Name: Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania dynamiki komórek T CD4 w zapalnej skórze właściwej u myszy. Technika ta umożliwia badanie motoryki komórek immunologicznych in situ z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ośrodkowi Mikroskopu Wielofotonowego Uniwersytetu w Rochester za pomoc w obrazowaniu na żywo. Obsługiwane przez NIH AI072690 i AI02851 do DJF; AI114036 do AG i AI089079 do MGO.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie
Tutaj przedstawiamy kompletny protokół wizualizacji 4D przeniesionych, specyficznych dla antygenu komórek efektorowych Th1 w nienaruszonej skórze właściwej ucha myszy. Metoda ta zapewnia przewagę nad niektórymi obecnymi metodami obrazowania z kilku powodów. Obrazując brzuszną skórę właściwą ucha, jesteśmy w stanie zrezygnować z depilacji, która jest wymagana w protokołach obrazowania obejmujących inne miejsca skóry. Chociaż depilatory są na ogół łagodne, wykazano, że powoduj...

Funkcja efektorowa limfocytów T CD4 jest krytycznie zależna od ich zdolności do szybkiego wchodzenia i przechodzenia przez szeroką gamę tkanek obwodowych w celu zbadania uszkodzeń, zlokalizowania ognisk infekcji lub wywołania patologii z przewlekłej infekcji lub autoimmunizacji. Podczas gdy procesy naprowadzania do miejsc objętych stanem zapalnym1-4 i wynaczynienia5-7 z naczyń krwionośnych do tkanek zostały dobrze scharakteryzowane, czynniki napędzające i regulujące ruchliwość śródmiąższową limfocytów T pozostają nieokreślone. Migracja limfocytów T w złożonych środowiskach 3D była badana in vitro przy użyciu sztucznych matryc8-10 lub urządzeń mikroprzepływowych11,12, ale nie są one w stanie odtworzyć złożonego i dynamicznego środowiska systemu in vivo. Dopiero niedawno, wraz z pojawieniem się wielokolorowego obrazowania przyżyciowego o wysokiej rozdzielczości, możliwe stało się badanie dynamicznego zachowania komórek odpornościowych in situ, co pozwala na lepsze zrozumienie nienaruszonych odpowiedzi immunologicznych.
Ponad dziesięć lat temu, opublikowano kilka wpływowych badań, które po raz pierwszy wykorzystały mikroskopię wielofotonową do odpowiedzi na pytania immunologiczne. Wczesne badania koncentrowały się na zachowaniu komórek odpornościowych w eksplantowanych narządach limfatycznych13-16, po których wkrótce zastosowano techniki obrazowania odsłoniętych węzłów chłonnych u znieczulonych myszy17. Obrazowanie pozwoliło na nowe fundamentalne obserwacje dotyczące etapów pobudzania węzłów chłonnych limfocytów T18, mechanizmów, za pomocą których limfocyty T migrują w wtórnych narządach limfoidalnych19, interakcji limfocytów T z innymi komórkami odpornościowymi20,21 oraz dynamicznego pozycjonowania limfocytów T w węźle chłonnym22. Chociaż wiele wczesnych badań koncentrowało się na dynamice węzłów chłonnych, obrazowanie przyżyciowe było od tego czasu wykorzystywane do obrazowania odpowiedzi immunologicznej w wielu tkankach obwodowych, w tym w mózgu23-25, wątrobie26, płucach27 i skórze28-30. 
