Name: Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj ilościową autofluorescencję dna oka w ocenie poziomu lipofuscyny w nabłonku barwnikowym siatkówki. Ta metoda umożliwia niezawodne monitorowanie zdrowia siatkówki i postępu zwyrodnień plamki żółtej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować naszym współpracownikom, Francois Delori, Tomasowi Burke'owi i Tobiasowi Dunckerowi.
Wsparcie badań: NIH/NEI R01 EY015520 (RTS, JPG) oraz nieograniczone fundusze z Badań nad Zapobieganiem Ślepocie (RTB).

Oświadczenie etyczne: Wszyscy pacjenci włączeni do tych badań zostali przeprowadzeni zgodnie z zatwierdzonym nadzorem instytucjonalnej komisji rewizyjnej w New York University School of Medicine.
1. Selekcja pacjentów i wstępne przygotowanie do obrazowania
Uwaga: Wymagane są następujące materiały: 0,5% roztwór okulistyczny tropikamidu, 2,5% roztwór oftalmiczny fenylefryny, cSLO wyposażony w optyczną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) oraz odniesienie do fluorescencji wewnętrznej.
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do obrazowania należy odpowiednio skonfigurować cSLO do akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zamontuj wewnętrzne odniesienie fluorescencyjne w cSLO. Uwaga: Wewnętrzny fluorescencyjny wzorzec, zakupiony od producenta, jest umieszczony w metalowym pierścieniu i jest umieszczony bezpośrednio za obiektywem aparatu. W przypadku zastosowania cSLO innego producenta może wystąpić inna konfiguracja niż opisana w tym protokole.
	<ol>
		<li>Aby włożyć odniesienie do cSLO, przekręć obiektyw, aby go wyjąć, odkręć metalowy pierścień maszyny i zastąp go nowym metalowym pierścieniem zawierającym odniesienie. 
		Uwaga: wewnętrzne odniesienie fluorescencyjne jest niezbędne dla techniki qAF, ponieważ umożliwia korekcję zmian mocy lasera i czułości/wzmocnienia detektora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poproś pacjentów zrekrutowanych do obrazowania, aby poddali się rutynowemu badaniu rozszerzonych oczu i uzyskali podstawowe informacje na temat historii okulistycznej w przeszłości i podstawowych schorzeń, które mogą objawiać się wynikami ocznymi.</li>
	<li>Rozszerz źrenice 0,5% tropikamidu i 2,5% fenylefryny. ETAP KRYTYCZNY: Rozszerz źrenice do co najmniej 6 mm. Uwaga: Jest to niezbędne do nieprzerwanego przepływu światła, a tym samym do optymalnej wizualizacji i pomiaru dna oka.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do badania obrazowego należy prawidłowo ułożyć pacjenta na cSLO, z podbródkiem opartym na podbródku, czołem opartym o oparcie czoła, a boczne kanty prawidłowo wyrównane ze wskaźnikami.</li>
</ol>
2. Podstawowe obrazowanie dna oka
<ol>
	<li>Najpierw zobrazuj dno oka za pomocą światła odbiciowego w bliskiej podczerwieni (IR) (długość fali 820 nm), aby scentralizować kamerę nad plamką żółtą i uzyskać zgrubną ostrość.
	<ol>
		<li>Przy prawidłowym ustawieniu pacjenta przełącz ustawienia sprzętowe na panelu sterowania w tryb obrazowania w podczerwieni, ustaw kamerę ręcznie, aż dno oka będzie w pełni ostre i zrób zdjęcie</li>
		<li>Dostosuj ustawienie na panelu sterowania do "IR-OCT", które wykorzystuje optyczną tomografię koherentną w domenie spektralnej (SD-OCT) w połączeniu z obrazowaniem w podczerwieni w celu oceny plamki żółtej pod kątem choroby podstawowej.</li>
		<li>Skorzystaj z prowadnic znajdujących się w oknie obrazowania, aby prawidłowo zorientować OCT na obraz dna oka w podczerwieni. Aby uzyskać optymalną jakość SD-OCT, ustaw kamerę tak, aby obraz OCT znajdował się w górnej jednej trzeciej okna obrazowania. Uzyskaj co najmniej jeden skan linii poziomej przez dołek środkowy i obejmujący całe pole obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja obrazowania qAF
<ol>
	<li>Użyj "Szybkiej" akwizycji obrazu. Uwaga: To ustawienie pozwala na szybszą akwizycję obrazu, co zmniejsza ryzyko utraty sygnału z powodu ruchu pacjenta i wynikającego z tego zablokowania światła przez tęczówkę lub powieki.</li>
	<li>Użyj ramek "Średnia z 9". Uwaga: To ustawienie pozwala na szybkie, sekwencyjne przechwytywanie 9 klatek obrazu, które można następnie "uśrednić" w celu redukcji szumów i artefaktów (patrz poniżej).</li>
	<li>Użyj pola "30 x 30 stopni". Uwaga: Odnosi się to do stopni obszaru siatkówki uchwyconego podczas akwizycji obrazu.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do obrazowania należy ostrzec pacjenta przed niebieskim światłem, ponieważ na początku może to być niepokojące.</li>
