Name: Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę edycji genomu w ludzkich komórkach macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu elektroporacji i selekcji antybiotykowej. Protokół umożliwia modelowanie chorób i badania w biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem Brain Research Foundation (BRFSG-2014-02) dla Helen Bateup. Dirk Hockemeyer jest nowym stypendystą w dziedzinie starzenia się w Ellison Medical Foundation i jest wspierany przez Glenn Foundation, a także The Shurl and Kay Curci Foundation. DH jest również wspierany przez grant NIH 1R01CA196884-01.

Procedury opisane w tym manuskrypcie zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Komitet Nadzoru nad Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley.
1. Przygotowanie komórek macierzystych do edycji
<ol>
	<li>Hodować i hodować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) na 6-dołkowej płytce zawierającej 2,4 × 106 komórek/płytkę karmników z mitomycyną C-inaktywowanych mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) hodowanych na żelatynie 32. Utrzymać hPSC w 3 ml pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na studzienkę (pożywka hESC) i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 3% O2/5% CO2, 
	Uwaga: Aby protokół ten był skuteczny, nie jest konieczne utrzymywanie hPSC w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu; jednak ważne jest, aby pamiętać, że hPSC namnażają się szybciej w środowisku o wysokim poziomieO2, więc czas i liczba komórek powinny być odpowiednio dostosowane. Należy również zauważyć, że hPSC utrzymywane w niskiej zawartości tlenu mają niższe wskaźniki spontanicznego różnicowania 33.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 500 ml pożywki hESC, połącz 380 ml DMEM/F12, 75 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR). Dodaj glutaminę (1 mM stężenie końcowe), 5 ml 100x aminokwasy endogenne, 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny (P/S), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (stężenie końcowe 4 ng/ml) i 2-merkaptoetanol (stężenie końcowe 5,5 μM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień pożywkę, usuwając całą objętość pożywki (3 ml) za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Zastąp 3 ml ciepłym pożywką hESC za pomocą pipety serologicznej. Powtarzaj zmianę pożywki codziennie, aż hPSC osiągną około 50% zlewania się (dzień -1).</li>
	<li>Na dzień przed celowaniem (Dzień -1) zmień pożywkę hESC, usuwając starą pożywkę i dodając ciepłą pożywkę hESC uzupełnioną 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Również w dniu -1 przygotuj jedną lub dwie 6-dołkowe lub 10-centymetrowe płytki lekoopornych komórek zasilających MEF od myszy DR4 (2,4 × 106 komórek / płytkę) 34, 
	Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, płytki 6-dołkowe są lepsze niż płytki 10 cm, ponieważ mieszczą więcej pożywki. Płytki 6-dołkowe zapewniają również, że różne klony z różnych studni są niezależne. Jednak płytka o średnicy 10 cm pozwoli na łatwiejsze zbieranie, w zależności od mikroskopu dostępnego do tego procesu.</li>
</ol>
2. Edycja pluripotencjalnych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przygotować roztwory transfekcji, pipetując po 5 μg ZFN 1 i 2, TALEN 1 i 2 lub 15 μg plazmidu kodującego CRISPR/Cas9 px330 (rysunek 1) do probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 30 μg plazmidu naprawczego również do tej probówki. Na koniec odpipetować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do probówki, aby zwiększyć objętość do 300 μl. 
	Uwaga: Przygotować plazmidy jako midiprep (odpowiedni jest dowolny zestaw) o minimalnym stężeniu 300 ng/μl, aby utrzymać całkowitą objętość roztworu do transfekcji poniżej 300 μl. Nie jest konieczne przeprowadzanie ekstrakcji fenolu/chloroformu, linearyzacja plazmidu ani stosowanie zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn.</li>
	<li>Usuń pożywkę z hPSC za pomocą szklanej pipety i odkurz. Odpipetować 2 ml ciepłej 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki.</li>
	<li>Natychmiast wyjmij PBS za pomocą szklanej pipety i odkurz. Dodaj 0,5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA bezpośrednio na komórki w każdym dołku. Umieścić w inkubatorze (37 °C/5% CO2 / 3% O2) na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa podajnika zacznie odnosić się od płytki.</li>
	<li>Dodaj 2 ml ciepłej pożywki esWash (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 jednostek/ml P/S) do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki podajnika są zdejmowane jako arkusz. Odpipetować zawartość każdej studzienki do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, łącząc wszystkie studzienki. Roztrzeć komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Nie ma potrzeby rozbijania warstwy zasilającej; hPSC odpadną z warstwy zasilającej przez delikatne rozcieranie. Powinno być około 15 ml zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dodaj 25 ml pożywki esWash do probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 40 ml. Pozwól, aby duże kawałki podajnika osiadły na dnie rurki przez 1-2 minuty. Usunąć supernatant (~38 ml) z probówki za pomocą pipety serologicznej i umieścić w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 190 x g. Usunąć supernatant z probówki za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS. Połączyć z przygotowanym wcześniej roztworem do transfekcji plazmidu. Policz komórki na tym etapie. Użyj 5-10 milionów ogniw na elektroporację.</li>
	<li>Całą zawiesinę o objętości 800 μl należy odpipetować do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 4 mm, umieścić na lodzie na 3-5 minut. Elektroporować ogniwa za pomocą programu wykładniczego w systemie elektroporacji o następujących parametrach: 250 V, 500 μF, rezystancja ∞ i rozmiar kuwety 4 mm. Po elektroporacji umieść kuwetę z powrotem na lodzie na 3 min. 
	Uwaga: Przestrzegać stałej czasowej elektroporacji w systemie elektroporacji. Stała czasowa zmienia się w zależności od liczby komórek i czystości DNA. Udane transfekcje zwykle mają stałą czasową między 10-14 ms przy użyciu wymienionych warunków i pulsera genu II. Niższe sprawności elektroporacji mogą wystąpić, gdy stałe czasowe różnią się od tych wartości.</li>
	<li>Zawiesić elektroporowane ogniwa w 18 ml ciepłych pożywkach hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Umieścić 3 ml tej zawiesiny jednokomórkowej w każdym dołku płytki 6-dołkowej z komórkami zasilającymi DR4. Wrócić do inkubatora (37 °C/5% CO2 / 3% O2).</li>
</ol>
3. Wybór pozytywnych kolonii
<ol>
	<li>Dzień 2, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Dzień 3, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłej pożywki z ludzkimi aktywnymi komórkami macierzystymi bez dołączania Y-27632. Dzień 4, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych antybiotykami do selekcji. Powrót do inkubatora (37 °C/5% CO2 / 3% O2). 