Skóra właściwa ucha myszy jest szczególnie dobrze przygotowana do obrazowania, ze względu na cienkość skóry ucha, względny brak włosów i łatwość, z jaką można ją odizolować od ruchów oddechowych31. Rzeczywiście, skóra właściwa ucha została wykorzystana do obrazowania śródmiąższowego zachowania komórek dendrytycznych32,33, limfocytów T28,29,34,35 i neutrofili36,37 i jest dobrze ugruntowanym miejscem do badania zapalenia skóry. Coraz częściej zabiegi nieinwazyjne zastępują chirurgiczne preparaty skóry, w tym modele rozszczepionej skóry właściwej38,39, boku39,40 lub grzbietowego okienka płata skórnego39,41, które mogą wywołać zmiany w miejscowym środowisku zapalnym. Zastosowanie przeniesionych, sytuowanych in vitro, specyficznych dla antygenu efektorowych limfocytów T CD4 pozwala na badanie jednorodnej populacji komórek w kontekście skórnej odpowiedzi zapalnej30. Tutaj opisujemy nieinwazyjną procedurę obrazowania, która pozwala na wizualizację specyficznych dla antygenu efektorowych limfocytów T CD4 w śródmiąższu skóry ucha myszy objętego stanem zapalnym oraz możliwość manipulowania tymi komórkami w czasie rzeczywistym poprzez wprowadzenie przeciwciał blokujących przez cewnik żylny. Pokazujemy, że ten model jest skuteczny w śledzeniu ruchu limfocytów T CD4 w skórze właściwej i w badaniu mechanizmów rządzących tą ruchliwością.

<table><tbody><tr><td>Myszy BALB/c</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000651</td><td>Użyte myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>myszy DO11.10</td><td>Jackson</td><td>Laboratories 003303</td><td>Myszy użyte zostały wyhodowane w domu</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>10-013-CV</td><td>Wiele równoważnych</td></tr><tr><td>noworodków Serum cielęcych (NCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SH30118.03</td><td>Ciepło inaktywowane w temperaturze 56 &; C przez 30 minut</td></tr><tr><td>Dopełniacz świnki morskiej</td><td>Cedarlane</td><td>CL-5000</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD8</td><td>ATCC</td><td>3.155 (ATCC TIB-211)</td><td>Przeciwciała pochodzące z&nbsp; tego hybrydoma</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-MHC klasy II</td><td>ATCC</td><td>M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)</td><td>Przeciwciała pochodzące z&nbsp; tego przeciwciała</td></tr><tr><td>anty-CD24</td><td>hybrydoma ATCC</td><td>J11d.2 (ATCC TIB-183)</td><td>Przeciwciała pochodzące z&nbsp; to hybrydoma</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Thy1.2</td><td>ATCC</td><td>J1j.10 (ATCC TIB-184)</td><td>Przeciwciała pochodzące z&nbsp; tego hybrydoma</td></tr><tr><td>Ficoll (Fico/Lite-LM)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>I40650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>21-040-CV</td><td>Wielokrotny równoważny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>15323591</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane przeciwciało anty-CD62L (klon MEL-14)</td><td>BD</td><td></td><td></td>553149</tr><tr><td>paciorkowce separacji magnetycznej streptawidyny</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna separacyjna MACS LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana ludzka IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysz IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysz IL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-IFNg (klon XMG 1.2)</td><td>eBioscience</td><td>16-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-IL-4 (klon 11b11)</td><td>eBioscience</td><td>16-7041-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>VWR</td><td>45000-412</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Fisher</td><td>15303641</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher</td><td>15323671</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>peptyd albuminy jaja kurzego</td><td>Biopeptyd</td><td></td><td>ISQAVHAAHAEINEAGR-OH Peptyd</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SV30014.03</td><td>Inaktywowany termicznie w temperaturze 56 &; C przez 30 minut</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>hodowlana LPS</td><td>3526</td><td>Wiele równoważnych</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>28 strzykawek insulinowych G1/2, 1ml</td><td>BD</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>28 strzykawek insulinowych G1/2, 300&mu; l</td><td></td><td></td> Strzykawki