	<li>Włącz tryb AF i ustaw oś aparatu tak, aby ekran był maksymalnie "wypełniony" AF dna oka (minimalne przyciemnienie boków i rogów obrazu).
	<ol>
		<li>Jeśli pacjenci mają trudności z tolerowaniem jasnego niebieskiego światła, rozpocznij obrazowanie aparatem znajdującym się dalej od oka, a następnie powoli zbliżaj kamerę do pacjenta, aż dno oka będzie w pełni widoczne. 
		KROK KRYTYCZNY: Jeśli światło wpadające do oka lub wychodzące z oka jest zasłonięte, spowoduje to zmniejszenie sygnału. Miejscowe zmniejszenie jest widoczne jako asymetryczne przyciemnienie boku lub rogu obrazu. Uogólniona utrata sygnału jest obserwowana, gdy same ruchy gałek ocznych blokują przepływ światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw aparat w taki sposób, aby sygnał AF był na najwyższym poziomie w całym polu. Dąż do maksymalnego sygnału, a nie do najostrzejszego obrazu, jakkolwiek z grubsza są one skorelowane. Dostosuj ostrość kamery, przesuwając cSLO, aby zmienić położenie kamery ręcznie lub za pomocą joysticka oftalmoskopu.</li>
	<li>Dostosuj czułość/wzmocnienie tak, aby AF na dnie oka było dobrze widoczne, ale unikaj nadmiernego nasycenia. Podczas akwizycji obrazu kolorowe piksele widoczne zarówno w wewnętrznym odniesieniu (znajdującym się w górnej części obrazu), jak i na dnie obrazu, wskazują na przesycenie, a tym samym utratę sygnału.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
Uwaga: KRYTYCZNY KROK: Celem pozyskiwania obrazów powinno być uzyskanie 2 wysokiej jakości 9-klatkowych stosów obrazów na sesję, aby kontrolować zmienność między obrazami podczas sesji. Po zmianie położenia pacjenta i kamery należy przeprowadzić drugą sesję składającą się z dwóch obrazów, aby ocenić i kontrolować zmienność. Wszystkie obrazy zostaną ostatecznie skalibrowane do wewnętrznego odniesienia (opisanego poniżej).
<ol>
	<li>Obrazy należy wykonywać dopiero po co najmniej 20 sekundach od "wybielania" (pełnej ekspozycji siatkówki na światło AF), aby zminimalizować absorpcję światła przez rodopsynę w siatkówce czuciowej 9.
	<ol>
		<li>Wykorzystaj ten okres, aby zoptymalizować wyrównanie, ostrość i czułość kamery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spraw, aby fotografowane osoby mrugały przed każdym zrobieniem zdjęcia, ponieważ świeży film łzowy poprawia jakość sygnału.</li>
	<li>Omijaj powieki w płaszczyźnie akwizycji. 
	Uwaga: Pomocne może być ręczne otwieranie powiek u trudniejszych pacjentów. Autorzy zalecają, aby zadanie to wykonał asystent.</li>
	<li>Zoptymalizuj wyrównanie przed każdym pobraniem obrazu, aby upewnić się, że światło nie jest zasłaniane przez tęczówkę, co skutkuje zmniejszeniem sygnału. 
	Uwaga: Ponieważ co najmniej niewielki ruch jest bardzo powszechny, autorzy zalecają dokładne wyrównanie w razie potrzeby przed każdym akwizycją obrazu. Prowadzenie i zachęcanie pacjenta podczas obrazowania pomaga zmniejszyć ruch. Autorzy zalecają również używanie pedału nożnego maszyny jako "przycisku namierzania", aby zminimalizować rozproszenie uwagi operatora.</li>
	<li>Wykonaj przetwarzanie po obrazie, obliczając "średnią" stosu 9 klatek, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Oblicz średnią stosu za pomocą oprogramowania cSLO, wybierając opcję obliczenia średniej. 
	Uwaga: Mogą istnieć stosy, w których niektóre ramki nie są optymalnej jakości (tj. mają zlokalizowany lub uogólniony zmniejszony sygnał w stosunku do optymalnych ramek), dlatego dokładnie sprawdź każdy stos i odznacz nieoptymalne ramki przed obliczeniem średniej. 
	Uwaga: Średnie obrazy o akceptowalnym stosunku sygnału do szumu mogą być przetwarzane z co najmniej 3 klatek. To normalne, że boki i rogi każdego obrazu mają słabszy sygnał niż środkowe 20 stopni ze względu na ograniczenia w samym cSLO.
	<ol>
		<li>Jeśli oprogramowanie zapyta, czy operator chciałby znormalizować poziomy szarości (tj. rozciągnąć histogram) w zakresie od 0 do 255, wybierz "Nie". Pozwala to zachować niezmienione poziomy szarości do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Analizuj obrazy AF zgodnie z wcześniejszym opisem za pomocą oprogramowania do analizy obrazu opracowanego dla techniki qAF (IGOR; 9). Krótki opis typowej analizy obrazu przy użyciu tego oprogramowania znajduje się poniżej.
	<ol>