	Uwaga: Rodzaj zastosowanego antybiotyku będzie zależał od kasety oporności zawartej w szablonie naprawczym. Podczas pracy z hPSC WIBR#3 (rejestr NIH 0079) z powodzeniem zastosowano 0,5 μg/ml puromycyny, 70 μg/ml G418 (genetycyna) i 35 μg/ml higromycyny. Stężenia do selekcji powinny być określone empirycznie poprzez ustalenie minimalnego stężenia antybiotyku potrzebnego do zabicia komórek typu dzikiego w ciągu około jednego tygodnia.</li>
	<li>W dniach 5-12 zmieniaj pożywkę codziennie, za każdym razem zastępując starą pożywkę ciepłym pożywką hESC uzupełnioną antybiotykami. 
	Uwaga: Spodziewaj się dużej ilości śmierci komórki. Poszczególne kolonie pojawią się około 8-10 dnia. Zwykłe pożywki z hESC bez antybiotyków można stosować po 12-14 dniach ciągłej selekcji. Jeśli gęstość komórek jest wysoka lub śmierć komórek jest powolna, należy unikać zakwaszania pożywki i może być konieczne zwiększenie objętości pożywki (do 4-5 ml) w ciągu pierwszych kilku dni selekcji.</li>
</ol>
4. Wybieranie wybranych kolonii (Dzień 12-14)
<ol>
	<li>Obserwuj kolonie w dniach 12-14. Obserwuj kolonie, które są gotowe do skubania pod mikroskopem preparacyjnym i upewnij się, że nie zawierają komórek, które zaczynają się różnicować. Przybliżony rozmiar powinien wynosić 800-1 200 μM. Jeśli kolonie osiągną tę wielkość przed 12 dniem, zaleca się, aby zostały zebrane wtedy. 
	Uwaga: Do każdego eksperymentu z celowaniem wybierz tyle kolonii, ile jest to konieczne, aby zapewnić wyizolowanie pożądanego genotypu. Na przykład edycja AAVS1 za pomocą szablonu naprawczego AAV-CAGGS-EGFP wykazała niezmiennie solidną integrację i wymaga tylko 12-24 kolonii, aby uzyskać około 5-10 heterozygycznie ukierunkowanych klonów. Inne eksperymenty z celowaniem mogą wymagać zebrania większej liczby kolonii (Tabela 1). Częstotliwość prawidłowych zdarzeń kierowania zależy od takich czynników, jak skuteczność numeru SSN w celu wprowadzenia DSB, rozmiar wkładki i strategia wyboru. W przypadku przedstawionego tutaj podejścia opartego na pułapce genowej dla locus AAVS1, marker selekcyjny ulega ekspresji tylko wtedy, gdy jest prawidłowo zintegrowany w miejscu docelowym, co zmniejsza liczbę kolonii wymaganych do uzyskania prawidłowo ukierunkowanego klonu.</li>
	<li>Dzień przed zbiorem przygotuj 12-dołkowe płytki MEF (2,4 × 106 komórek/płytkę, jedna studzienka zostanie użyta na każdą pobraną kolonię).</li>
	<li>W dniu pobrania należy usunąć wszystkie podłoża z 12-dołkowych płytek MEF za pomocą szklanej pipety i odkurzyć, a następnie zastąpić je 1 ml pożywki hESC. Również w dniu pobrania należy zmienić pożywkę hESC na 6 płytkach dołkowych, które mają zostać pobrane.</li>
	<li>Wyciągnij szklane pipety do mechanicznej dysocjacji poszczególnych kolonii od warstwy podajnika. Opuść pipety na palnik Bunsena w okapie i zmiękcz w punkcie rozprężania, aż szkło stanie się plastyczne. Szybko zdejmij z ognia i rozsuń pipetę, tworząc punkt kątowy. Przełam punkt około 2 cm od zgiętej osi, pozostawiając wąski kanał. Wypoleruj koniec kanału, wystawiając go na działanie płomienia przez 1-2 sek. 
	Uwaga: Opcjonalnie należy wybrać kolonie za pomocą końcówki pipety p20, jednak może to zmniejszyć klonalność hodowli, ponieważ końcówka może przemieścić większą ilość komórek z każdej kolonii do pożywki, potencjalnie zanieczyszczając kolejne pobrania.</li>
	<li>Zamontuj urządzenie zbierające, biorąc końcówkę pipety filtra p1000 i mocując bańkę ssącą do wąskiego końca. Włóż wyciągniętą szklaną pipetę do szerokiego końca.</li>
	<li>Umieścić 6-dołkową płytkę hPSC do pobrania na stoliku mikroskopu preparacyjnego zamontowanego w kapturze do hodowli tkankowej. Ściśnij gruszkę urządzenia zbierającego i delikatnie wytnij i pokrój pojedynczą kolonię na 10-20 równych kawałków, uważając, aby nie wypuścić kawałków na podłoże. Wyjmij wycięte kawałki kolonii hPSC do pipety, zwalniając bańkę. Staraj się zabierać jak najmniej nośników podczas przesyłania.</li>
	<li>Przenieś pojedynczą kolonię do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce MEF, ponownie ściskając bańkę bezpośrednio do studzienki, uwalniając teraz uszkodzoną kolonię. Oznacz każdą studzienkę, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację klonów pochodzących z pojedynczych komórek. Powtórz dla tylu kolonii, ile to konieczne, za każdym razem zmieniając szklaną pipetę. 
	Uwaga: Nauka zbierania kolonii może zająć trochę czasu. Zaleca się, aby eksperymentator ćwiczył na niektórych komórkach kontrolnych przed próbą wyizolowania docelowych kolonii.</li>
	<li>Włożyć 12 dołków do inkubatora (37 °C/3% O2/5% CO2 ), delikatnie kołysząc najpierw płytką, aby uniknąć gromadzenia się komórek w środku każdej studzienki.</li>
	<li>Następnego dnia i każdego następnego dnia należy usunąć pełną objętość pożywki za pomocą szklanej pipety i odkurzyć, a następnie zastąpić 1,5 ml ciepłej pożywki hESC, aż komórki zlewają się w około 50% (zwykle trwa to 10-12 dni).</li>
	<li>Po 10-12 dniach wybierz jedną do dwóch kolonii z każdej studzienki i przenieś na nowe 12-dołkowe płytki MEF, powtarzając kroki 4.1-4.8, aby wygenerować replikę płytki.</li>
	<li>Ekstrahować DNA (patrz poniżej) z pozostałych kolonii w każdym dołku oryginalnych płytek MEF.
