Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Ogólnym celem tej procedury jest genetyczna inżynieria ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu nowoczesnej technologii edycji genomu. Chociaż procedura ta może dostarczyć informacji na temat biologii komórek macierzystych, może być również zastosowana w celu ułatwienia modelowania chorób u ludzi w genetycznie zdefiniowanym otoczeniu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą musiały ćwiczyć izolowanie kolonii, zanim osiągną wprawę.

Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ identyfikacja i zbieranie kolonii może być trudne. Rozpocznij od hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w pożywkach hESC na sześciodołkowej płytce zawierającej inaktywowane mitomycyną C mysie fibroblasty zarodkowe lub komórki żywiące MEF hodowane na żelatynie. Każdego kolejnego dnia po posiewie, aż do momentu, gdy hPSC osiągną 50% konfluencję, należy użyć szklanej pipety i odkurzenia, aby usunąć całą objętość pożywki.

Zastąp trzema mililitrami ciepłej pożywki hESC na studzienkę. Na dzień przed celowaniem należy usunąć pożywkę hESC i dodać świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hESC uzupełnioną 10 mikromolowymi Y-27632. Przygotuj również jedną lub dwie sześciodołkowe płytki z lekoopornymi komórkami zasilającymi MEF od myszy DR4.

W dniu celowania przygotuj roztwory transwekcyjne, pipetując pięć mikrogramów plazmidu ekspresji nukleazy palca cynkowego 1 i 2, plazmidu ekspresji TALON 1 i 2 lub 15 mikrogramów plazmidu kodującego CRISPR cas9 px330 do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki. Dodaj 30 mikrogramów naprawionego plazmidu dawcy, a następnie tyle 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zwiększyć objętość do 300 mikrolitrów. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że zbieg wynosi 50%.

Następnie za pomocą szklanej pipety i odkurzacza usuń pożywkę z płytki hPFC, a następnie umyj komórki 2 mililitrami ciepłego 1x PBS. Po zaessaniu PBS dodaj punkt zerowy pięć mililitrów 0,25% roztworu trypsyny-EDTA bezpośrednio na komórki. Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa podajnika zacznie odrywać się od płytki.

Po inkubacji dodaj dwa mililitry ciepłej pożywki płuczącej ES do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Zbierz komórki z każdej studzienki, upewniając się, że komórki podajnika odpadają jako arkusz. Zawartość każdej studzienki należy odpipetować do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, łącząc wszystkie studzienki i rozetrzeć komórki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.

Dodaj pożywkę płuczącą ES, aby doprowadzić zawiesinę komórek do 40 mililitrów. Odczekaj jedną do dwóch minut, aby duże kawałki podajnika osiadły na dnie probówki, a następnie usuń supernatant za pomocą pipety serologicznej i umieść w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po odwirowaniu zawiesiny komórek przez pięć minut w temperaturze 190 razy g, odessać supernatant bez naruszania palety komórek.

Ponownie zawiesić ogniwa w 500 mikrolitrach 1x pbs. Połączyć zawieszone komórki z przygotowanym wcześniej roztworem do transsekcji osocza. Odpipetować komórki i mieszaninę transfekcji do czteromilimetrowej kuwety do elektroporacji i umieścić na lodzie na trzy do pięciu minut.

Ustaw parametry programu wykładniczego w systemie elektroporacji na 250 woltów, 500 mikrofaradów, nieskończoną rezystancję i czteromilimetrowy rozmiar kuwety. Elektroporuj ogniwa, a następnie umieść kuwetę z powrotem na lodzie na trzy minuty. Ponownie zawiesić elektroporowane ogniwa w 18 mililitrach ciepłych pożywek hESC, uzupełnionych 10 mikromolowymi Y-27632.

Sprawdź DR4 MEF pod mikroskopem. Umieścić trzy mililitry zawiesiny pojedynczej komórki w każdym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej komórki zasilające DR4 i wrócić do inkubatora. Trzeciego dnia po posiewie wymień pożywkę na pożywce hESC komórek bez Y-27632.

W czwartym dniu należy zastąpić niesuplementowane pożywki pożywką zawierającą odpowiedni antybiotyk selekcyjny. Stosuje się tutaj Puromycynę. W dniu poprzedzającym zbiór kolonii przygotuj jedną 12-dołkową płytkę z komórkami zasilającymi MEF dla każdej kolonii, która ma zostać pobrana.

