Ilościowa autofluorescencja dna oka w ocenie chorób siatkówki
11 marca 2016
Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) wspiera siatkówkę czuciową poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego, które gromadzą się jako lipofuscyna. Produkty te są autofluorescencyjne i mogą być jakościowo obrazowane in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny RPE za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej.
Ogólnym celem ilościowej autofluorescencji lub qAF jest ocena ogólnego poziomu lipofuscyny w komórkach podporowych siatkówki, nabłonku barwnikowym siatkówki lub RPE, zarówno w zdrowych, jak i chorych oczach. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórek siatkówki, takie jak to, w jaki sposób zdrowie nabłonka barwnikowego siatkówki oddziałuje na rozwój zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem lub AMD. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na określenie bezwzględnych poziomów autofluorescencji lipofuscyny w dnie oka, a tym samym ilościową i powtarzalną obserwację między pacjentami, między sesjami obrazowania pacjentów oraz w dużych badanych populacjach.
Przed przystąpieniem do obrazowania należy odpowiednio skonfigurować skaningową opthamoskopię laserową ze skaningiem konfokalnym lub CSLO w celu uzyskania danych zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zamontować wewnętrzny fluorescencyjny odnośnik, który jest zakupiony u producenta, przekręć obiektyw, aby go wyjąć, odkręć metalowy pierścień urządzenia i zastąp go nowym metalowym pierścieniem zawierającym odniesienie. Istotne jest, aby źrenice były rozszerzone do co najmniej 6 mm, aby zapewnić nieprzerwany przepływ światła.
Za pomocą 0,5% tropikamidu i 2,5% fenylefryny należy rozszerzyć źrenice pacjenta o co najmniej 6 mm, co jest niezbędne do nieprzerwanego przepływu światła, aby zobaczyć i zmierzyć dno oka. Prawidłowo ułóż pacjenta na CSLO z podbródkiem opartym na podbródku, czołem opartym o oparcie czoła, a boczne canthi odpowiednio wyrównane ze wskaźnikami. Aby uzyskać obrazy bazowe, najpierw zobrazuj dno oka za pomocą reflicancji bliskiej podczerwieni lub światła podczerwonego, aby scentralizować kamerę nad plamką żółtą i uzyskać zgrubną ostrość.
Przy prawidłowym ustawieniu pacjenta przełącz ustawienia sprzętowe na panelu sterowania w tryb obrazowania w podczerwieni, ręcznie ustaw kamerę, aż dno oka będzie w pełni ostre i zrób zdjęcie. Dostosuj ustawienie na panelu sterowania do IROCT, który wykorzystuje optyczną koherentną tomografię spektralną lub SDOCT w połączeniu z obrazowaniem w podczerwieni do oceny plamki żółtej pod kątem choroby podstawowej. Skorzystaj z prowadnic znajdujących się w oknie obrazowania, aby prawidłowo zorientować OCT na obraz dna oka w podczerwieni.
Aby uzyskać optymalną jakość SDOCT, ustaw kamerę tak, aby obraz OCT znajdował się w górnej jednej trzeciej okna obrazowania. Uzyskaj co najmniej jeden skan linii poziomej przez dołek środkowy i obejmujący całe pole obrazowania. Aby skonfigurować obrazowanie qAF, użyj szybkiej akwizycji obrazu, która zmniejsza ryzyko utraty sygnału z powodu ruchu pacjenta i blokowania światła przez tęczówkę lub powieki.
Użyj średniej z 9 klatek, która szybko i sekwencyjnie przechwytuje dziewięć klatek obrazu, które są następnie uśredniane w celu redukcji szumów i artefaktów. Wybierz pole 30 x 30 stopni, które odnosi się do stopni obszaru siatkówki uchwyconego podczas akwizycji obrazu. Po ostrzeżeniu pacjenta o niebieskim świetle włącz tryb AF i ustaw oś aparatu tak, aby ekran był maksymalnie wypełniony AF dna oka, przy minimalnym przyciemnieniu boków i rogów obrazu.