	<ol>
		<li>Usuń media ze wszystkich studzienek za pomocą szklanej pipety i odkurz. Odpipetować 1 ml 1x PBS do każdej studzienki, aby przepłukać komórki. Usuń PBS za pomocą szklanej pipety i odkurzacza. Odpipetować 250 μl buforu do lizy komórek (końcowe stężenia wH2O: 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg/ml Proteinazy-K) do każdego dołka. Umieścić w inkubatorze (37 °C/3% O2/5% CO2) O/N.</li>
		<li>Następnego dnia odpipetować zawartość każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 250 μl alkoholu izopropylowego do każdej probówki, aby wytrącić DNA. Energicznie wstrząśnij tubką. Powinien być widoczny biały osad.</li>
		<li>Wiruj każdą probówkę przez 3 minuty z prędkością 13 000 obr./min w wirówce stołowej. Po odwirowaniu wyrzuć supernatant przez dekantację do odpadów płynnych. Mały granulek DNA powinien pozostać przyklejony do dna probówki. Odpipetować 250 μl 70% etanolu do każdej probówki, aby przepłukać osad DNA. Wstrząśnij energicznie. Wiruj każdą probówkę przez 3 minuty z prędkością 13 000 obr./min w wirówce stołowej.</li>
		<li>Po odwirowaniu wyrzuć supernatant przez dekantację do odpadów płynnych. Mały granulek DNA powinien pozostać przyklejony do dna probówki. Odpipetować pozostałą część supernatantu, tak aby w probówce nie pozostał żaden płyn. Pozostaw probówkę otwartą do wyschnięcia na blacie na 5-10 minut. Po wysuszeniu ponownie zawiesić DNA w 250 μl buforu TE. Umieścić w temperaturze 37 °C na 6 godzin, aby umożliwić rozpuszczenie DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotyp każdej próbki przy użyciu wstępnie zoptymalizowanej strategii PCR lub southern blot. 
	Uwaga: W przypadku kierowania AAVS1 przy użyciu szablonu naprawczego AAV-CAGGS-EGFP, strategię southern blot można znaleźć w Hockemeyer et al., 2009 4. Kompleksowy protokół southern blotting można znaleźć w Southern, 2006 35. W przypadku genotypowania multipleksowego PCR tego samego eksperymentu, startery i warunki można znaleźć w Tabeli 2 36.</li>
	<li>Wyrzuć studzienki, które nie są odpowiednio ukierunkowane i kontynuuj codzienną wymianę pożywek hESC na prawidłowo ukierunkowanych komórkach. Zamroź komórki, gdy są w około 50% zlewne, patrz poniżej protokół zamrażania.
	<ol>
		<li>Na dzień przed zamrożeniem zmień pożywkę hESC, usuwając starą pożywkę i dodając ciepłą pożywkę hESC uzupełnioną 10 μM Y-27632.</li>
		<li>W dniu zamrażania przygotować po 0,5 ml roztworu A i roztworu B na zagłębienie 12-dołkowej płytki, która jest zamrażana w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Umieść roztwory na lodzie. Roztwór A: 50% pożywki hESC i 50% FBS; Roztwór B: 80% FBS i 20% dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Zdysocjuj kolonie hPSC na pojedyncze komórki przed zamrożeniem. Wykonaj kroki 2.2-2.8, aby to zrobić, odpowiednio skalując woluminy. Całkowicie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml roztworu A.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml roztworu B do zawiesiny komórek, pipetować w górę i w dół, aby zawiesina komórek była jednorodna. Weź całkowitą objętość zawiesiny komórek (~1 ml) i umieść w krioprobówce o pojemności 2 ml. Mocno zakręć nakrętkę.</li>
		<li>Umieść krioprobówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Dzień po zamrożeniu wyjmij zamrożone komórki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i natychmiast umieść w zbiorniku z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+targetable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with targetable nucleases.</a> Annu Rev Biochem. 83, 409-439 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239ps6(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bozas, A., Beumer, K. J., Trautman, J. K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+zinc-finger+nuclease-induced+gene+targeting+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in drosophila.</a> Genetics. 182 (3), 641-651 (2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+the+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. the new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2Fcas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genomes+with+rare-cutting+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases.</a> Trends Genet. 12 (6), 224-228 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Sander, J. D., Maeder, M. L., Reyon, D., Voytas, D. F., Joung, J. K., Dobbs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZiFiT+%28zinc+finger+targeter%29%3A+An+updated+zinc+finger+engineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ZiFiT (zinc finger targeter): An updated zinc finger engineering tool.</a> Nucleic Acids Res. 38, W462-W468 (2010).</li>
<li>Carroll, D., Morton, J. J., Beumer, K. J., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+construction+and+in+vitro+testing+of+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1329-1341 (2006).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), e82(2011).</li>
<li>Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat Biotechnol. 30 (5), 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat Protoc. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from neisseria meningitidis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Podhajska, A. J., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+the+FokI+endonuclease+to+a+universal+restriction+enzyme%3A+Cleavage+of+phage+M13mp7+DNA+at+predetermined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conversion of the FokI endonuclease to a universal restriction enzyme: Cleavage of phage M13mp7 DNA at predetermined sites.</a> Gene. 40 (2-3), 175-182 (1985).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for genetic modification of human embryonic stem cells using electroporation.</a> Nat Protoc. 2 (4), 792-796 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. 515 (7527), 414-418 (2014).</li>
<li>Chiba, K., Hockemeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+site-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human pluripotent stem cells using site-specific nucleases.</a> Methods Mol Biol. 1239, 267-280 (2015).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Ezashi, T., Das, P., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+O2+tensions+and+the+prevention+of+differentiation+of+hES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (13), 4783-4788 (2005).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Southern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Southern+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Southern blotting.</a> Nat Protoc. 1 (2), 518-525 (2006).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., Vogt, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR%3A+Critical+parameters+and+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol.</a> BioTechniques. 23 (3), 504-511 (1997).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Sexton, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+identification+of+three+human+TPP1+functions+in+telomerase+action%3A+Recruitment%2C+activation%2C+and+homeostasis+set+point+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular identification of three human TPP1 functions in telomerase action: Recruitment, activation, and homeostasis set point regulation.</a> Genes Dev. 28 (17), 1885-1899 (2014).</li>
<li>Merkle, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+generation+of+knockin+human+pluripotent+stem+cells+lacking+undesired+mutations+at+the+targeted+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus.</a> Cell Rep. 11 (6), 875-883 (2015).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Forster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+tissue+with+adult+stem+cell+properties+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intestinal tissue with adult stem cell properties derived from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 838-852 (2014).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+specificity+of+TALE-based+genome+editing+using+an+expanded+RVD+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved specificity of TALE-based genome editing using an expanded RVD repertoire.</a> Nat Methods. , (2015).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (6), 1436-1443 (2008).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4, 5400(2014).</li>
<li>Ousterout, D. G., Kabadi, A. M., Thakore, P. I., Majoros, W. H., Reddy, T. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda izolowania jednorodnych populacji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z edytowanymi genami jest skutecznym podejściem do generowania izogenicznych linii hPSC, które różnią się tylko w docelowym locus. Komórki te są idealnym systemem do badania mechanizmów różnicowania i rozwoju komórek człowieka, a także do zrozumienia patofizjologii chorób monogenowych w kontrolowanym środowisku genetycznym. Jak pokazano tutaj, możliwe jest zastosowanie trzech niezależnych strategii projektowania SSN (ZFNs, TALENs i CRISPR/Cas9) w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji w locus AAVS1. Każda z tych metodologii ma swoje zalety i wady. Potencjalną zaletą ZFN i, do pewnego stopnia, TALEN-ów jest ich elastyczność projektowania, która pozwala na inżynierię iteracyjną w celu poprawy domen wiążących DNA poszczególnych nukleaz 42. Ta optymalizacja nukleaz może zwiększyć specyficzność ZFN i TALEN-ów poza to, co jest możliwe do osiągnięcia za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Taka selektywność może być istotna w przypadku zastosowań klinicznych wymagających wysokiego stopnia swoistości docelowej. Podstawową zaletą systemu CRISPR/Cas9 jest łatwość jego obsługi. Chociaż zestawy konstrukcyjne TALEN i ZFN zostały udostępnione publicznie (tj. za pośrednictwem Addgene 21), SSN oparte na CRISPR/Cas9 są znacznie łatwiejsze do skonstruowania, ponieważ jedynym niezbędnym dostosowaniem jest oligonukleotyd o 20 parach zasad (przy użyciu projektu plazmidu px330 14). Ta prostota okazuje się korzystna dla laboratoriów badawczych, które chcą włączyć edycję genomu do swoich badań.