		<li>Załaduj program qAF do IGOR i zaimportuj obrazy (w formacie .bmp) wyeksportowane z oprogramowania cSLO o proporcjach pikseli 768 x 768 (domyślny parametr wyjściowy).</li>
		<li>Wybierz obraz z menu rozwijanego i rozpocznij analizę.</li>
		<li>Zmień położenie wskaźników kalibracji na obrazie w taki sposób, aby "krzyżyk" nakładał się na dołek środkowy, a "nawias" przylegał do tarczy nerwu wzrokowego (wskaźniki te służą do skalowania i pozycjonowania ROI). Po prawidłowym ustawieniu użyj podpowiedzi oprogramowania, a następnie wypełnij obraz obwodowymi ROI otaczającymi dołek środkowy (patrz rysunki 1, 2).</li>
		<li>Wybierz opcję w IGOR, aby skalibrować ogólne poziomy szarości każdego obrazu do poziomów obecnych w wewnętrznym odniesieniu fluorescencyjnym. Uwaga: Ten krok umożliwia kalibrację czynników związanych z maszyną, w tym elektronicznego poziomu zerowego każdego obrazu i wewnętrznego referencyjnego współczynnika kalibracji każdego urządzenia, a także czynników związanych z pacjentem, w tym wieku, refrakcji i krzywizny rogówki. 
		Uwaga: Następnie oprogramowanie analityczne wyświetla stałe obszary na wynikowym obrazie, a wartość qAF jest demonstrowana w każdym regionie. Wartości qAF są również automatycznie wprowadzane do formatu arkusza kalkulacyjnego w osobnym oknie."</li>
		<li>Wygeneruj "mapy cieplne" qAF, wybierając opcję w wierszach poleceń. Wszystkie obrazy i dane można wyeksportować z oprogramowania IGOR w arkuszu kalkulacyjnym Excel, wybierając odpowiednie opcje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).</li>
<li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+autofluorescence+and+cell+density+maps+of+the+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).</li>
<li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+redistribution+and+loss+accompanied+by+cytoskeletal+stress+in+retinal+pigment+epithelium+of+eyes+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).</li>
<li>Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+digital+scanning+laser+ophthalmoscopy+fundus+autofluorescence+images+of+geographic+atrophy+in+advanced+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+%3D+Albrecht+von+Graefes+Archiv+fur+klinische+und+experimentelle+Ophthalmologie%22%5BJournal%5D)">Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).</li>
<li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+function+of+Rim+protein+in+photoreceptors+and+etiology+of+Stargardt%27s+disease+from+the+phenotype+in+abcr+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice.</a> Cell. 98, 13-23 (1999).</li>
<li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lysosomal+degradative+functions+in+RPE+cells+by+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).</li>
<li>Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipofuscin+fluorophore+A2E+mediates+blue+light-induced+damage+to+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).</li>
<li>Smith, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+autofluorescence+metrics+in+progressive+STGD%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).</li>
<li>Delori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurements+of+autofluorescence+with+the+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).</li>
<li>Burke, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+recessive+Stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).</li>
<li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+and+optical+coherence+tomography+in+best+vitelliform+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).</li>
<li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+distinguishes+ABCA4-associated+and+non-ABCA4-associated+bull%27s-eye+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy.</a> Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).</li>
<li>Greenberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+healthy+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).</li>
<li>Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+and+spatial+distribution+of+lipofuscin+in+RPE+of+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).</li>
<li>Sparrow, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fundus+autofluorescence+in+mice%3A+correlation+with+HPLC+quantitation+of+RPE+lipofuscin+and+measurement+of+retina+outer+nuclear+layer+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America.+A%2C+Optics%2C+image+science%2C+and+vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).</li>
</ol>