W 12 dniu po posiewie zbadaj płytkę pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj kolonie o średnicy od 800 do 1 200 mikronów, które są gotowe do zbioru. Upewnij się, że te kolonie nie zawierają komórek, które zaczynają się różnicować, takich jak ta pokazana tutaj.

Upewnij się również, że komórki wykazują ekspresję GFP. W dniu zbioru sprawdź MEF-y pod mikroskopem, aby upewnić się, że są zdrowe. Usuń wszystkie pożywki z płytek ogniw zasilających MEF i zastąp je jednym mililitrem pożywki hESC.

Zmień również pożywki hESC na sześciodołkowych płytkach hPSC, które mają zostać pobrane. Następnie wyciągnij szklane pipety do zbierania kolonii. Aby pobrać kolonie, najpierw umieść płytki hPFC na stoliku mikroskopu preparacyjnego w kapturze do hodowli tkankowych, zmontuj urządzenie do pobierania, umieszczając szklaną końcówkę pipety w bańce ssącej.

Zidentyfikuj kolonię, która ma zostać pobrana, i umieść końcówkę wyciągniętej szklanej pipety nad kolonią. Następnie ściśnij gruszkę urządzenia zbierającego, aby delikatnie wyciąć i pokroić pojedynczą kolonię na 10 do 20 kawałków o równej wielkości. Następnie wciągnij wycięte kawałki kolonii do pipety, zwalniając gruszkę.

Staraj się zabierać jak najmniej nośników podczas przesyłania. Ściśnij bańkę, aby przenieść teraz uszkodzoną kolonię bezpośrednio do jednego dołka 12-dołkowej płytki komórkowej MEF. Oznacz każdą studzienkę, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację klonów pochodzących z pojedynczych komórek.

Wymień szklaną pipetę i powtórz procedurę dla następnej kolonii. Włóż płytki z powrotem do inkubatora i delikatnie kołysz płytkami, aby rozproszyć komórki w studzience. Następnego dnia usuń całą objętość pożywki i zastąp jednym punktem pięć mililitrów ciepłej pożywki hESC.

Powtarzaj przez 10 do 12 dni, aż komórki będą zlewne w 50%. Po upływie 10 do 12 dni należy przeprowadzić inspekcję komórek macierzystych w ramach zakresu. Wybierz od jednej do dwóch kolonii z każdej studzienki i przenieś do nowych 12-dołkowych płytek komórkowych MEF, aby wygenerować replikę płytki.

Ekstrahować DNA z pozostałych kolonii w każdym dołku oryginalnych płytek w celu genotypowania za pomocą PCR lub southern blot. Weber: Trzy ludzkie embrionalne komórki macierzyste zostały ukierunkowane na locus AAVS1 za pomocą nukleaz specyficznych dla miejsca i matrycy naprawczej w celu wprowadzenia reportera EFFP i kasety oporności na puromycynę. Te reprezentatywne obrazy pokazują kolonie edytowane za pomocą nukleaz palca cynkowego, TALEN-ów i CRISPR/Cas9.

Te reprezentatywne wyniki genotypowania PCR pokazują nieukierunkowane, heterozygotyczne i homozygotyczne klony docelowe wykorzystujące nukleazy palca cynkowego, TALEN-y i CRISPR/Cas9 wraz z kontrolą typu dzikiego. Poniższa tabela przedstawia zweryfikowane przez PCR integracje w locus AAVS1 dla każdej nukleazy specyficznej dla miejsca w tym eksperymencie, w porównaniu z prawidłowymi pojedynczymi integracjami zweryfikowanymi przez Southern Blot w poprzednich eksperymentach. CRISPR-Cas9 dał najwięcej poprawnie ukierunkowanych klonów, podczas gdy platforma TALEN miała najwięcej klonów o homozygicznym celu.

Po opanowaniu tej techniki zajmuje około trzech do pięciu godzin czasu praktycznego, a edytowane komórki można uzyskać w ciągu około trzech tygodni od rozpoczęcia eksperymentów. W przypadku tej techniki bardzo ważne jest, aby pracować bezpiecznie i zawsze używać sterylnej techniki. Po manipulacji genetycznej można zobaczyć, jak wpływa ona na inne typy komórek, wykorzystując różnicowanie komórek macierzystych do innych typów komórek, takich jak neurony.

Opracowanie tego protokołu utorowało naukowcom drogę do wykorzystania edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych do stworzenia modeli chorób in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak edytować genom w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.