Istnieją alternatywne techniki transfekcji, w tym nukleofekcja 43, w celu stworzenia linii hPSC z edytowanymi genami; Wykazano jednak, że elektroporacja jest stała i opłacalna 4,5,25. Nukleofekcja może być stosowana do bezpośredniej transfekcji kompleksów rybonukleoproteinowych RNA prowadzących Cas9 do jądra, zwiększając wydajność i wierność SSN 44. Hodowla hPSC na MEF jest solidną i niedrogą metodą utrzymania hPSC w stanie pluripotencjalnym bez nadmiernego różnicowania. Ponadto pozwala na łatwą izolację genetycznie identycznych kolonii. Alternatywnie możliwe jest hodowanie hPSC bez MEF, jednak te warunki hodowli mogą być droższe niż hodowle oparte na karmicielu. Co więcej, cały proces jest skalowalny, co pozwala na izolację bardzo rzadkich zdarzeń edycyjnych lub generowanie wielu odrębnych linii komórkowych w równoległych eksperymentach edycyjnych.
Opisany tutaj protokół jest solidny; Istnieje jednak kilka kluczowych kroków, które wpływają na wydajność, z jaką można uzyskać poprawnie edytowane klony. Najważniejszym elementem tej metody jest posiadanie wysokiej jakości MEF-ów i lekoopornych MEF-ów DR4. Przeżywalność pojedynczych komórek hPSC jest niewielka, a MEF-y niskiej jakości utrudniają izolację niezróżnicowanych linii hPSC. Po drugie, zastosowanie Y-27632 jest również kluczem do umożliwienia przeżycia pojedynczej komórki bez generowania selektywnego ciśnienia dla komórek z nieprawidłowym kariotypem 45. Po trzecie, wybieranie dobrze rozmieszczonych kolonii zapewnia jednorodność genetyczną pochodnych linii komórkowych. Na koniec ważne jest, aby przygotować szklane pipety tak, aby otwór był wystarczająco mały, aby rozbić kolonię na wiele mniejszych kawałków, zapewniając, że w nowej studzience wyrośnie wiele kolonii. Pozwala to na wybieranie dobrze rozmieszczonych subklonów do repliki płytki, która ma być w hodowli, pozostawiając oryginalną płytkę izolowanych kolonii do genotypowania. Wyzwaniem w tym protokole jest ręczne wyciąganie szklanych pipet; Należy to przećwiczyć wcześniej. Należy zauważyć, że istnieje wiele technik pobierania klonów, które nie wymagają szklanej pipety. Eksperymentatorzy są zachęcani do znalezienia tego, który jest dla nich najlepszy.
Istnieją ograniczenia tego protokołu, które można przezwyciężyć za pomocą prostych modyfikacji. Eksperyment mający na celu jedynie zakłócenie interesującego go miejsca bez naprawy lub taki, którego szablon naprawy nie zawiera kasety wyboru, musi użyć innej metody wzbogacania dla komórek, które były edytowane. Należy zauważyć, że liczba kolonii, które muszą zostać zebrane, aby znaleźć pozytywny klon, znacznie wzrasta w przypadku braku selekcji. Jedną ze strategii poprawy wydajności jest kotransfekcja nieintegrującego plazmidu, który wyraża białko fluorescencyjne. Po pozostawieniu komórek na regenerację przez dwa dni, docelowe komórki można sortować według dodatniej fluorescencji za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją i ponownie platerować 29. Proces ten wzbogaca komórki, które zostały transfekowane plazmidami przez elektroporację, a tym samym zwiększa prawdopodobieństwo jednoczesnego zdarzenia edycyjnego w komórce.
Opisane tutaj techniki można rozszerzyć o wykorzystanie wielu przewodników RNA do jednoczesnego celowania w kilka loci 14,46,47. Ustanowiono wiele protokołów różnicowania hPSC w różne typy komórek, co pozwala na różne manipulacje genetyczne w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania 30. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy potencjał efektywnej edycji genomu w hPSC niezależnie od wyboru SSN. Proponujemy, aby technikę tę można było zaadaptować do tworzenia izogenicznych linii hPSC, które zostały poddane edycji genów w dowolnym locus genomu.

Technologie edycji genomu szybko ewoluują w kierunku standardowych narzędzi dla biologii molekularnej i komórkowej 1. Inżynieria genetyczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest szczególnie interesująca, ponieważ hPSC stanowią samoodnawiające się źródło genetycznie nienaruszonych pierwotnych komórek ludzkich. Komórki hPSC można różnicować w różne typy komórek w celu modelowania choroby lub jako źródło terapii transplantacyjnych 2,3. Zademonstrowano tutaj protokół, który wykorzystuje trzy różne typy nukleaz specyficznych dla miejsca (SSN) w połączeniu z endogennymi mechanizmami naprawy DNA w celu ukierunkowanej integracji konstruktu reporterowego w locus AAVS1. Po transfekcji SSN do hPSC pokazujemy, jak wyizolować izogeniczne populacje komórek, w których znajduje się reporter.
