieci na właściwości integracyjne zarejestrowanego neuronu. 
	Uwaga: Po zaprzestaniu wstrzykiwań znieczulających aktywność elektryczna mózgu powinna w pełni powrócić w ciągu 3 do 4 godzin.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu wstrzyknij śmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (200 mg/kg, IP) w celu eutanazji szczura.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj nową metodę tłumienia in vivo spontanicznej aktywności elektrycznej mózgu zarówno na poziomie sieciowym, jak i komórkowym. Ta procedura prowadzi do ekstremalnego stanu mózgu, znanego jako śpiączka izoelektryczna 41. Z klinicznego punktu widzenia taka bezczynność elektromózgowa jest najpoważniejszą nieprawidłowością, jaką można zaobserwować w EEG. Jest to najczęściej związane z nieodwracalną śpiączką, w której wszyscy pacjenci albo umierają, albo kontynuują trwały stan wegetatywny ...

W przypadku braku jakichkolwiek bodźców środowiskowych lub zadań behawioralnych, "odpoczywający" mózg generuje ciągły strumień aktywności elektrycznej, który może być rejestrowany ze skóry głowy jako fale elektroencefalograficzne (EEG). Wewnątrzkomórkowy korelat tej endogennej aktywności mózgowej charakteryzuje się fluktuacjami napięcia błony tła (znanymi również jako "szum synaptyczny"), które składają się z kombinacji pobudzających i hamujących potencjałów synaptycznych, które odzwierciedlają ciągłą aktywność sieci aferentnych 1,2. Ta spontaniczna aktywność różni się częstotliwością i amplitudą w zależności od różnych stanów czujności. Wyjaśnienie wpływu aktywności sieci na pobudliwość i responsywność pojedynczych neuronów jest jednym z głównych wyzwań neuronauk 3,4.
Wiele eksperymentalnych i obliczeniowych badań badało funkcjonalny wpływ trwającej aktywności synaptycznej na integracyjne właściwości neuronów. Jednak rola różnych parametrów neuronalnych, na które wpływa szum synaptyczny tła, pozostaje nieuchwytna. Na przykład stwierdzono, że średni poziom depolaryzacji błony wynosi dodatnio 5,6 lub ujemnie 7-9 i jest skorelowany ze zdolnością bodźców sensorycznych do wyzwalania potencjałów czynnościowych. Ponadto, podczas gdy niektóre badania sugerują, że fluktuacje potencjału błonowego, wynikające z ciągle zmieniającego się strumienia aferentnych wejść synaptycznych, silnie wpływają na responsywność pojedynczych neuronów poprzez modulowanie wzmocnienia ich relacji wejścia-wyjścia 3,10-13, inne wskazują, że zmiany w przewodnictwie wejściowym błony, w których pośredniczy hamowanie bocznikowe, są wystarczające do modulowania wzmocnienia neuronów niezależnie od wielkości fluktuacji błony 14,15. Wreszcie, ostatnie badania przeprowadzone na obudzonych zwierzętach podkreśliły, że przetwarzanie informacji sensorycznych w pojedynczym neuronie krytycznie zależy od stanu czujności i aktualnego zapotrzebowania behawioralnego 16,17.
Prostą strategią wyjaśnienia funkcjonalnej roli danego procesu w wysoce połączonym systemie jest określenie, w jaki sposób jego brak konkretnie wpływa na funkcjonowanie systemu. Metoda ta jest szeroko stosowana w badaniach neurobiologicznych, na przykład przy użyciu eksperymentalnych zmian chorobowych lub inaktywacji różnych obszarów mózgu 18-21 lub farmakologicznej blokady określonych kanałów jonowych 22,23. Warto zauważyć, że został on zastosowany in vivo, aby ujawnić, w jaki sposób łączność funkcjonalna i dynamika sieci wpływają na obliczenia pojedynczych komórek 24-27. Jednak do tej pory lokalne manipulacje mające na celu zablokowanie uruchamiania neuronów i/lub zakłócenie ich podstawowych właściwości biofizycznych mogą być częściowo skuteczne i są ograniczone do stosunkowo małych objętości mózgu.