STA: brak ujawnień, JPG: brak ujawnień, RTS: konsultant, Ocata Therapeutics.

Nieprawidłowa dystrybucja lipofuscyny RPE, niezależnie od tego, czy jest zwiększona, czy zmniejszona, jest wrażliwym markerem choroby siatkówki i jest na ogół związana z utratą funkcji siatkówki czuciowej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie qAF do oceny lipofuscyny RPE. Włączenie wewnętrznego fluorescencyjnego wzorca w celu skorygowania zmiennej mocy lasera i czułości detektora9 wraz z naszą ustandaryzowaną techniką obrazowania pozwala na wiarygodne ilościowe określenie poziomów AF. Naszym celem jest, aby ta...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera funkcję siatkówki czuciowej poprzez liczne procesy 1. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest najważniejszą przyczyną nieuleczalnej ślepoty w krajach uprzemysłowionych i charakteryzuje się zmianami w RPE, w tym utratą pigmentu, utratą funkcji i atrofią. W AMD i przy normalnym starzeniu się RPE gromadzi fluorescencyjne organelle pochodzące z lizosomów zawierające fagocytozowane fragmenty fotoreceptorów, zwane granulkami lipofuscyny. Uważa się, że nagromadzenie lipofuscyny RPE wskazuje na dysfunkcję oksydacyjną 1, ale ostatnie badania wykazały, że morfologia RPE pozostaje normalna w starszych oczach z wysokim poziomem lipofuscyny 2. Jednak nieprawidłowe wzorce dystrybucji lipofuscyny, w szczególności utrata lipofuscyny, są udokumentowanymi markerami AMD i progresji AMD, zarówno histologicznie, jak i klinicznie 3,4
Wykazano również, że wadliwe przetwarzanie lipofuscyny RPE występuje w niektórych dziedzicznych zwyrodnieniach siatkówki. Pacjenci cierpiący na chorobę Stargardta (STGD) gromadzą lipofuscynę w RPE w młodym wieku, ostatecznie rozwijając utratę wzroku podobną do obserwowanej w AMD 5. Wyniki te sugerowały, że akumulacja lipofuscyny może sama w sobie być toksyczna i prowadzić do dysfunkcji RPE 6,7. Jednak szczegółowe badanie obrazowe osób z STGD w czasie nie potwierdziło, że ogniskowa akumulacja lipofuscyny doprowadziła do późniejszej utraty RPE 8. W związku z tym, chociaż nieprawidłowości lipofuscyny są markerami zwyrodnień siatkówki, rola bezpośredniej toksyczności lipofuscyny pozostaje nieudowodniona.
RPE to najbardziej tylna warstwa komórkowa siatkówki, ale generuje większość sygnału fluorescencyjnego z dna oka. Generowanie i detekcja autofluorescencji (AF) pochodzącej z RPE może być realizowana za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO), która pozwala na wizualizację przestrzennego rozkładu migotania oka dna oka. Niektóre zwyrodnienia siatkówki wykazują charakterystyczne wzorce migotania przedsionków dna, a obrazowanie AF pomaga w diagnozowaniu i monitorowaniu tych schorzeń. Chociaż standardowe obrazowanie AF ma znaczenie kliniczne, ilościowe migotanie przedsionków (qAF) stało się ważnym sposobem oceny stanu zdrowia RPE. Wraz z innymi opracowaliśmy ustandaryzowane podejście, które może wiarygodnie określić poziomy qAF w określonych lokalizacjach siatkówki 9. qAF ma potencjalne zastosowania w diagnostyce i monitorowaniu schorzeń siatkówki, a także może być przydatny w prognozowaniu i stratyfikacji ryzyka. Ponadto opisano również możliwości diagnostyczne qAF dla niektórych zaburzeń siatkówki 10-12. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat wykonywania naszej techniki wraz z wizualną demonstracją jej zastosowania w ocenie zdrowych i chorych oczu.