BD 309301 <td></td></tr><tr><td>27 G1/2 TB, 1ml</td><td>Igły BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2</td><td>Rurka</td> medyczna BD <td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PE-10</td><td>BD</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>cyjanoakrylowy klej weterynaryjny (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr> płyta <tr><td>grzewcza</td><td>WPI</td><td>61830</td><td></td></tr><tr><td>Regulator płyty grzewczej</td><td>WPI</td><td>ATC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler koca wodnego</td><td>Gaymar</td><td>TP500</td><td>Nie jest już produkowany, nowszy odpowiednik dostępny</td></tr><tr><td>koc wodny</td><td>Kent Scientific</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>LEI Medical</td><td>Isotec 4</td><td>Nie jest już produkowany, dostępny jest nowszy odpowiednik</td></tr><tr><td>izofluranu</td><td>Henry Schein</td><td></td><td>Zamówiony przez Veterinary </td></tr><tr><td>probówki do mikrowirówek</td> dla personelu <td>VWR</td><td>20170-038</td><td>Wielokrotna</td></tr><tr><td>równoważna taśma medyczna</td><td>3M</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>nosek</td><td></td><td></td> izofluranowy <td>Zbudowany we własnym zakresie, patrz Rys. 2</td></tr><tr><td>platforma</td><td></td><td></td> obrazowania <td>Zbudowana we własnym zakresie, patrz rys. 2</td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze</td><td>WPI</td><td>15915-G</td><td>Nożyczki</td></tr> <tr><td></td><td>wielokrotne równoważneRoboz</td><td>RS-6802</td><td>Wielokrotne równoważne</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td></td><td>Wiele równoważnych</td></tr> smarów <tr><td>wysokopróżniowych</td><td></td><td></td> Waciki bawełniane Fisher 146355D <td></td></tr><tr><td></td><td>Wiele równoważnych</td>delikatnych chusteczek do zadań Fisher 34155 Wielokrotny odpowiednik Mikroskop pionowy Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM z fizyką widm <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MaiTai HP DeepSee Ti:Sa</td><td>laser Olympus</td><td></td><td>zaproszenie do wyceny</td></tr><tr><td>stół optyczny z kontrolą drgań</td><td>Newport</td><td></td><td>zaproszenie do składania ofert</td></tr><tr><td>25x NA 1,05 obiektyw zanurzeniowy do obrazowania wielofotonowego</td><td>Grzejnik</td> obiektywowy Olympus <td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bioptechs</td><td>PN 150815</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra detekcyjnego</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRVGR/XR</td><td>Zastrzeżona kostka, może być aproksymowana na podstawie indywidualnych filtrów/dichroików</td></tr><tr><td>antyintegryny i beta; 1 przeciwciało (klon hMb1-1)</td><td>eBioscience</td><td>16-0291-85</td><td>Antyintegryna bez azydków o niskiej zawartości endotoksyn</td></tr><tr><td>i beta; 3 przeciwciała (klon 2C9. G3)</td><td>eBioscience</td><td>16-0611-82</td><td>Wolny od azydków, o niskiej zawartości endotoksyn</td></tr><tr><td>Texas Red Dextran (70 000 MW)</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek t cd4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Zdolność limfocytów T CD4 do wykonywania funkcji efektorowych zależy od szybkiej i efektywnej migracji tych komórek w tkankach obwodowych objętych stanem zapalnym za pomocą jeszcze niezdefiniowanego mechanizmu. Zastosowanie mikroskopii wielofotonowej do badania układu odpornościowego stanowi narzędzie do pomiaru dynamiki odpowiedzi immunologicznych w nienaruszonych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół nieinwazyjnego przyżyciowego obrazowania wielofotonowego limfocytów T CD4 w skórze właściwej ucha objętego stanem zapalnym. Zastosowanie niestandardowej platformy obrazowania i cewnika żylnego pozwala na wizualizację dynamiki limfocytów T CD4 w śródmiąższu skórnym, z możliwością badania tych komórek w czasie rzeczywistym poprzez dodanie przeciwciał blokujących do kluczowych składników molekularnych zaangażowanych w ruchliwość. System ten zapewnia przewagę zarówno nad modelami in vitro, jak i inwazyjnymi procedurami obrazowania chirurgicznego. Zrozumienie szlaków wykorzystywanych przez limfocyty T CD4 do ruchliwości może ostatecznie dostarczyć informacji na temat podstawowej funkcji limfocytów T CD4, a także patogenezy zarówno chorób autoimmunologicznych, jak i patologii przewlekłych infekcji.