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nowe eksperymentalne podejście in vivo na szczurach, aby porównać właściwości elektrofizjologiczne pojedynczych neuronów zarejestrowanych w danym stanie mózgu, tj. osadzonych w określonej dynamice sieci, z tymi, które uzyskano po całkowitym stłumieniu całej aktywności synaptycznej mózgu 29. W warunkach kontrolnych można było wygenerować dwie odrębne dynamiki kory mózgowej. Wzorce elektrokortykograficzne (ECoG) podobne do snu zostały wywołane przez wstrzyknięcie umiarkowanych dawek pentobarbitalu sodu. Alternatywnie, szybkie fale ECoG o małej amplitudzie porównywalnej z aktywnością korową leżącą u podstaw stanu czuwania (wzorzec podobny do czuwania) mogą być wytwarzane przez wstrzyknięcie fentanylu. Następnie, przy zachowaniu tego samego ECoG i zapisu wewnątrzkomórkowego, uzyskano całkowite wyciszenie endogennej aktywności elektrycznej mózgu poprzez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie dużej dawki pentobarbitalu sodu, charakteryzującego się izoelektrycznym ECoG i aktywnością wewnątrzkomórkową. Ponieważ wywołanie tak ekstremalnej śpiączki może mieć potencjalnie śmiertelne konsekwencje dla funkcji biologicznych, niezbędne było staranne i ciągłe monitorowanie zmiennych fizjologicznych. Dlatego przez cały czas trwania eksperymentów skrupulatnie śledziliśmy częstotliwość bicia serca, stężenie CO2 (EtCO2), nasycenieO2 (SpO2) i temperaturę rdzenia szczura.
Oceniamy właściwości pojedynczych neuronów podczas tych różnych stanów za pomocą ostrych mikroelektrod, które są szczególnie odpowiednie do długich i stabilnych nagrań in vivo. Opisana tutaj procedura może być łączona z innymi podejściami elektrofizjologicznymi i obrazowymi oraz może być rozszerzona na inne modele zwierzęce.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Centravet</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Trietiodek galaminy</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz ECoG</td><td>Wzmacniacz AC A-M Systems</td><td>Wzmacniacz AC, Model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs akwizycji danych</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>CED moc 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 wersja 7</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz kapilarny</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat</td><td>Harvarda GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut 0,125 mm (zapis wewnątrzkomórkowy)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Odniesienie Ag-AgCl</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut 0,25 mm (zapis ECoG)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>System sztucznego oddychania</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Monitorowanie parametrów fizjologicznych</td> Koc grzewczy <td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvard 507215</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Cewnik poliuretanowy - 0,43x0,69 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer</td><td>silikonowy WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>NSK</td><td>Y1001151 i P496</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Sposób, w jaki neurony przetwarzają informacje, zależy zarówno od ich wewnętrznych właściwości błony, jak i od dynamiki aferentnej sieci synaptycznej. W szczególności endogennie generowana aktywność sieciowa, która silnie zmienia się w zależności od stanu czujności, znacząco moduluje obliczenia neuronalne. Aby zbadać, w jaki sposób różna spontaniczna dynamika mózgowa wpływa na właściwości integracyjne pojedynczych neuronów, opracowaliśmy nową strategię eksperymentalną na szczurach polegającą na tłumieniu in vivo całej aktywności mózgowej za pomocą ogólnoustrojowego wstrzykiwania dużej dawki pentobarbitalu sodu. Aktywność kory mózgowej, stale monitorowana za pomocą połączonego elektrokortykogramu (ECoG) i zapisów wewnątrzkomórkowych, jest stopniowo spowalniana, co prowadzi do stałego profilu izoelektrycznego. Ten ekstremalny stan mózgu, wprowadzający szczura w głęboką śpiączkę, był dokładnie monitorowany poprzez pomiar stałych fizjologicznych zwierzęcia podczas eksperymentów. Zapisy wewnątrzkomórkowe pozwoliły nam scharakteryzować i porównać właściwości integracyjne tego samego neuronu osadzonego w fizjologicznie istotnej dynamice kory mózgowej, takiej jak te spotykane w cyklu snu i czuwania oraz gdy mózg był w pełni cichy.