Zdolność do manipulowania genomami, szczególnie genomami pluripotencjalnych komórek macierzystych, za pomocą SSN nie jest nowym zjawiskiem, ponieważ przydatność nukleaz palca cynkowego (ZFN) i aktywatorów transkrypcji do edycji genów została zademonstrowana kilka lat temu 4-10. Jednak wraz z pojawieniem się technologii S. pyogenes CRISPR/Cas9 11-13 edycja genów stała się powszechnie dostępna 14. Wszystkie SSN wprowadzają dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) w określonym miejscu docelowym 1,4,5,11, które jest naprawiane przez endogenne mechanizmy komórkowe przy użyciu niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy kierowanej homologią (HDR) 15. NHEJ jest podatny na błędy i może wprowadzać mutacje powodujące przesunięcie ramki odczytu, powodując utratę funkcji genu, podczas gdy HDR pozwala na wprowadzenie nowych elementów poprzez kotransfekcję matrycy naprawczej z SSN. Chociaż uważa się, że podstawowe zasady naprawy DNA, które ułatwiają edycję genów, są w dużej mierze takie same dla każdego SSN, można zauważyć pewne różnice między platformami. Projektowanie de novo ZFN pozwala na elastyczność i optymalizację nukleaz 16, jednak wykorzystanie publicznie dostępnych bibliotek montażowych i narzędzi przesiewowych do projektowania poszczególnych ZFN może być czasochłonne. Po określeniu pożądanego miejsca dla kierowania za pośrednictwem ZFN, pary ZFN można zaprojektować za pomocą narzędzia online ZiFit 17. Po zaprojektowaniu, ZFN mogą być modułowo montowane poprzez kilka rund klonowania plazmidu 18. Alternatywnie istnieje wiele dostępnych na rynku, wstępnie zatwierdzonych ZFN 19. Nukleazy TALE można również projektować przy użyciu narzędzi internetowych i publicznie dostępnych komponentów 17,20. Na przykład, TALEN-y można szybko złożyć z bloków po pięć powtórzeń TALE, za pomocą zestawu FLASH 21 lub za pomocą hierarchicznego montażu Golden Gate 22 opartego na PCR. Łatwość projektowania SSN i szybkość budowy przy użyciu CRISPR/Cas9 sprawiły, że edycja genomu stała się powszechnie dostępnym narzędziem. Celowanie CRISPR/Cas9 za pośrednictwem krótkiego przewodnika RNA pozwala również na multipleksowanie przewodnikowych RNA w celu ukierunkowania kilku loci za pomocą jednego konstruktu 14. Konstrukcja Cas9 do edycji genów wymaga jedynie identyfikacji motywu przylegającego do protospaceru (PAM; trynukleotyd NGG dla S. pyrogenes Cas9) proksymalnego do locus docelowego. Poprzez wstawienie oligonukleotydu odpowiadającego 20 parom zasad 5' PAM do plazmidu px330 14, konstrukt można złożyć w jednym kroku klonowania. Oprócz S. pyogenes Cas9, wykazano, że Cas9 z N. meningitidis (NmCas9), który rozpoznaje 5′-NNNNGATT-3′ (PAM), umożliwia efektywną edycję genów w hPSC 23.
Oprócz różnic w łatwości projektowania SSN, każda platforma ma specyficzne właściwości. Na przykład ZFN i TALEN-y wykorzystują domenę nukleazy FokI, która generuje czteronukleotydowy zwis 5' 24, podczas gdy uważa się, że Cas9 generuje głównie tępo zakończone DSB. ZFN, TALEN i Cas9 różnią się stabilnością białka, szybkością włączania i wyłączania docelowego DNA i trybem skanowania DNA, z których wszystkie mogą teoretycznie skutkować niewielkimi różnicami w wyniku edycji 1. Chociaż konieczne będą dalsze badania, aby w pełni zrozumieć konsekwencje tych różnic, opisujemy tutaj protokół, który jest bardzo solidny na wszystkich trzech platformach i może być używany do łatwego generowania genetycznie zmodyfikowanych hPSC.
Niezależnie od wyboru SSN, elektroporacja jest solidną procedurą transfekcji SSN i szablonów naprawy homologii do hPSC 25. Liczba kolonii, które przeżyły po selekcji pod kątem oporności na antybiotyki, zależy od parametrów specyficznych dla locus i strategii edycji (np. wielkości transgenicznej insercji i trybu selekcji). Opisany tutaj protokół zwykle skutkuje około 150-400 koloniami pochodzącymi z pojedynczych komórek.
Edycja genów w locus AAVS1 przy użyciu tego protokołu była wcześniej używana do wykazania skuteczności SSN 4,5. Matryca naprawcza AAV-CAGGS-EGFP wykorzystuje strategię pułapki genowej w celu nadania oporności na puromycynę w sposób specyficzny dla locus. Krótko mówiąc, szablon naprawy zawiera miejsce akceptora spawów przed kasetą oporności puromycyny bez promotora. Po prawidłowej integracji z pierwszym intronem genu PPP1R12C w locus AAVS1, kaseta oporności ulega ekspresji z promotora edytowanego genu. Solidność tego specyficznego testu AAVS1 pozwala nam porównać wydajność każdej platformy SSN.
