Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych
12 lutego 2016
Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.
Ogólnym celem tego protokołu jest zaprojektowanie trójwymiarowych rusztowań kolagenowych, które mogą przypominać cechy architektoniczne, skład i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak m.in. interakcje komórek ECM, wpływ cech architektonicznych na tworzenie tkanek inżynieryjnych oraz rozwój zamienników tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona realną procedurę rekapitulacji mikrogeometrii wewnętrznych kanałów i ścieżek przepływu z wysoką wiernością w materiale biodegradowalnym.
Procedurę zademonstruje Veronica Rodriguez-Rivera, adiunkt w moim laboratorium. Materiały użyte do przygotowania gumy BSA muszą być przechowywane i przechowywane w niskiej temperaturze do czasu, gdy będą gotowe do użycia, tak aby guma BSA nie stwardniała przedwcześnie. Sterylność jest również bardzo ważna w tej procedurze.
Najpierw wysterylizuj dozownik. W kapturze do hodowli niekomórkowych ułóż O-ringi, strzykawkę, jej nasadkę, końcówkę mieszającą i dozownik cztery do jednego. Sterylizuj te materiały promieniami UV przez 30 minut.
Najpierw skręć ze sobą dwie formy ze stali nierdzewnej i przymocuj blokadę Luer. Przed zamontowaniem dozownika należy spryskać pipety i odczynniki przed wprowadzeniem ich do okapu 70% etanolem. Najpierw przymocuj nasadkę końcówki do uchwytu roztworu.
Następnie załaduj 30% roztwór BSA do większej komory, nie zanieczyszczając drugiej komory. Pozostaw wystarczająco dużo miejsca na zamocowanie O-ringu. Następnie załaduj mniejszą komorę dozownika trzyprocentowym aldehydem glutarowym i przymocuj kolejny O-ring.
Teraz podłącz strzykawkę do dozownika. Następnie przechyl zespół tak, aby nasadka znajdowała się na górze, i zastąp nasadkę końcówką mieszającą. Następnie delikatnie postukaj w boki, aby pęcherzyki powietrza mogły przemieszczać się do góry.
Następnie umieść dozownik w autoklawizowanej torbie, aby pomieścić roztwór wydechowy. W torebce, trzymając dozownik w pozycji pionowej, napełnij niewielką ilością roztworu, aby usunąć całe powietrze ze strzykawki. Usuwanie powietrza jest bardzo ważne.
Następnie szybko przymocuj blokadę Luer formy Y ze stali nierdzewnej do końcówki strzykawki. Teraz, z pleśnią w niedominującej ręce, naprzemiennie wyrzucaj roztwór do lewego i prawego wylotu kanałów odpływowych. Dociśnij wydechy, wypełniając w ten sposób wewnętrzne puste przestrzenie roztworem.
Następnie ustaw formę poziomo i wstrzykuj do niej więcej roztworu, aż zostanie wykorzystana połowa objętości dozownika. Formę należy teraz umieścić w naczyniu, zawinąć w parafilm i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Ta procedura jest skalowana do czterech gramów zakwaszonego kolagenu.
Przechowuj go w chłodnym stanie do momentu użycia. Po zważeniu kolagenu przystąp do sterylizacji roztworu za pomocą promieniowania gamma. W przygotowaniu przygotuj świeży 0,2 normalny roztwór HEPES w wodzie.
Następnie przenieś zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dostosuj pH do dziewięciu za pomocą stężonego wodorotlenku sodu. Pamiętaj, aby wysterylizować kaptur promieniami UV i autoklawować kleszcze, szpatułkę i skalpel
.W kapturze wymieszaj 1,5 mililitra roztworu HEPES z 1,5 mililitra 10x MEM. Przechowuj tę mieszaninę na lodzie. Schłodź również 12-dołkową płytkę i 20-mililitrową strzykawkę w zamrażarce przez 10 minut.
Aby zwiększyć sterylność, spryskaj probówki i płytki 70% etanolem przed umieszczeniem ich w okapie. Spryskaj płytkę formy i umieść ją w masce. Następnie usuń gumowe foremki BSA za pomocą kleszczy.
Następnie odetnij kanały wydechowe z formy za pomocą skalpela. Następnie krótko zmieszaj mieszaninę HEPES-MEM i dodaj jeden mililitr do kolagenu. Następnie dokładnie wymieszaj roztwór sterylną szpatułką.
Następnie wykonaj krótki wir i szybko przenieś roztwór do zimnej, 20-mililitrowej strzykawki. Teraz, zabezpieczając gumę BSA wewnątrz studni, dozuj połowę roztworu hydrożelu kolagenowego do dna studzienki. Następnie za pomocą pęsety ustaw formę tak, aby gumowe końce dopływu i odpływu dotykały ścian studni.
