Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki
11 marca 2016
Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.
Ogólnym celem ilościowej autofluorescencji (qAF) jest ocena całkowitego poziomu lipofuscyny w komórkach podporowych siatkówki, czyli w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), zarówno w oczach zdrowych, jak i chorych. Technika ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek siatkówki, takie jak wpływ stanu zdrowia nabłonka barwnikowego siatkówki na rozwój zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD). Główną zaletą tej metody jest możliwość określenia bezwzględnych poziomów autofluorescencji lipofuscyny w dnie oka, co pozwala na ilościową i powtarzalną obserwację zmian u pacjentów, pomiędzy kolejnymi sesjami obrazowania oraz w dużych grupach badawczych.
Przed obrazowaniem należy odpowiednio skonfigurować konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową (CSLO) do akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zamontować wewnętrzny wzorzec fluorescencyjny zakupiony od producenta, należy przekręcić soczewkę, aby ją wyjąć, odkręcić metalowy pierścień urządzenia i zastąpić go nowym metalowym pierścieniem zawierającym wzorzec. Niezbędne jest rozszerzenie źrenic do co najmniej 6mm, aby zapewnić niezakłócony przepływ światła.
Przy użyciu 0,5% tropicamidu oraz 2,5% fenylefryny rozszerz źrenice pacjenta do co najmniej 6 mm, co jest niezbędne dla niezakłóconego przejścia światła w celu obserwacji i pomiaru dna oka. Prawidłowo ułóż pacjenta w urządzeniu CSLO, tak aby podbródek spoczywał na podścięciu, czoło było oparte o uchwyt czołowy, a boczne kąciki powiek były odpowiednio wyrównane z wskaźnikami. Aby uzyskać obrazy bazowe, najpierw wykonaj obrazowanie dna oka przy użyciu odbicia bliskiej podczerwieni (światła IR), aby scentrować kamerę nad plamką żółtą i uzyskać wstępną ostrość.
Po odpowiednim ułożeniu pacjenta należy przełączyć ustawienia sprzętowe na panelu sterowania w tryb obrazowania IR, ręcznie ustawić kamerę tak, aby dno oka było w pełnym ostrości, a następnie wykonać zdjęcie. Należy zmienić ustawienie na panelu sterowania na IROCT, który wykorzystuje optyczną koherentną tomografię w domenie widmowej, czyli SDOCT, w połączeniu z obrazowaniem IR, w celu oceny plamki pod kątem potencjalnych schorzeń. Należy skorzystać z prowadnic widocznych w oknie obrazowania, aby prawidłowo zorientować OCT względem obrazu IR dna oka.
Aby uzyskać optymalną jakość SDOCT, należy ustawić kamerę tak, aby obraz OCT znajdował się w górnej jednej trzeciej okna obrazowania. Należy wykonać co najmniej jeden poziomy skan liniowy przechodzący przez dołek środkowy, obejmujący całe pole obrazowania. W celu konfiguracji obrazowania qAF należy zastosować szybką akwizycję obrazu, co zmniejsza ryzyko utraty sygnału spowodowanej ruchami pacjenta oraz zasłonięciem światła przez tęczówkę lub powieki.
Użyj funkcji średniej z 9 klatek (Mean of 9 frames), która szybko i sekwencyjnie przechwytuje dziewięć klatek obrazu, a następnie wyciąga z nich średnią w celu zredukowania szumów i artefaktów. Wybierz pole widzenia 30 x 30 stopni, co odnosi się do stopni obszaru siatkówki rejestrowanego podczas akwizycji obrazu. Po ostrzeżeniu pacjenta przed niebieskim światłem włącz tryb AF i ustaw oś kamery tak, aby ekran był maksymalnie wypełniony obrazem dna oka w trybie AF, przy minimalnym zaciemnieniu boków i rogów obrazu.
Jeśli pacjenci mają trudności z tolerowaniem jasnego niebieskiego światła, należy odsunąć kamerę od oka przed rozpoczęciem obrazowania, a następnie powoli zbliżać ją do pacjenta, aż dno oka będzie w pełni widoczne. Za pomocą sterowania ręcznego lub dżojstika oftalmoskopu należy dostosować ustawienie kamery, przemieszczając CSLO tak, aby sygnał AF osiągnął najwyższy poziom w całym polu widzenia, zamiast dążyć jedynie do uzyskania najostrzejszego obrazu. Podczas akwizycji obrazu kolorowe piksele widoczne w referencji wewnętrznej lub na dnie oka wskazują na przesycenie, a tym samym na utratę sygnału.