Indukowanie i utrzymywanie izoelektrycznego stanu mózgu jest delikatną procedurą eksperymentalną in vivo. Udowodniono, że jest to potężne narzędzie do bezpośredniego badania wpływu aktywności sieci korowej na pobudliwość neuronalną i funkcję przejścia 29. Rysunek 1 przedstawia wieloparametrowy monitoring stanu fizjologicznego zwierzęcia, w tym ECoG i stałe życiowe, przed (Rysunek 1A) i po (Rysunek 1B) indukcji stanu iz...

Ta procedura wykonuje długotrwałe wewnątrzkomórkowe zapisy in vivo z pojedynczych neuronów podczas fizjologicznie istotnych stanów mózgowych i po całkowitym zniesieniu trwających czynności elektrycznych, co skutkuje izoelektrycznym stanem mózgu. Stałe fizjologiczne zwierzęcia są dokładnie monitorowane podczas przejścia w stan sztucznej śpiączki.

Indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wywołanie ogólnego stanu nieaktywności mózgu in vivo w celu zbadania właściwości zintegrowanych pojedynczych neuronów w warunkach braku sygnałów synaptycznych. Przedstawiona tutaj metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurofizjologii, takie jak ocena wpływu aktywności sieci na obliczenia w pojedynczych komórkach lub badanie reaktywności neuronów w stanach śpiączki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania właściwości neuronalnych w izolacji od sieci w nienaruszonej preparacji in vivo.Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić w pełni znieczulonego szczura na podgrzewaczce. Wprowadź do odbytu zwierzęcia sondę rectalną w celu utrzymania temperatury wewnętrznej ciała na poziomie około 37 °C. Aby wprowadzić cewnik do jamy otrzewnowej w celu ułatwienia późniejszego podawania środków znieczulających, należy najpierw usunąć sierść z niewielkiego obszaru w prawym lub lewym dolnym kwadrancie brzucha za pomocą kremu do depilacji.Po podaniu znieczulenia miejscowego, wysterylizuj pole operacyjne i wykonaj nacięcie skóry o szerokości od dwóch do trzech milimetrów za pomocą ostrych nożyczek. Używając nożyczek tępych, usuwaj warstwy tłuszczu i mięśni, aż do momentu odsłonięcia jamy otrzewnej. Następnie wprowadź do jamy około jeden do dwóch centymetrów małego cewnika i zamknij ranę klejem chirurgicznym.Wykonaj pętlę i przyszyj cewnik do skóry, aby go unieruchomić. W celu wprowadzenia rurki tchawiczej do kontroli wentylacji podczas sztucznego oddychania, usuń owłosienie, wysterylizuj miejsce nacięcia i przetnij skórę nad tchawicą bezpośrednio nad manubrium. Wykonaj tępe rozcięcie pierwszej warstwy tłuszczu i mięśni.Odsuń śliniankę i odsłoń tchawicę, ostrożnie preparując ostatnią warstwę mięśni. Starannie wyizoluj tchawicę i za pomocą małych pęset przesuń pod nią nitkę. Następnie zawiąż nitką luźny węzeł chirurgiczny.Nacinamy tchawicę poprzecznie pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi. Następnie wprowadzamy rurkę tchawiczą o odpowiedniej średnicy i zaciągamy węzeł nici, aby zabezpieczyć rurkę. Dla zwiększenia stabilności nić można dodatkowo przymocować w wyższym punkcie rurki tchawiczej.Zaszyć ranę lub użyć zszywek chirurgicznych w celu jej zamknięcia. Następnie przenieść zwierzę do aparatu stereotaksycznego i nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu. Następnie umieścić odpowiednie sondy w celu monitorowania parametrów fizjologicznych, takich jak elektrokardiogram, wysycenie krwi tlenem oraz ciśnienie końcowe CO2 w powietrzu wydychanym.Następnie usuń owłosienie z okolic czaszki i wysterylizuj pole operacyjne. Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie wzdłużne i wypreparuj tkanki łączną pokrywające czaszkę za pomocą skalpela. Następnie nałóż klej chirurgiczny na czaszkę i tkanki, aby ustabilizować preparat.Następnie, za pomocą wiertła dentystycznego, wykonaj niewielką kraniotomię o średnicy 1,5 millimeter nad obszarem zainteresowania. Po tym wykonaj delikatnie mały otwór w oponie twardej, używając pęsety ekstra-fine oraz nożyczek naczyniowych. Zachowaj obszar o wielkości 0,5 millimeter w obrębie trepanacji czaszki, aby umieścić elektrodę elektrokorty kograficzną.Należy zadbać o to, aby kora pozostała wilgotna, stosując 0,9% roztwór chlorku sodu lub aCSF. Następnie należy umieścić elektrodę