<table><tbody><tr><td>Spectralis HRA + OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% roztwór</td><td></td><td></td> okulistyczny tropikamidu <td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>2,5% roztwór</td><td></td><td></td> okulistyczny fenylefryny <td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Wewnętrzne odniesienie fluorescencyjne</td><td>Oprogramowanie Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>WaveMetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) jest zestawiony z leżącą nad nim siatkówką czuciową i wspiera funkcję układu wzrokowego. Wśród zadań wykonywanych przez RPE znajdują się fagocytoza i przetwarzanie zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez organelle pochodzące z lizosomów. Te produkty degradacji, przechowywane i określane jako granulki lipofuscyny, składają się częściowo z bisretinoidów, które mają szerokie widma absorpcji i emisji fluorescencji, które można wykryć klinicznie jako autofluorescencję dna oka za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO). Akumulacja lipofuscyny jest związana z postępującym wiekiem, ale występuje również w różnych wzorcach zarówno w nabytych, jak i dziedzicznych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. W związku z tym badanie wzorca akumulacji i korelowanie takich wzorców ze zmianami w leżącej nad nią siatkówce czuciowej jest niezbędne do zrozumienia patofizjologii i postępu choroby siatkówki. Tutaj opisujemy technikę stosowaną przez nasze laboratorium i inne, która wykorzystuje cSLO w celu ilościowego określenia poziomu lipofuscyny RPE zarówno w zdrowych, jak i chorych oczach.

Technikę tę wykorzystano do badania qAF zarówno w stanach zdrowych 13, jak i chorobowych 10-12. W zdrowych oczach (Rysunek 1) AF emitowana przez RPE jest rozłożona stosunkowo równomiernie w całym dnie oka (Rysunek 1A). Zredukowana intensywność jest widoczna w centralnym obszarze plamki ze względu na blokowanie światła przez pigment plamki, a także po bokach i w narożnikach obrazu ze względu na optykę oka i kamery. Naczynia krwionośne...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.

Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Ogólnym celem ilościowej autofluorescencji (qAF) jest ocena całkowitego poziomu lipofuscyny w komórkach podporowych siatkówki, czyli w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), zarówno w oczach zdrowych, jak i chorych. Technika ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek siatkówki, takie jak wpływ stanu zdrowia nabłonka barwnikowego siatkówki na rozwój zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD). Główną zaletą tej metody jest możliwość określenia bezwzględnych poziomów autofluorescencji lipofuscyny w dnie oka, co pozwala na ilościową i powtarzalną obserwację zmian u pacjentów, pomiędzy kolejnymi sesjami obrazowania oraz w dużych grupach badawczych.Przed obrazowaniem należy odpowiednio skonfigurować konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową (CSLO) do akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zamontować wewnętrzny wzorzec fluorescencyjny zakupiony od producenta, należy przekręcić soczewkę, aby ją wyjąć, odkręcić metalowy pierścień urządzenia i zastąpić go nowym metalowym pierścieniem zawierającym wzorzec. Niezbędne jest rozszerzenie źrenic do co najmniej 6mm, aby zapewnić niezakłócony przepływ światła.Przy użyciu 0,5% tropicamidu oraz 2,5% fenylefryny rozszerz źrenice pacjenta do co najmniej 6 mm, co jest niezbędne dla niezakłóconego przejścia światła w celu obserwacji i pomiaru dna oka. Prawidłowo ułóż pacjenta w urządzeniu CSLO, tak aby podbródek spoczywał na podścięciu, czoło było oparte o uchwyt czołowy, a boczne kąciki powiek były odpowiednio wyrównane z wskaźnikami. Aby uzyskać obrazy bazowe, najpierw wykonaj obrazowanie dna oka przy użyciu odbicia bliskiej podczerwieni (światła IR), aby scentrować kamerę nad plamką żółtą i uzyskać wstępną ostrość.Po odpowiednim ułożeniu pacjenta należy przełączyć ustawienia sprzętowe na panelu sterowania w tryb obrazowania IR, ręcznie ustawić kamerę tak, aby dno oka było w pełnym ostrości, a następnie wykonać zdjęcie. Należy zmienić ustawienie na panelu sterowania na IROCT, który wykorzystuje optyczną koherentną tomografię w domenie widmowej, czyli SDOCT, w połączeniu z obrazowaniem IR, w celu oceny plamki pod kątem potencjalnych schorzeń. Należy skorzystać z prowadnic widocznych w oknie obrazowania, aby prawidłowo zorientować OCT względem obrazu IR dna oka.Aby uzyskać optymalną jakość SDOCT, należy ustawić kamerę tak, aby obraz OCT znajdował się w górnej jednej trzeciej okna obrazowania. Należy wykonać co najmniej jeden poziomy skan liniowy przechodzący przez dołek środkowy, obejmujący całe pole obrazowania. W celu konfiguracji obrazowania qAF należy zastosować szybką akwizycję obrazu, co zmniejsza ryzyko utraty sygnału spowodowanej ruchami pacjenta oraz zasłonięciem światła przez tęczówkę lub powieki.Użyj funkcji średniej z 9 klatek (Mean of 9 frames), która szybko i sekwencyjnie przechwytuje dziewięć klatek obrazu, a następnie wyciąga z nich średnią w celu zredukowania szumów i artefaktów. Wybierz pole widzenia 30 x 30 stopni, co odnosi się do stopni obszaru siatkówki rejestrowanego podczas akwizycji obrazu. Po ostrzeżeniu pacjenta przed niebieskim światłem włącz tryb AF i ustaw oś kamery tak, aby ekran był maksymalnie wypełniony obrazem dna oka w trybie AF, przy minimalnym zaciemnieniu boków i rogów obrazu.Jeśli pacjenci mają trudności z tolerowaniem jasnego niebieskiego światła, należy odsunąć kamerę od oka przed rozpoczęciem obrazowania, a następnie powoli zbliżać ją do pacjenta, aż dno oka będzie w pełni widoczne. Za pomocą sterowania ręcznego lub dżojstika oftalmoskopu należy dostosować ustawienie kamery, przemieszczając CSLO tak, aby sygnał AF osiągnął najwyższy poziom w całym polu widzenia, zamiast dążyć jedynie do uzyskania najostrzejszego obrazu. Podczas akwizycji obrazu kolorowe piksele widoczne w referencji wewnętrznej lub na dnie oka wskazują na przesycenie, a tym samym na utratę sygnału.Całkowicie naświetl siatkówkę światłem AF przez co najmniej 20 sekund, aby zminimalizować absorpcję światła przez rodopsynę w siatkówce sensorycznej podczas obrazowania. Wykorzystaj ten czas na optymalizację ustawienia kamery, ostrości i czułości. Poproś badanych o mrugnięcie przed każdą akwizycją obrazu, ponieważ świeża warstwa filmu łzowego poprawia jakość sygnału.Należy unikać powiek w płaszczyźnie akwizycji i wykonać obrazowanie. Ważne jest, aby podczas każdej sesji obrazowania uzyskać co najmniej dwa wysokiej jakości obrazy do późniejszej analizy danych. Przeprowadź przetwarzanie poakwizycyjne za pomocą oprogramowania CSLO, aby obliczyć średnią z dziewięciu nałożonych na siebie klatek w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, w zdrowych oczach AF emitowana przez RPE jest rozłożona stosunkowo równomiernie w obrębie dna oka. Zredukowana intensywność jest widoczna w centralnym obszarze plamki ze względu na blokowanie światła przez barwnik plamki, a także po bokach i w rogach z powodu optyki oka i kamery.Naczynia powinny być ciemne i wyraźnie widoczne. Rysunek ten przedstawia odpowiadającą mapę ciepła poziomów qAF z tego rysunku. Chłodniejsze kolory odpowiadają obszarom o niższej intensywności AF, natomiast cieplejsze kolory odpowiadają obszarom o wyższej intensywności AF.Maksymalna intensywność jest zazwyczaj obserwowana w drugim koncentrycznym pierścieniu ośmiosegmentowym, a średnie intensywności w tym obszarze są wykorzystywane w większości analiz danych. Przedstawiono tutaj reprezentacyjną analizę oka z AMD, wykazującą atrofię geograficzną, czyli zaawansowaną postać AMD. Ta postać AMD prowadzi do powstania zlokalizowanych obszarów utraty RPE, co objawia się znacznie zmniejszoną lub nieobecną AF i powoduje postępującą utratę widzenia centralnego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobierać pacjentów oraz powtarzalnie pozyskiwać obrazy wysokiej jakości w celu maksymalizacji jakości danych. Zastosowanie tej procedury umożliwia podłużną obserwację stanu siatkówki w celu określenia postępu jej degeneracji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie okulistyki do monitorowania i analizowania degeneracji siatkówki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania ilościowej autofluorescencji do oceny pacjentów z degeneracjami siatkówki. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu badań.