Całkowicie naświetl siatkówkę światłem AF przez co najmniej 20 sekund, aby zminimalizować absorpcję światła przez rodopsynę w siatkówce sensorycznej podczas obrazowania. Wykorzystaj ten czas na optymalizację ustawienia kamery, ostrości i czułości. Poproś badanych o mrugnięcie przed każdą akwizycją obrazu, ponieważ świeża warstwa filmu łzowego poprawia jakość sygnału.
Należy unikać powiek w płaszczyźnie akwizycji i wykonać obrazowanie. Ważne jest, aby podczas każdej sesji obrazowania uzyskać co najmniej dwa wysokiej jakości obrazy do późniejszej analizy danych. Przeprowadź przetwarzanie poakwizycyjne za pomocą oprogramowania CSLO, aby obliczyć średnią z dziewięciu nałożonych na siebie klatek w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.
Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, w zdrowych oczach AF emitowana przez RPE jest rozłożona stosunkowo równomiernie w obrębie dna oka. Zredukowana intensywność jest widoczna w centralnym obszarze plamki ze względu na blokowanie światła przez barwnik plamki, a także po bokach i w rogach z powodu optyki oka i kamery.
Naczynia powinny być ciemne i wyraźnie widoczne. Rysunek ten przedstawia odpowiadającą mapę ciepła poziomów qAF z tego rysunku. Chłodniejsze kolory odpowiadają obszarom o niższej intensywności AF, natomiast cieplejsze kolory odpowiadają obszarom o wyższej intensywności AF.
Maksymalna intensywność jest zazwyczaj obserwowana w drugim koncentrycznym pierścieniu ośmiosegmentowym, a średnie intensywności w tym obszarze są wykorzystywane w większości analiz danych. Przedstawiono tutaj reprezentacyjną analizę oka z AMD, wykazującą atrofię geograficzną, czyli zaawansowaną postać AMD. Ta postać AMD prowadzi do powstania zlokalizowanych obszarów utraty RPE, co objawia się znacznie zmniejszoną lub nieobecną AF i powoduje postępującą utratę widzenia centralnego.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobierać pacjentów oraz powtarzalnie pozyskiwać obrazy wysokiej jakości w celu maksymalizacji jakości danych. Zastosowanie tej procedury umożliwia podłużną obserwację stanu siatkówki w celu określenia postępu jej degeneracji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie okulistyki do monitorowania i analizowania degeneracji siatkówki.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania ilościowej autofluorescencji do oceny pacjentów z degeneracjami siatkówki. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu badań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny w nabłonku pigmentowym siatkówki (RPE) z wykorzystaniem konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (CSLO). Technika ta ma na celu ocenę poziomu lipofuscyny w oczach zdrowych i chorych, co przyczynia się do lepszego zrozumienia biologii komórek siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Biologia komórki
Wstęp
- RPE wspomaga sensoryczną siatkówkę poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego.
- Gromadzenie się lipofuscyny może wskazywać na stan zdrowia komórek.
- Zrozumienie poziomu lipofuscyny jest kluczowe dla badania zwyrodnienia plamkowego związanego z wiekiem (AMD).
- Obrazowanie ilościowe pozwala na powtarzalne oceny w obrębie pacjentów i badań.
Cel badania
- W celu ilościowej oceny poziomu lipofuscyny w RPE.
- W celu zbadania związku między stanem zdrowia RPE a rozwojem AMD.
- W celu opracowania niezawodnej techniki obrazowania do zastosowań klinicznych i badawczych.
Zastosowane metody
- Konfiguracja i kalibracja konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (CSLO).
- Zastosowanie wewnętrznego wzorca fluorescencyjnego dla zapewnienia dokładności pomiarów.
- Rozszerzenie źrenic do co najmniej 6mm w celu optymalizacji przejścia światła.
- Ilościowe obrazowanie autofluorescencji dna oka.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie poziomów lipofuscyny w różnych schorzeniach oczu.
- Ustanowienie bazowych poziomów autofluorescencji w celu porównania.
- Wykazanie powtarzalności techniki w kolejnych sesjach obrazowania.
- Wnioski dotyczące roli lipofuscyny w zdrowiu i chorobach siatkówki.
Wnioski
- Ilościowe obrazowanie lipofuscyny jest cennym narzędziem w badaniach nad siatkówką.