referencyjną na mięśniu skóry czaszki po stronie przeciwległej oraz umieścić elektrodę elektrokortykograficzną o niskiej impedancji na oponie twardej. Należy dostosować system wentylacji mechanicznej tak, aby częstotliwość i objętość oddechów były zbliżone do parametrów spontanicznego oddychania szczura.Jeśli wszystkie zmienne fizjologiczne i wzorce elektrokortykograficzne mieszczą się w normach, wstrzyknij trijodek gallaminy do każdej kończyny dolnej, aby sparaliżować zwierzę. Następnie podłącz wentylację mechaniczną do rurki tchawiczej i zweryfikuj prawidłowe nadmuchanie klatki piersiowej po obu stronach. Na tym etapie wyciągnij szklaną mikropipetę z końcówką o średnicy 0,2 µm i napełnij ją 2 M roztworem octanu potasu.Umieść pipetę w specjalnym uchwycie z drutem srebrno-chlorkowym, aby połączyć roztwór w pipecie z wzmacniaczem wewnątrzkomórkowym. Następnie umieść srebrno-chlorkową elektrodę odniesienia na mięśniach szyi szczura. Umieść pipetę nad obszarem zainteresowania.Powoli wprowadzaj pipetę do mózgu do pożądanej głębokości, używając w razie potrzeby przycisku wibracyjnego (buzz button) wzmacniacza w celu udrożnienia pipety. Skompensuj oporność pipety, zerując spadki napięcia w odpowiedzi na skoki prądu za pomocą układu mostkowego wzmacniacza. Następnie użyj patyczków bawełnianych lub syntetycznych trójkątów absorpcyjnych, aby osuszyć miejsce kraniotomii, a następnie pokryj je elastomerem silikonowym lub 4% agarozą, aby ograniczyć ruchy mózgu.Następnie obniżaj pipetę w krokach jednego lub dwóch mikrometrów, aż opór wzrośnie podczas zbliżania się do komórki. Użyj funkcji buzz wzmacniacza, aby wprowadzić elektrodę do neuronu. Gdy rejestracja stanie się stabilna, skompensuj oporność elektrody, regulując parametr bridge podczas wstrzykiwania do neuronu niewielkich skoków prądu.Następnie należy przeprowadzić odpowiedni protokół eksperymentalny, np. wstrzyknąć prąd do wnętrza komórki w celu wyodrębnienia właściwości wewnętrznych neuronu lub przeprowadzić stymulację sensoryczną. Następnie, poprzez linię wewnątrzbrzuszną, należy wstrzyknąć wysoką, lecz podlethalną dawkę pentobarbitalu sodowego. W ciągu 15 do 20 minut aktywność wewnątrzkomórkowa i elektrokortykograficzna powinna zwolnić, z przerywanymi okresami ciszy elektrycznej, aby przejściowo osiągnąć tzw. profil supresji wybuchowej (burst suppression), który stopniowo przechodzi w całkowity stan izoelektryczny.Oczekuje się, że częstość pracy serca ulegnie znacznemu spowolnieniu, natomiast SPO2 i EtCO2 powinny pozostać na względnie stałym poziomie. Następnie należy powtórzyć protokół stymulacji, aby porównać wpływ dynamiki sieci na właściwości integracyjne zarejestrowanych neuronów. Po zaprzestaniu podawania środka znieczulającego aktywność elektryczna mózgu powinna w pełni powrócić w ciągu od trzech do czterech godzin.Rysunek ten przedstawia spontaniczną aktywność wewnątrzkomórkową oraz elektrokortykograficzną w dwóch stanach znieczulenia, naśladujących dynamikę kory generowaną endogennie we wczesnych fazach snu lub podczas czuwania. Stan przypominający sen jest indukowany wstrzyknięciem pentobarbitalu sodowego, a stan przypominający czuwanie przez fentanyl. W obu przypadkach późniejsze wstrzyknięcie wysokiej dawki pentobarbitalu sodowego doprowadziło do całkowitego zniesienia spontanicznej aktywności w ECOG oraz w jednocześnie rejestrowanych neuronach, stąd określenie izoelektryczny.Stłumienie trwającej aktywności synaptycznej doprowadziło do znaczącej hiperpolaryzacji potencjału błony neuronalnej. Reakcje wywołane prądem mogą być generowane przed i po indukcji stanu izoelektrycznego. Pozwala to na porównanie różnych aktywności mózgu w funkcji przenoszenia wejście-wyjście neuronów, wyrażonej jako główna częstotliwość wyładowań wywołanych w odpowiedzi na skoki prądu o rosnącej intensywności.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu zwierzęcia w jak najlepszej kondycji fizjologicznej, aby uzyskać wysokiej jakości zapisy odzwierciedlające wiarygodną dynamikę mózgu. Podejście to może być ponadto wykorzystane jako model do badania reaktywności neuronów w nieodwracalnych lub odwracalnych stanach głębokiej śpiączki.