Edycja genów za pomocą SSN jest potężna, biorąc pod uwagę możliwość zakłócenia i/lub teoretycznej zmiany dowolnego genu. Zastosowanie tej strategii do hPSC zapewnia wszechstronność, ponieważ hPSC mogą być następnie różnicowane w wiele typów komórek ludzkich, takich jak neurony 26, hepatocyty 27 i kardiomiocyty 28. Ponadto zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących od pacjenta umożliwia naprawę lub wprowadzenie znanych mutacji powodujących chorobę w specyficznym dla pacjenta tle genetycznym 29, zapewniając platformę do badania mechanizmów chorobowych i testowania terapii przy użyciu własnych komórek pacjenta 30. Podsumowując, edycja genów w hPSC jest skutecznym i wszechstronnym podejściem do badania podstawowej biologii rozwoju i choroby człowieka 31.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów - podstawowe</td><td>technologie życia</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Kuwety do elektroporacji</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>Pulser genowy X-cel II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10 razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, zatkane</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml Kriorurki</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi genetycznie kontrolowaną i klinicznie istotną platformę, dzięki której można zrozumieć rozwój człowieka i zbadać patofizjologię choroby. Dzięki zastosowaniu nukleaz specyficznych dla miejsca (SSN) do edycji genomu, możliwe staje się szybkie wyprowadzenie nowych linii hPSC zawierających specyficzne zmiany genetyczne w warunkach izogenicznych. Najczęściej stosowanymi SSN są nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas9. Wszystkie te nukleazy działają poprzez wprowadzenie dwuniciowego pęknięcia DNA w określonym miejscu, promując w ten sposób precyzyjną edycję genów w locus genomu. Edycja genomu medytowana przez SSN wykorzystuje dwa z endogennych mechanizmów naprawy DNA komórki, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawę sterowaną homologią (HDR), w celu wprowadzenia mutacji insercji/delecji lub zmiany genomu za pomocą homologicznego szablonu naprawy w miejscu pęknięcia dwuniciowego. Elektroporacja hPSC jest skutecznym sposobem transfekcji SSN i matryc naprawczych, które zawierają transgeny, takie jak reportery fluorescencyjne i kasety oporności na antybiotyki. Po elektroporacji możliwe jest wyizolowanie tylko tych hPSC, które zawierały konstrukt naprawczy, poprzez selekcję pod kątem oporności na antybiotyki. Mechaniczne rozdzielenie kolonii hPSC i potwierdzenie prawidłowej integracji w miejscu docelowym poprzez genotypowanie pozwala na izolację prawidłowo ukierunkowanych i genetycznie jednorodnych linii komórkowych. Ważność tego protokołu została tutaj wykazana poprzez wykorzystanie wszystkich trzech platform SSN do włączenia EGFP i konstruktu oporności na puromycynę do locus AAVS1 safe harbor w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

W niniejszej pracy prezentujemy protokół kompatybilny z trzema różnymi platformami SSN służący do tworzenia genetycznie zmodyfikowanych linii hPSC. Wykorzystując wcześniej opublikowane ZFN 4, TALEN 5 oraz CRISPR/Cas9 37, dokonaliśmy celowania w locus AAVS1 w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych WIBR#3, stosując matrycę naprawczą wprowadzającą reporter EGFP oraz kasetę oporności na puromycynę 4.
Hodowaliśmy hPSC na MEF w ramach procesu hodowli komórkowej umożliwiającego utrzymanie i ekspansję niezróżnicowanych hPSC (Rycina 2), który jest jednocześnie kosztowo efektywny i skalowalny. Jeśli komórki są hodowane dłużej niż to konieczne, istnieje ryzyko zwiększenia różnicowania, co zmniejsza liczbę transfektowanych komórek pluripotencjalnych, a w konsekwencji liczbę uzyskanych prawidłowo ukierunkowanych kolonii hPSC.
Przeprowadzono elektroporację 5,0 x 106 komórek na platformę SSN, a następnie komórki z każdego targetowania wysiano na jedną płytkę 6-dołkową zawierającą MEF DR4. Po selekcji na każdej platformie uzyskano kolonie dodatnie pod kątem EGFP (Rycina 3) oraz kombinację klonów nietargetowanych, homozygotycznie targetowanych i heterozygotycznie targetowanych (Rycina 4A,B; Tabela 3). W warunkach przedstawionych w niniejszej pracy stwierdzono, że TALENy AAVS1 pozwoliły na uzyskanie największej liczby klonów dodatnich pod kątem EGFP. Matryca naprawcza użyta w tym eksperymencie składa się z miejsca akceptora splicingu powyżej reportera EGFP i kasety oporności na puromycynę. Stosując tę strategię „pułapki genowej” (Rycina 1), konstrukt powinien wstawić się do pierwszego intronu locus AAVS1, wykorzystując endogenny promotor do napędzania ekspresji kasety oporności na puromycynę. Brak promotora napędzającego ekspresję genu oporności na puromycynę w obrębie matrycy naprawczej powinien zapobiec ekspresji w przypadku randomowej integracji.
W związku z tym oczekiwaliśmy, że wszystkie klony oporne na puromycynę zostaną skierowane do miejsca AAVS1. Należy zauważyć, że część klonów posiada aberrantne integracje w locus AAVS1, które są wykrywalne metodą Southern blot przy użyciu sondy wewnętrznej, ale nie przez większość strategii PCR (Rycina 1; Rycina 4C) 4. Zdarzenia integracyjne te są najprawdopodobniej wynikiem heterologicznego kierowania, prowadzącego do wielokrotnych integracji plazmidu donora 4. Wyselekcjonowano 24 kolonie z każdego eksperymentu SSN i stwierdzono, że wszystkie platformy charakteryzowały się bardzo wysoką wydajnością kierowania i wykazywały jedynie minimalne różnice. W analizie metodą PCR system CRISPR/Cas9 pozwolił na uzyskanie największej liczby poprawnie skierowanych klonów, natomiast platforma TALEN wykazała największą liczbę klonów z integracją homozygotyczną (Tabela 3).
<img alt="Schemat loci AAVS1; edycja genów, TALEN, ZFN, startery PCR, naprawa DNA, metoda CRISPR-Cas9." src="/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat edytowanego genu w locus AAVS1 z wykorzystaniem matrycy naprawczej AAV-CAGGS-EGFP. Zmodyfikowano na podstawie Hockemeyer et al., 2009. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="różnicowanie kolonii hPSC; obrazy mikroskopowe; komórki nieróżnicowane a częściowo zróżnicowane" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kolonie komórek WIBR#3. Reprezentatywne obrazy w polu jasnym kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych WIBR#3 przed wprowadzeniem zmiany genetycznej. Należy zwrócić uwagę na brak różnicowania oraz wyraźne oddzielenie od warstwy komórek karmionki w kolonii idealnej (po lewej), w przeciwieństwie do kolonii nieidealnej (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie edycji genów; ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9. Analiza obrazów mikroskopowych w fazie i EGFP." src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Komórki WIBR#3 wykazujące ekspresję EGFP. Reprezentatywne obrazy komórek WIBR#3 z wprowadzoną matrycą naprawczą eksprymującą EGFP w locus AAVS1. Przedstawiono obrazy reprezentatywnych kolonii poddanych edycji za pomocą ZFN, TALEN oraz CRISPR/Cas9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki edycji genów; elektroforeza w żelu i analiza blot porównująca metody TALEN, ZFN i Cas9." src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Strategie genotypowania w celu potwierdzenia prawidłowego targetowania. (A) Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR pokazujące klony niezmodyfikowane, heterozygotyczne i homozygotycznie zmodyfikowane dla trzech platform SSN. WT CTL=kontrola typu dzikiego. (B) Reprezentatywne wyniki Southern blot pokazujące klon heterozygotycznie zmodyfikowany oraz klon homozygotycznie zmodyfikowany wykryte za pomocą zewnętrznej sondy 3'. Wielkości fragmentów: WT-6.5 kb, Edited-6.9 kb. (C) Reprezentatywne wyniki Southern blot pokazujące prawidłowo zmodyfikowany klon oraz klon heterozygotyczny z nierandomową podwójną integracją. Wielkości fragmentów: Prawidłowo zmodyfikowany-6.9 kb, aberracyjna dodatkowa integracja-5 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Badanie</td>