- Metoda ta pogłębia naszą wiedzę na temat funkcji i patologii RPE.
- Dalsze badania mogą wykorzystać tę technikę do analizy AMD oraz innych chorób siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa autofluorescencja dna oka (qAF) umożliwia powtarzalny, bezwzględny pomiar poziomu lipofuscyny w nabłonku pigmentowym siatkówki (RPE), stanowiąc biomarker stresu komórkowego i degeneracji w przedklinicznych modelach chorób siatkówki. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez korelację statusu funkcjonalnego RPE z integralnością sensorycznej warstwy siatkówki, co pozwala na mechanistyczną minimalizację ryzyka w programach badawczych w dziedzinie okulistyki. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków poprzez umożliwienie podłużnego śledzenia progresji patologicznej w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie akumulacji lipofuscyny jako wskaźnika funkcji fagocytycznej i lizosomalnej RPE w modelach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia redukcję ryzyka biologicznego dzięki standaryzowanej, powtarzalnej ocenie stanu RPE w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie poziomu lipofuscyny w RPE ze stresem i degeneracją fotoreceptorów, co pozwala na ocenę pewności w wyborze celu w ramach walidacji przedklinicznej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane modele siatkówki do dalszego przesiewu związków poprzez ustalenie bazowych poziomów lipofuscyny i progów detekcji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki kalibracji wewnętrznego referencyjnego fluorescencyjnego oraz kontrolowanym parametrom obrazowania.
- Wartość skalowalności: Umożliwia zastosowanie w badaniach wysokoprzepustowych dzięki szybkemu uśrednianiu klatek i standaryzowanemu obrazowaniu pola widzenia dla dużych populacji badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie wzorców lipofuscyny w RPE ze zmianami strukturalnymi w zewnętrznej warstwie siatkówki, co wspiera modelowanie chorób w oparciu o biomarkery.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka dzięki ilościowemu, podłużnemu monitorowaniu postępu degeneracji w badaniach przedklinicznych.
- Wartość prognostyczna: Poprawia mechanistyczne ograniczanie ryzyka, dostarczając obiektywnych, korelacyjnych danych na temat spadku funkcji RPE poprzedzającego utratę fotoreceptorów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ilościowa autofluorescencja wpisuje się w proces odkryć w okulistyce – od wczesnej walidacji celu po przedkliniczną ocenę skuteczności, umożliwiając podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wskaźniki stanu zdrowia RPE.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie poziomu lipofuscyny jako funkcjonalnego wskaźnika aktywności metabolicznej i lizosomalnej RPE.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnemu obrazowaniu z redukcją szumów poprzez akwizycję średniej z 9 klatek oraz standaryzowane obrazowanie pola o rozmiarach 30x30 stopni.
- Analityka: Generuje ilościowe mapy intensywności lipofuscyny oraz regionalne wartości średnie (np. dla drugiego pierścienia koncentrycznego) do analizy porównawczej między różnymi warunkami oraz w badaniach podłużnych.
- Badania translacyjne: Łączy parametry lipofuscyny w RPE z integralnością sensorycznej siatkówki, umożliwiając ciągłość badań przedklinicznych w przypadku zgodności biomarkerów strukturalnych i funkcjonalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma w różnych modelach chorób (np. AMD, dziedziczne retinopatie) dzięki standaryzowanym protokołom kalibracji i obrazowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach między RPE a fotoreceptorami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zastosowaniu referencji wewnętrznej, kontroli rozszerzenia źrenic oraz spójnych parametrów akwizycji obrazu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o mierzalne biomarkery stresu RPE.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki podłużnemu, powtarzalnemu śledzeniu postępu degeneracji w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu okulistycznym oraz obsłudze konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego.
- Zależne od aparatury CSLO z trybem autofluorescencji i kompatybilnością z wewnętrznym referencyjnym fluorescencyjnym.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów rozszerzania źrenic (0,5% tropicamidu, 2,5% fenylefryny) oraz spójności sesji obrazowania.
- Uwzględnia konieczność adaptacji w zależności od gatunków modeli ze względu na różnice w anatomii dna oka, fluorescencji lipofuscyny i wielkości źrenicy.
- Ograniczone ryzykiem nasycenia sygnału przy przedłużonej ekspozycji na niebieskie światło oraz przez mętność ośrodków, co wymaga precyzyjnego określenia czasu ekspozycji i protokołów mrugania.
![Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55537.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.884Z&w=384&q=75)