Jeśli pacjenci mają trudności z tolerancją jasnego niebieskiego światła, odsuń kamerę dalej od oka, aby rozpocząć obrazowanie, i powoli zbliżaj kamerę do pacjenta, aż dno oka będzie w pełni widoczne. Ręcznie lub za pomocą joysticka opthamoskopowego dostosuj wyrównanie aparatu, przesuwając CSLO, aby zmienić położenie aparatu tak, aby sygnał AF był na najwyższym poziomie w całym polu, a nie uzyskuje najostrzejszy obraz. Podczas akwizycji obrazu kolorowe piksele widoczne zarówno w wewnętrznym odniesieniu, jak i na dnie oka wskazują na przesycenie, a co za tym idzie utratę sygnału.
Całkowicie naświetl siatkówkę na działanie światła AF przez co najmniej 20 sekund, aby zminimalizować absorpcję światła przez rodopsynę w siatkówce czuciowej podczas obrazowania. Użyj tego okresu, aby zoptymalizować wyrównanie, ostrość i czułość kamery. Spraw, aby obiekty mrugały przed każdym uzyskaniem obrazu, ponieważ świeża warstwa łzowa poprawia jakość sygnału.
Omijaj powieki w płaszczyźnie nabywania i zrób zdjęcie. Ważne jest, aby wygenerować co najmniej dwa obrazy wysokiej jakości na sesję obrazowania, aby mieć je do analizy danych. Wykonaj przetwarzanie po obrazie za pomocą oprogramowania CSLO do obliczenia średniej stosu dziewięciu klatek, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, w zdrowych oczach migotanie przedsionków emitowane z RPE jest rozprowadzane stosunkowo równomiernie w całym dnie. Zmniejszona intensywność jest widoczna w centralnym obszarze plamki żółtej z powodu blokowania światła przez pigment plamki żółtej oraz po bokach i w rogach ze względu na optykę oka i kamery.
Naczynia powinny być ciemne i wyraźnie ostre. Rysunek ten przedstawia odpowiednią prezentację mapy cieplnej poziomów qAF z tego rysunku. Chłodniejsze kolory odpowiadają obszarom o niższej intensywności AF, podczas gdy cieplejsze kolory odpowiadają obszarom o wyższej intensywności AF.
Maksymalna intensywność jest zwykle obserwowana w drugim koncentrycznym ośmiosegmentowym pierścieniu, a średnie intensywności w tym obszarze są używane do większości analiz danych. Pokazano tutaj reprezentatywną analizę oka z AMD, wykazującą atrofię geograficzną, zaawansowaną postać AMD. Ta postać AMD powoduje zlokalizowane obszary utraty RPE, o czym świadczy znacznie zmniejszone migotanie przedsionków lub ich brak, i powoduje postępującą utratę widzenia centralnego.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym doborze kandydatów na pacjentów i uzyskaniu wysokiej jakości obrazów, które można odtworzyć, aby zmaksymalizować jakość danych. Zastosowanie tej procedury może pozwolić na podłużną obserwację stanu zdrowia siatkówki w celu określenia postępu zwyrodnień siatkówki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie okulistyki do śledzenia i analizowania zwyrodnień siatkówki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać autofluorescencji ilościowej do oceny pacjentów ze zwyrodnieniami siatkówki. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł omawia metodę ilościowego obrazowania lipofuscyny w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE) przy użyciu konfokalnej skanującej laserowej oftalmoskopii (CSLO). Technika ma na celu ocenę poziomów lipofuscyny zarówno w zdrowych, jak i chorych oczach, przyczyniając się do naszego rozumienia biologii komórek siatkówki.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Oftalmologia
- Biologia komórki
Tło
- RPE wspiera czuciową siatkówkę poprzez recykling produktów ubocznych cyklu wzrokowego.
- Nagromadzenie lipofuscyny może wskazywać na zdrowie komórek.
- Zrozumienie poziomów lipofuscyny jest kluczowe dla badań nad zwyrodnieniami plamki żółtej związanymi z wiekiem (AMD).
- Ilościowe obrazowanie umożliwia powtarzalne oceny u pacjentów i w badaniach.