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z pojedynczych neuronów mózgowych za pomocą mikropipety szklanej z cienką końcówką i specjalistycznej konfiguracji. Mikropipeta jest ostrożnie wprowadzana do mózgu szczura i jest brzęcząca, aby przeniknąć do neuronu w celu zarejestrowania wewnętrznych neuronalnych sygnałów elektrycznych.

Rejestracja in vivo sygnałów wewnątrzkomórkowych z pojedynczego neuronu

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Audiometria odpowiedzi wywołanej pniem mózgu jest ważnym narzędziem w neurofizjologii klinicznej. Obecnie audiometria odpowiedzi wywołanej pnia mózgu jest również stosowana w naukach podstawowych i badaniach przedklinicznych obejmujących zarówno farmakologiczne, jak i genetyczne modele zwierzęce. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób słuchowe reakcje pnia mózgu mogą być z powodzeniem rejestrowane i analizowane u myszy.

Akwizycja i analiza danych w audiometrii odpowiedzi wywołanej pniem mózgu u myszy

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.

Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy

Tutaj opisujemy protokół indukowania długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronów w neuronach przekaźnikowych z grzbietowego bocznego jądra kolankowatego utrzymywanego w wycinkach mózgu ex vivo.

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

Poznaj metodę indukcji izoelektrycznego stanu mózgu u szczurów w celu badania właściwości pojedynczych neuronów bez wpływu aktywności sieciowej. Technika ta umożliwia analizę pobudliwości komórek nerwowych in vivo.

Indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo

Przeglądaj więcej filmów