			<td>Celowane w geny</td>
			<td>Platforma</td>
			<td>Typ matrycy naprawczej</td>
			<td>liczba wybranych klonów</td>
			<td>Wydajność targetowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sexton i wsp., 2014</td>
			<td>TPP1</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>nieopisany</td>
			<td>nieopisany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sexton i wsp., 2014</td>
			<td>TERT</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>Higromycyna</td>
			<td>nieopisany</td>
			<td>nieopisany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer i wsp., 2009</td>
			<td>POU5F1</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>31</td>
			<td>39.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer i wsp., 2009</td>
			<td>PITX3</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>74</td>
			<td>14.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer i wsp., 2011</td>
			<td>POU5F1</td>
			<td>TALEN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>68</td>
			<td>91.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer i wsp., 2011</td>
			<td>PITX3</td>
			<td>TALEN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>96</td>
			<td>13.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle i wsp., 2015</td>
			<td>VASA</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-genetycyna</td>
			<td>139</td>
			<td>94.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle i wsp., 2015</td>
			<td>CRH</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticyna</td>
			<td>30</td>
			<td>93.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle i wsp., 2015</td>
			<td>HCRT</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticyna</td>
			<td>154</td>
			<td>92.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle i wsp., 2015</td>
			<td>HMX2</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Genetycyna</td>
			<td>11</td>
			<td>45.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forster i wsp., 2014</td>
			<td>LRG5-Nterm</td>
			<td>Nukleazy z palcami cynkowymi (ZFN)</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>niezgłoszony</td>
			<td>30.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Förster i wsp., 2014</td>
			<td>LRG5-Cterm</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>nieopisany</td>
			<td>14.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldner i wsp., 2011</td>
			<td>SNCA</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>Puro</td>
			<td>96</td>
			<td>1.0%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 1. Opis innych genów będących celem tej metody, wraz z odpowiadającymi im wydajnościami targetowania zaczerpniętymi z wcześniej opublikowanych badań. 4,5,38-41
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Locus</td>
			<td>Sekwencja</td>
			<td>Uwagi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>starter AAVS1-F</td>
			<td>CTCTAACGCTGCCGTCTCTC</td>
			<td>Warunki PCR: Tm = 57 °C, 35 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>starter AAVS1-WT-R</td>
			<td>GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG</td>
			<td>Prążek WT: 1273 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>starter AAVS1-Targeted-R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGA</td>
			<td>Docelowy prążek: 992 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t2-Cas9-guide</td>
			<td>GGGCCACTAGGGACAGGAT</td>
			<td>Z Mali i wsp., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-ZFN-Right</td>
			<td>TAGGGACAGGAT</td>
			<td>Od Hockemeyera i wsp., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-ZFN-Left</td>
			<td>TGGGGTGTCACC</td>
			<td>Od Hockemeyera i wsp., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-Right</td>
			<td>TCCTAACCACTGTCTTT</td>
			<td>Z Hockemeyera i inni, 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-Lewy</td>
			<td>CCCCTCCACCCCACAGT</td>
			<td>Od Hockemeyera i wsp., 2011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Lista starterów i sekwencji docelowych SSN.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Konstrukt celujący</td>
			<td>Liczba kolonii EGFP+</td>
			<td>Wyselekcjonowane klony docelowe (zweryfikowane metodą PCR)</td>
			<td>Wcześniej zgłoszona prawidłowa wydajność targetowania (według analizy Southern blot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nukleazy z palcami cynkowymi (ZFN)</td>
			<td>150</td>
			<td>86,9% (73,9% het/ 13,0% homo)</td>
			<td>56% (50% het/6% homo)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALEN</td>
			<td>412</td>
			<td>91,3% (47,8% het/39,1% homo)</td>
			<td>47% (37,5% het/9,3% homo)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPR-Cas9</td>
			<td>235</td>
			<td>95,7% (69,5% het/26,3% homo)</td>
			<td>nieopisany</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Porównawcza liczba kolonii ludzkich komórek macierzystych wykazujących ekspresję EGFP oraz ukierunkowane przez TALEN, ZFN i CRISPR/Cas9. Integracje w locus AAVS1 zweryfikowane metodą PCR w tym eksperymencie są porównane z prawidłowymi pojedynczymi integracjami zweryfikowanymi metodą Southern blot w poprzednich eksperymentach 4,5.

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Ogólnym celem tej procedury jest modyfikacja genetyczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem nowoczesnej technologii edycji genomu. Chociaż procedura ta może dostarczyć wiedzy na temat biologii komórek macierzystych, może ona zostać zastosowana również w celu ułatwienia modelowania ludzkich chorób w ściśle określonym kontekście genetycznym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą muszą poćwiczyć izolację kolonii, aby osiągnąć biegłość w jej wykonywaniu.Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ identyfikacja i wybieranie kolonii mogą być trudne. Należy rozpocząć od hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w pośrodku hESC na płytce sześciodołkowej zawierającej inaktywowane mitomycyną C zarodkowe fibroblasty mysie lub komórki zasilające MEF hodowane na żelatynie. Każdego kolejnego dnia po wysianiu, aż do momentu osiągnięcia przez hPSCs 50% konfluencji, należy użyć pipety szklanej i odsysacza próżniowego, aby usunąć całą objętość pożywki.Zastąp trzy mililitrami ciepłej pożywki hESC na dołek. Jeden dzień przed transdukcją usuń pożywkę hESC i dodaj świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę hESC uzupełnioną o 10 µM Y-27632. Przygotuj również od jednej do dwóch płytek sześciodołkowych z opornymi na leki komórkami karmicielki MEF pochodzącymi z myszy DR4.W dniu targetowania należy przygotować roztwory do transfekcji, pipetując 5 µg plazmidu ekspresyjnego nukleazy z motywem palca cynkowego 1 i 2, plazmidu ekspresyjnego TALON 1 i 2 lub 15 µg plazmidu kodującego CRISPR cas9 px330 do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie należy dodać 30 µg naprawczego plazmidu donora, a potem dodać odpowiednią ilość 1x fosforanu soli buforowej (PBS), aby objętość wyniosła 300 µl. Komórki należy sprawdzić pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnęły 50% konfluencji.Następnie, używając pipety szklanej i odsysacza, usuń medium z płytki z hPFC, a następnie przemyj komórki 2 mililitrami ciepłego 1x PBS. Po odessaniu PBS, dodaj 0,5 mililitra 0,25% roztworu Trypsyny-EDTA bezpośrednio na komórki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa pokarmowa zacznie odklejać się od płytki.Po inkubacji do każdej studni należy dodać dwa mililitry ciepłego medium płuczącego ES, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Zebrać komórki z każdej studni, upewniając się, że komórki karmione odklejają się w postaci płata. Zawartość każdej studni przenieść pipetą do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, łącząc materiał ze wszystkich studni, a następnie rozbić skupiska komórek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów.Dodać medium do płukania ES, aby zwiększyć objętość zawiesiny komórkowej do 40 milliliters. Odczekać jedną do dwóch minut, aby duże fragmenty komórek karmicieli osiadły na dnie probówki, następnie usunąć nadosad za pomocą pipety serologicznej i przenieść go do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter. Po wirowaniu zawiesiny komórkowej przez pięć minut przy 190 times g, odessać nadosad, uważając, aby nie zresuspenderować granulatu komórkowego.Resuspenduj komórki w 500 µL 1x pbs. Połącz resuspendowane komórki z wcześniej przygotowanym roztworem do transfekcji plazmidowej. Przenieś pipetą komórki i mieszaninę do transfekcji do czteromilimetrowej kuwety do elektroporacji, a następnie pozostaw na lodzie na od trzech do pięciu minut.Ustaw parametry programu wykładniczego w systemie do elektroporacji na 250 V, 500 µF, nieskończony opór oraz rozmiar kuwety 4 mm. Przeprowadź elektroporację komórek, a następnie umieść kuwetę ponownie w lodzie na trzy minuty. Resuspenduj elektroporowane komórki w 18 mL ogrzanych pożywek dla hESC, uzupełnionych o 10 µM Y-27632.Obejrzyj DR4 MEFs pod mikroskopem. Przenieś trzy mililitry zawiesiny pojedynczych komórek do każdego dołka płytki sześciodołkowej zawierającej komórki karmione DR4, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. W trzecim dniu po wysianiu wymień pożywkę na pożywkę hESC bez Y-27632.W czwartym dniu należy zastąpić pożywkę bez dodatków pożywką zawierającą odpowiedni antybiotyk selekcyjny. W tym przypadku stosuje się puromycynę. W dniu poprzedzającym wybieranie kolonii należy przygotować jedną płytkę 12-dołkową z komórkami karmicielkami MEF dla każdej kolonii przeznaczonej do wybrania.W 12. dniu po wysiewie obejrzyj płytkę pod mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj kolonie o średnicy od 800 do 1 200 mikronów, które są gotowe do pobrania. Upewnij się, że wybrane kolonie nie zawierają komórek rozpoczynających proces różnicowania, takich jak ta pokazana tutaj.Należy również upewnić się, że komórki wykazują ekspresję GFP. W dniu pobierania należy sprawdzić MEF pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są zdrowe. Usunąć całą pożywkę z płytek z komórkami karmionymi MEF i zastąpić ją jednym mililitrem pożywki dla hESC.Należy również wymienić pożywkę hESC na płytkach sześciodołkowych z hPSC, z których będą pobierane kolonie. Następnie należy przygotować pipety szklane do pobierania kolonii. Aby pobrać kolonie, najpierw należy umieścić płytkę z hPFC na stoliku mikroskopu sekcyjnego w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie złożyć urządzenie do pobierania, wkładając koniec szklanej pipety do gruszki ssącej.Zidentyfikuj kolonię do pobrania i umieść końcówkę wyciągniętej szklanej pipety nad kolonią. Następnie naciśnij gruszkę urządzenia do pobierania, aby delikatnie wyciąć i podzielić pojedynczą kolonię na 10 do 20 równych części. Następnie, zwalniając ucisk gruszki, wciągnij wycięte fragmenty kolonii do pipety.Podczas przenoszenia należy pobrać jak najmniejszą ilość pożywki. Ściśnij gruszkę, aby przenieść rozbitą kolonię bezpośrednio do jednej studni płytki 12-dołkowej z komórkami karmicielami MEF. Oznacz każdą studnię, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację klonów pochodzących z pojedynczych komórek.Wymień pipetę szklaną i powtórz procedurę dla kolejnej kolonii. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i delikatnie nimi potrząśnij, aby rozprzestrzenić komórki w dołku. Następnego dnia usuń całą objętość pożywki i zastąp ją 1,5 ml ogrzanej pożywki hESC.Powtarzać czynność przez 10 do 12 dni, aż komórki osiągną 50% konfluencji. Po 10 do 12 dniach sprawdzić hESC pod mikroskopem. Wybrać jedną lub dwie kolonie z każdej studzienki i przenieść je na nowe 12-dołkowe płytki z komórkami karmionymi MEF, aby przygotować płytkę replikacyjną.Wyizoluj DNA z pozostałych kolonii w każdej studience pierwotnych płytek w celu przeprowadzenia genotypowania metodą PCR lub Southern blot. W komórkach macierzystych zarodka człowieka Weber Three dokonano ukierunkowanego wprowadzenia zmian w locus AAVS1 przy użyciu nukleaz specyficznych dla miejsca oraz matrycy naprawczej w celu wprowadzenia reportera EFFP i kasety oporności na puromycynę. Te reprezentatywne obrazy przedstawiają kolonie edytowane za pomocą nukleaz z palcami cynkowymi, TALENs oraz CRISPR/Cas9.Te reprezentatywne wyniki genotypowania metodą PCR przedstawiają klony nietargetowane, heterozygotyczne oraz homozygotycznie targetowane z wykorzystaniem nukleaz z palcami cynkowymi, TALEN oraz CRISPR/Cas9, wraz z kontrolą typu dzikiego. Tabela ta przedstawia zweryfikowane metodą PCR integracje w locus AAVS1 dla każdej nukleazy specyficznej dla miejsca w tym doświadczeniu, w porównaniu do prawidłowych pojedynczych integracji zweryfikowanych metodą Southern Blot w poprzednich doświadczeniach. System CRISPR-Cas9 przyniósł najwięcej prawidłowo targetowanych klonów, natomiast platforma TALEN wykazała najwięcej klonów targetowanych homozygotycznie.Po opanowaniu tej techniki czas pracy własnej wynosi od trzech do pięciu godzin, a zmodyfikowane komórki można uzyskać w ciągu około trzech tygodni od rozpoczęcia eksperymentów. W przypadku tej metody niezwykle ważne jest zachowanie zasad bezpieczeństwa oraz stałe stosowanie technik sterylnych. Po manipulacji genetycznej można sprawdzić, w jaki sposób wpływa ona na inne typy komórek, wykorzystując różnicowanie komórek macierzystych w inne typy komórek, np. neurony.Opracowanie tego protokołu utorowało drogę badaczom do wykorzystania edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych w celu tworzenia in vitro modeli chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj metodę edycji genomu w ludzkich komórkach macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu elektroporacji i selekcji antybiotykowej. Protokół umożliwia modelowanie chorób i badania w biologii komórek macierzystych.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Przeglądaj więcej filmów