Zdolność do badania odpowiedzi immunologicznych in situ bez zmieniania środowiska odpornościowego jest niezbędna w badaniu interakcji efektorowych komórek T z zapalną tkanką w czasie rzeczywistym. Obrazowanie nienaruszonej skóry właściwej ucha zgodnie z tym protokołem, przedstawionym na Rysunku 1A i B, pozwala na wizualizację przeniesionych, znakowanych fluorescencyjnie efektorowych komórek T w przestrzeni śródmiąższowej skóry właściwej. Umożliwi...

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu obrazowania jest wizualizacja dynamiki limfocytów T CD4+ w zapalnej skórze. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak mechanizmy leżące u podstaw ruchliwości i funkcji komórek odpornościowych w tkankach zapalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona małoinwazyjny sposób badania dynamicznego zachowania limfocytów T CD4 in situ.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania ucha do obrazowania są trudne do opanowania, a prawidłowe ułożenie ucha jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości obrazów. Nazywam się Alison Gaylo, jestem studentką studiów doktoranckich i przeprowadzę demonstrację tego protokołu. Rozpocznij od pobrania do strzykawki z igłą o rozmiarze 27,5 G 300 µL zawiesiny fluorescencyjnie znakowanych efektorowych limfocytów T na jedną mysz.Następnie należy obrócić strzykawkę igłą do góry i delikatnie opukać jej korpus, przesuwając tłok w górę i w dół w razie potrzeby, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Gdy komórki będą gotowe, przenieść myszy do czystej klatki i umieścić je pod lampą grzewczą, aż żyły ogonowe ulegną rozszerzeniu. Następnie przenieść pierwszą mysz do restrainera i przetrzeć ogon gazikiem nasączonym alkoholem.Po zidentyfikowaniu bocznej żyły ogonowej, powoli wstrzyknij 200 µL komórek do żyły. Gdy wszystkie komórki zostaną przeniesione, nabierz 50 µL kompletnej emulsji fluorescencyjnej do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 G i mocno naciśnij tłok, aby usunąć duże pęcherzyki powietrza. Następnie załóż naparstek na lewy palec wskazujący i ostrożnie chwyć ucho myszy między lewym kciukiem a naparstkiem, tak aby brzuszna strona ucha była skierowana do góry.Następnie wsuń igłę, ściętą stroną do góry, w skórę właściwą w zewnętrznej jednej trzeciej małżowiny usznej, lekko poza środek, i powoli wstrzyknij dziesięć µL emulsji do tkanki. Po zaszczepieniu wszystkich zwierząt monitoruj myszy do czasu ich pełnego powrotu do sprawności. Trzy dni po immunizacji wykonaj rozszerzenie naczyń krwionośnych w żyłach ogonowych wstrzykniętych zwierząt, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Po znieczuleniu unieruchom ogon pierwszej myszy za pomocą pęsety. Przetrzyj ogon gazikiem nasączonym alkoholem, a następnie ostrożnie wprowadź kaniulę z igłą o rozmiarze 30,5 G do bocznej żyły ogonowej, sprawdzając drożność poprzez delikatny nacisk na tłok strzykawki. Po prawidłowym umieszczeniu kaniuli nanieś jedną lub dwie krople kleju tkankowego z cyjanoakrylanem w miejscu wstrzyknięcia i pozostaw klej do wyschnięcia przez około 30 sekund.Następnie za pomocą nożyczek ostrożnie przytnąć wibrysy oraz sierść z tyłu i z boków ucha. Kolejno, za pomocą patyczka higienicznego, nawilżyć wewnętrzną powierzchnię ucha roztworem PBS. Następnie obrócić mysz i dociśnąć wstrzyknięte ucho do szkiełka podstawowego nr 1,5 o wymiarach 24 by 50 millimeter, aż będzie ono przylegać płasko do szkła.Odsącz nadmiar PBS. Następnie, używając dwóch par zakrzywionych pęset, chwyć wzdłuż górnych rogów kawałek taśmy materiałowej o długości około 20 mm i przyłóż dół taśmy do szkiełka nakrywki u nasady ucha myszy. Przewiń taśmę przez resztę ucha, odsuwając pęsetą nadmiar włosów w razie potrzeby, a następnie za pomocą suchego patyczka bawełnianego delikatnie dociśnij taśmę wokół