quantitative-fundus-autofluorescence-for-evaluation-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza obrazu siatkówki to dyskretna procedura wizualizacji mikrokrążenia. Wpływ czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych może powodować zmiany kalibrów naczyń siatkówki. Opisano procedury pozyskiwania obrazów dna oka oraz etapy obliczania kalibrów statków.

Fotografia dna oka jako wygodne narzędzie do badania odpowiedzi mikronaczyniowych na czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych w badaniach epidemiologicznych

Siatkówka wykazuje wyraźne podobieństwa do mózgu, a zatem stanowi unikalne okno do nieinwazyjnego badania układu naczyniowego i struktury neuronalnej w mózgu. Protokół ten opisuje metodę badania demencji przy użyciu technik obrazowania siatkówki. Ta metoda może potencjalnie pomóc w diagnozie i ocenie ryzyka demencji.

Wykorzystanie obrazowania siatkówki do badania demencji

Metoda izolowanego wizualnego potencjału wywołanego (icVEP) jest tutaj stosowana do oceny magnokomórkowego szlaku ON, który jest początkowo uszkodzony w jaskrze. W badaniu przedstawiono standardowe procedury operacyjne z wykorzystaniem icVEP w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Udowodniono, że służy jako przydatna technologia obiektywnej diagnostyki do wczesnego wykrywania jaskry.

Ocena wczesnego stadium jaskry otwartego kąta u pacjentów za pomocą izolowanego potencjału wywołanego wzrokowego

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

To badanie opisuje proces określania i porównywania poziomów autofluorescencji z poszczególnych obszarów zainteresowania (np. druzy i podsiatkówkowych złogów druzenoidowych w zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem [AMD]) przy jednoczesnym uwzględnieniu różnych poziomów autofluorescencji w całym dnie.

Przepływ pracy w celu ilościowego określenia zmian w autofluorescencji dna plamki zwyrodnienia plamki żółtej związanych z wiekiem

Testy laboratoryjne mogą wykorzystać wartość prognostyczną z multimodalnego obrazowania zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) opartego na podłużnej optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ludzkie oczy dawcy z AMD i bez AMD są obrazowane za pomocą OCT, koloru, skaningowej oftalmoskopii laserowej w bliskiej podczerwieni i autofluorescencji na dwóch długościach fal wzbudzenia przed sekcją tkanki.

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Tutaj opisujemy techniki histologiczne wizualizacji tkanki oka bezpośrednio przylegającej do metalowej protezy nasiatkówkowej i siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi

Poznaj ilościową autofluorescencję dna oka w ocenie poziomu lipofuscyny w nabłonku barwnikowym siatkówki. Ta metoda umożliwia niezawodne monitorowanie zdrowia siatkówki i postępu zwyrodnień plamki żółtej.

Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki

Przeglądaj więcej filmów