Następnie przykryj formę hydrożelem kolagenowym. Teraz uszczelnij studnię parafilmem i załaduj płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odczekaj godzinę, aż kolagen się zpolimeryzuje.
W tym czasie utrzymuj włączone światło UV w okapie. Ustaw również aparat sieciujący UV tak, aby dostarczał 630 000 mikrodżuli na centymetr kwadratowy. Teraz spryskaj dłonie w rękawiczkach 70% etanolem i załaduj płytkę z formami pokrytymi kolagenem do środka sieciującego i rozpocznij proces naświetlania.
Po naświetlaniu należy ponownie spryskać rękawice i wyjąć płytkę z urządzenia sieciującego. Następnie za pomocą sterylnej szpatułki wyjmij żel z dołka, odwróć go i usieciuj dno hydrożelu. Po ostatnim cyklu sieciowania przystąp do trawienia enzymatycznego.
Aby usunąć gumę BSA bez naruszania rusztowania kolagenowego, użyj sterylnego 0,25% roztworu trypsyny o pH 7,8 i przeciśnij go przez filtr 0,20 mikrona. Przenieś wystarczającą ilość przefiltrowanego roztworu trypsyny do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie przenieś hydrożel kolagenowy do stożkowej rurki zawierającej roztwór enzymu.
Upewnij się, że hydrożel jest całkowicie pokryty roztworem. Uszczelnij probówkę parafilmem i delikatnie wiruj przez około minutę. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i pozwól trawieniu trwać przez 15 do 24 godzin.
Przez pierwsze cztery godziny wyjmuj probówkę co 15 do 30 minut i delikatnie ją wiruj, aby zakończyć trawienie gumy BSA. Następnego dnia trawienie uważa się za zakończone, gdy w roztworze nie unosi się guma lub w hydrożelu nie ma uszkodzonych kawałków gumy. Teraz zastąp roztwór trypsyny sterylnym roztworem Mosconas i pozwól probówce trząść się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.
Później odessaj roztwór Mosconas i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby w pełni oczyścić rusztowanie kolagenowe. W celu optymalizacji wykorzystania biogumy wykorzystano szereg testów, które zostały szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Korzystając ze zoptymalizowanego protokołu i trzech stałych części formy, hydrożele kolagenowe zostały wyprodukowane i szczegółowo zbadane.
Potrzebna forma Y została wykonana na maszynie Microlution. Do formy Y wstrzyknięto 30% BSA i 3% aldehydu glutarowego, które reagowały przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie gumę BSA odlewano z kolagenem i podgrzewano do 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Guma była trawiona enzymatycznie przez 15 godzin, co osłabiało ją do tego stopnia, że odpadała, nie wpływając na geometrię hydrożelu kolagenowego. Czteromilimetrowy kanał dopływowy odlewany przez formę został zmierzony suwmiarką tak, aby wynosił dokładnie cztery milimetry w hydrożelu kolagenowym. Testując stabilność formy, stwierdzono, że wymiary tak małe jak 300 mikronów można niezawodnie zaprojektować.
Ponadto rusztowania zostały przetestowane pod kątem pozostałości aldehydu glutarowego po umyciu Mosconas i nie znaleziono żadnych pozostałości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać rusztowania kolagenowe 3D, które mogą naśladować geometrie in vivo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, które uzupełniają tę technikę, takie jak tworzenie modeli 3D tkanek in vivo i wytwarzanie form o określonych cechach architektonicznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do zbadania interakcji między wewnętrznymi cechami architektonicznymi i komponentami macierzy a komórkami w modelach in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia innowacyjną technikę biofabrykacji w celu projektowania trójwymiarowych rusztowań kolagenowych, które naśladują cechy architektoniczne i właściwości mechaniczne tkanek in vivo. Metoda ta wykorzystuje nowo opracowany materiał poświęcalny, gumę BSA, aby precyzyjnie odtworzyć mikrogeometrię różnych tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biofabrykacja
- Opracowywanie rusztowań
Wstęp
- Badanie odnosi się do potrzeby stosowania realistycznych modeli tkanek w badaniach naukowych.
- Analizuje ono oddziaływania między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz ich znaczenie w tkankach inżynieryjnych.
- Technika ta ma na celu zwiększenie wierności odwzorowania zamienników tkanek.
- Utrzymanie sterylności oraz odpowiednie przechowywanie materiałów są kluczowe dla osiągnięcia sukcesu.