ucha, aby zapewnić szczelne przyleganie, uważając, by nie uciskać samego ucha.Niezbędne jest prawidłowe przyklejenie ucha do szkiełka nakrywkowe za pomocą taśmy, zapewniając szczelne zamknięcie po obu stronach oraz minimalną liczbę pęcherzyków powietrza, ponieważ wpływa to na jakość uzyskiwanych obrazów. Następnie przyklej platformę do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym do bloku grzejnego o temperaturze 37 stopni Celsius i nanieś smar próżniowy na obie strony obszaru platformy przeznaczonego na ucho. Obróć mysz, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na platformie, dbając o to, by ucho znajdowało się w centrum filcu.Po umieszczeniu ucha, wciśnij maskę do izofluranu w uchwyt na platformie, upewniając się, że maska jest stabilnie zamocowana i całkowicie zakrywa nos myszy. Następnie za pomocą patyczka higienicznego mocno, lecz ostrożnie, dociśnij szkiełko nakrywkę do platformy obrazującej, rozprowadzając smar próżniowy pod szkiełkiem. Owiń górną część platformy dwoma kawałkami taśmy o długości 20 mm oraz dwoma dłuższymi kawałkami, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do platformy.Następnie przenieś mysz na stolik mikroskopu. Zabezpiecz platformę dodatkową taśmą i nałóż podkrywkę podwójną warstwę smaru próżniowego wokół ucha. Następnie owiń mysz wypełnionym wodą kocem grzewczym i wypełnij zbiornik ze smarem próżniowym wodą destylowaną o temperaturze 37 °C.W przypadku obrazowania timelapse in vivo należy rozpocząć od ustawienia obiektywu nad środkiem ucha, a następnie obniżać go, aż dotknie powierzchni wody w zbiorniku. Następnie, korzystając z zewnętrznego źródła światła, powoli obniżaj obiektyw, aż powierzchnia ucha znajdzie się w ogniskowej. Po tym opuść wewnętrzne i zewnętrzne osłony wokół stolika mikroskopu, a następnie dostosuj długość fali lasera do 900 nanometrów w oknie sterownika lasera MP, moc lasera w oknie ustawień akwizycji lasera oraz napięcia PMT w oknie sterowania akwizycją obrazu.W oknach ustawień rozmiaru i trybu akwizycji ustaw rozdzielczość mikroskopu na 512 na 512 pikseli, czas przebywania wiązki na piksel na poziomie 2 µs i wybierz opcję XY repeat, aby aktywować tryb obrazowania na żywo podczas skanowania tkanki. Po zlokalizowaniu odpowiedniego pola obrazowania, znajdź najwyższą komórkę w skórze właściwej i kliknij przycisk set zero, aby ustawić pozycję Z na zero. Przewiń w dół w kierunku Z, aby zmierzyć głębokość komórki.Następnie ustaw pozycje początkową i końcową w oknie ustawień akwizycji mikroskopu oraz dostosuj napięcia PMT instrumentu i moc lasera w oknie jasnego Z, aby zoptymalizować wizualizację komórek w całej głębokości pola obrazowania. Zaznacz przyciski głębokości (depth) i czasu (time), a w oknie trybu filtra sterowania akwizycją obrazu ustaw wspólny filtr, aby zeskanować obraz trzy razy na linię. Dostosuj głębokość warstwy Z w oknie mikroskopu akwizycji obrazu tak, aby zarejestrowanie pełnego stosu trwało około jednej minuty, zgodnie z informacją w oknie podglądu czasu.Następnie, aby ocenić stabilność tkanki, ustaw liczbę powtórzeń na pięć w oknie ustawień akwizycji skanowania czasowego i kliknij przycisk skanowania, aby zarejestrować obraz poklatkowy obszaru z pięciominutowym odstępem czasu. Jeśli tkanka pozostanie stabilna po pięciu minutach, ustaw liczbę powtórzeń w zakresie od 30 do 45 w oknie ustawień akwizycji skanowania czasowego i zarejestruj obraz poklatkowy z przedziału 30 do 45 minut, monitorując ewentualny niewielki dryft tkanki podczas zbierania obrazów. Zapisz obraz przed aplikacją przeciwciał w odpowiednim formacie, a następnie nabierz mieszaninę przeciwciał do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL, dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza.Delikatnie naciśnij tłok, aby roztwór przeciwciał utworzył kroplę