Cel badania
- Ilościowa ocena poziomów lipofuscyny w RPE.
- Zbadanie związku między zdrowiem RPE a rozwojem AMD.
- Ustawienie niezawodnej techniki obrazowania do zastosowań klinicznych i badawczych.
Stosowane metody
- Konfiguracja i kalibracja konfokalnej skanującej laserowej oftalmoskopii (CSLO).
- Użycie wewnętrznego fluorescencyjnego odniesienia dla dokładnych pomiarów.
- Rozszerzenie źrenic do co najmniej 6 mm dla optymalnego przepływu światła.
- Ilościowe obrazowanie autofluorescencyjne dna oka.
Główne wyniki
- Sukces w obrazowaniu poziomów lipofuscyny w różnych stanach oka.
- Ustawienie linii bazowych poziomów autofluorescencji do porównania.
- Wykazanie powtarzalności techniki w różnych sesjach obrazowania.
- Wgląd w rolę lipofuscyny w zdrowiu i chorobach siatkówki.
Wnioski
- Ilościowe obrazowanie lipofuscyny jest cennym narzędziem w badaniach nad siatkówką.
- Ta metoda poprawia nasze rozumienie funkcji i patologii RPE.
- Dalsze badania mogą wykorzystać tę technikę do zbadania AMD i innych chorób siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative fundus autofluorescence (qAF) enables reproducible, absolute measurement of retinal pigment epithelium (RPE) lipofuscin levels, providing a biomarker for cellular stress and degeneration in preclinical models of retinal disease. This approach supports target validation by correlating RPE functional status with sensory retina integrity, informing mechanistic de-risking in ophthalmology discovery programs. The technique enhances predictive confidence in lead identification by enabling longitudinal tracking of pathological progression in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying lipofuscin accumulation as a readout of RPE phagocytic and lysosomal function in disease models.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible assessment of RPE health across experimental conditions and timepoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking RPE lipofuscin levels to photoreceptor stress and degeneration, informing target confidence in preclinical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal models for downstream compound screening by establishing baseline lipofuscin levels and detection thresholds.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal fluorescent reference calibration and controlled imaging parameters.
- Scalability Value: Facilitates high-throughput applicability through rapid frame averaging and standardized field-of-view acquisition for large study populations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by linking RPE lipofuscin patterns to outer retina structural changes, supporting biomarker-aligned disease modeling.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, longitudinal tracking of degeneration progression in preclinical studies.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking by providing objective, correlative data on RPE functional decline preceding photoreceptor loss.
Pipeline & Workflow Integration
Quantitative autofluorescence integrates into the ophthalmology discovery continuum from early target validation through preclinical efficacy assessment, enabling data-driven go/no-go decisions based on RPE health metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying lipofuscin as a functional readout of RPE metabolic and lysosomal activity.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, noise-reduced imaging via mean-of-9-frames acquisition and standardized 30x30 degree field imaging.
- Analytics: Generates quantitative lipofuscin intensity maps and regional mean values (e.g., second concentric ring) for comparative analysis across conditions and longitudinal studies.
- Translational Research: Connects RPE lipofuscin metrics to sensory retina integrity, enabling preclinical continuity when structural and functional biomarkers align.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across disease models (e.g., AMD, inherited retinopathies) due to standardized calibration and imaging protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RPE-photoreceptor crosstalk.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via internal reference use, pupil dilation control, and consistent image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on quantifiable RPE stress biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through longitudinal, reproducible tracking of degeneration progression in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ophthalmic imaging and confocal scanning laser ophthalmoscopy operation.
- Dependent on CSLO instrumentation with autofluorescence mode and internal fluorescent reference compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for pupil dilation protocols (0.5% tropicamide, 2.5% phenylephrine) and imaging session consistency.
- Involves adaptation considerations across model species due to variations in fundus anatomy, lipofuscin fluorescence, and pupil size.
- Limited by signal saturation risk from prolonged blue light exposure and media opacity, requiring careful exposure timing and blink protocols.