Cel badania
- Zaprojektowanie rusztowań, które ściśle przypominają tkankę in vivo.
- Zbadanie wpływu cech architektonicznych na inżynierię tkankową.
- Opracowanie niezawodnej metody tworzenia biodegradowalnych rusztowań.
Zastosowane metody
- Przygotowanie gumy BSA w kontrolowanych warunkach.
- Wykorzystanie materiału poświęcalnego do precyzyjnego przeniesienia cech przestrzennych.
- Demonstracja procedury przeprowadzona przez doświadczonego pracownika naukowego ze stopniem doktora.
- Zapewnienie sterylności i właściwego przechowywania materiałów.
Główne wyniki
- Technika ta skutecznie odtwarza mikrogeometrię tkanek.
- Osiągnięto wysoką precyzję w tworzeniu wewnętrznych kanałów przepływowych.
- Wyniki wskazują na potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej i produkcji zamienników tkanek.
- Wykazano znaczenie sposobu manipulowania materiałem w tym procesie.
Wnioski
- Metoda ta stanowi praktyczne podejście do wyzwań w inżynierii tkankowej.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie oddziaływań ECM w tkankach inżynieryjnych.
- Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do postępu w technologiach zastępowania tkanek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta technika biofabrykacji umożliwia precyzyjną replikację mikroarchitektury tkankowej w hydrożelach kolagenowych, wypełniając krytyczną lukę w wierności modeli przedklinicznych. Dzięki zapewnieniu skalowalnej metody projektowania zdefiniowanych kanałów w skali mikro i makro, wspiera ona ograniczanie ryzyka mechanistycznego w opracowywaniu terapii celowanych w tkanki. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w ocenie interakcji lek-tkanka w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu cech architektonicznych na oddziaływania między ECM a komórkami oraz aktywację szlaków sygnałowych w systemach istotnych dla patogenezy chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne geometrie rusztowań dla spójnych testów walidacji celów w różnych seriach eksperymentalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych rusztowań kolagenowych o mierzalnych wymiarach kanałów, co umożliwia wiarygodny screening związków w środowiskach biomimetycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analiz poprzez zastosowanie odlewania z wykorzystaniem form poświęcalnych, co redukuje zmienność w mikrofluidycznych modelach tkankowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia badanie zjawisk perfuzji i transportu w rusztowaniach naśladujących architekturę tkanki in vivo, co zwiększa trafność translacyjną biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych poprzez tworzenie rusztowań o zdefiniowanej geometrii, odpowiednich do długofalowych badań dojrzewania tkanek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając regulowalne, biodegradowalne rusztowania, które stanowią pomost między prostymi modelami 2D a złożonymi organoidami, wspierając tym samym weryfikację celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie kontrolowanych testów wpływu architektury rusztowania na odpowiedzi komórkowe na kandydatów na leki.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, o określonej architekturze hydrożele do ilościowej oceny penetracji związków i oddziaływania z celem.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar wymiarów kanałów (np. 3 mm i 4 mm) oraz integralności strukturalnej aż do 300 micronów, zapewniając obiektywne odczyty morfometryczne.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez generowanie rusztowań, których cechy architektoniczne można korelować z funkcjonalnymi efektami tkankowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do generowania standaryzowanych imitacji tkanek w wielu projektach za pomocą form projektowanych w systemie CAD oraz formowania z gumy BSA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach inżynierii tkankowej poprzez izolację zmiennych architektonicznych w badaniach nad sygnalizacją między macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) a komórkami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji procesu wytwarzania i enzymatycznego usuwania gumy BSA, co minimalizuje zmienność między partiami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając dane z rusztowań, które lepiej odwzorowują ograniczenia tkanek in vivo w zakresie dystrybucji leków i zachowania komórek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich skuteczność w systemach o zdefiniowanej architekturze, istotnych w kontekście danej choroby.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z biomateriałami, stosowania technik sterylnych oraz optymalizacji trawienia enzymatycznego.
- Zależne od dostępu do oprogramowania CAD, precyzyjnego sprzętu do formowania (np. Microlution) oraz kontrolowanych systemów inkubacji/sieciowania.
- Wymaga standaryzacji projektu formy, przygotowania gumy BSA oraz protokołów dla hydrożeli kolagenowych w ramach współpracy zespołów w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga rozważenia modyfikacji przy przenoszeniu techniki na różne stężenia kolagenu lub alternatywne polimery naturalne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność przechowywania prekursorów gumy BSA w niskich temperaturach oraz wydłużony czas trawienia (15–24 godziny) w celu całkowitego usunięcia materiału poświęcalnego.