na końcówce igły, a następnie podnieś osłony wokół stołu, aby zlokalizować cewnik. Zastąp strzykawkę z PBS strzykawką z przeciwciałami, a następnie powoli wstrzyknij przeciwciała do cewnika. Po pomyślnym wstrzyknięciu przeciwciał ponownie opuść osłony i zanotuj czas iniekcji.Następnie niezwłocznie rozpocznij nową 20- do 40-minutową sekwencję obrazowania, w tym samym miejscu, korzystając z tych samych ustawień instrumentu, co przy obrazowaniu przed podaniem przeciwciała. Na koniec zapisz plik obrazu po podaniu przeciwciała w odpowiednim formacie i ostrożnie zdejmij mysz ze stolika mikroskopu, monitorując zwierzę do czasu jego pełnego wybudzenia. Obrazowanie nienaruszonej skóry właściwej ucha zgodnie z tym protokołem umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości oraz obrazów poklatkowych dynamiki efektorowych limfocytów T w zapalnej skórze właściwej.W tym filmie można zaobserwować zielone, adoptywnie przetransferowane efektorowe limfocyty T przemieszczające się w tkance skóry właściwej. Jednak po podaniu przez cewnik przeciwciał blokujących entogrinę antibeta one i antibeta three, uprzednio ruchliwe komórki zatrzymują się w skórze właściwej. Po podaniu przeciwciał komórki wykazują zmniejszoną średnią prędkość, a także znaczący spadek indeksu meandrowania.Oznacza to stosunek całkowitego przesunięcia do całkowitej długości toru. Autofluorescencja mieszków włosowych, cieniowanie i autofluorescencja nakładających się włosów oraz pęcherzyki powietrza uwięzione między powierzchnią ucha a szkiełkiem podstawowym mogą prowadzić do powstawania artefaktów obrazowania, które utrudniają wizualizację limfocytów T i zakłócają działanie oprogramowania do zautomatyzowanej analizy obrazu. Ponadto stosowanie wielu źródeł ciepła może powodować problemy ze stabilnością tkanki, co prowadzi do dużych oscylacji podczas obrazowania, utrudniając interpretację wyników.Po opanowaniu techniki obrazowanie limfocytów T CD4 w skórze właściwej można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu odpowiednich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i zasad ich wykorzystywania w pracy z myszami. Procedurę tę można dostosować w celu wizualizacji innych subpopulacji limfocytów T lub rodzajów komórek odpornościowych w uchu, stosując różne modele infekcji lub odmienne metody indukcji stanu zapalnego.Po opracowaniu, obrazowanie intravitalne utorowało drogę badaczom w dziedzinie immunologii do eksploracji dynamiki trwających odpowiedzi immunologicznych u żywych zwierząt. Należy pamiętać, że praca z laserem wielofosforowym może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie ekranowanie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać stan zapalny w skórze właściwej ucha myszy oraz jak wykorzystać obrazowanie intravitalne do rejestracji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) aktywności limfocytów T CD4 przed i po podaniu przeciwciał.

imaging-cd4-t-cell-interstitial-migration-in-the-inflamed-dermis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Protokół wykrywania samoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu poprzez bezpośrednie barwienie głównymi dekstramerami klasy II kompleksu zgodności tkankowej został opisany w tym raporcie. Do kompleksowej analizy opracowano również wiarygodną metodę wyliczania częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu in situ.

In Situ Wykrywanie autoreaktywnych limfocytów T CD4 w mózgu i sercu przy użyciu dekstramerów klasy II o głównym kompleksie zgodności tkankowej

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania dynamiki komórek T CD4 w zapalnej skórze właściwej u myszy. Technika ta umożliwia badanie motoryki komórek immunologicznych in situ z wysoką rozdzielczością.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Przeglądaj więcej filmów