Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ogólnym celem niniejszego protokołu obrazowania jest wizualizacja dynamiki limfocytów T CD4+ w zapalnej skórze. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak mechanizmy leżące u podstaw ruchliwości i funkcji komórek odpornościowych w tkankach zapalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona małoinwazyjny sposób badania dynamicznego zachowania limfocytów T CD4 in situ.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania ucha do obrazowania są trudne do opanowania, a prawidłowe ułożenie ucha jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości obrazów. Nazywam się Alison Gaylo, jestem studentką studiów doktoranckich i przeprowadzę demonstrację tego protokołu. Rozpocznij od pobrania do strzykawki z igłą o rozmiarze 27,5 G 300 µL zawiesiny fluorescencyjnie znakowanych efektorowych limfocytów T na jedną mysz.

Następnie należy obrócić strzykawkę igłą do góry i delikatnie opukać jej korpus, przesuwając tłok w górę i w dół w razie potrzeby, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Gdy komórki będą gotowe, przenieść myszy do czystej klatki i umieścić je pod lampą grzewczą, aż żyły ogonowe ulegną rozszerzeniu. Następnie przenieść pierwszą mysz do restrainera i przetrzeć ogon gazikiem nasączonym alkoholem.

Po zidentyfikowaniu bocznej żyły ogonowej, powoli wstrzyknij 200 µL komórek do żyły. Gdy wszystkie komórki zostaną przeniesione, nabierz 50 µL kompletnej emulsji fluorescencyjnej do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 G i mocno naciśnij tłok, aby usunąć duże pęcherzyki powietrza. Następnie załóż naparstek na lewy palec wskazujący i ostrożnie chwyć ucho myszy między lewym kciukiem a naparstkiem, tak aby brzuszna strona ucha była skierowana do góry.

Następnie wsuń igłę, ściętą stroną do góry, w skórę właściwą w zewnętrznej jednej trzeciej małżowiny usznej, lekko poza środek, i powoli wstrzyknij dziesięć µL emulsji do tkanki. Po zaszczepieniu wszystkich zwierząt monitoruj myszy do czasu ich pełnego powrotu do sprawności. Trzy dni po immunizacji wykonaj rozszerzenie naczyń krwionośnych w żyłach ogonowych wstrzykniętych zwierząt, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Po znieczuleniu unieruchom ogon pierwszej myszy za pomocą pęsety. Przetrzyj ogon gazikiem nasączonym alkoholem, a następnie ostrożnie wprowadź kaniulę z igłą o rozmiarze 30,5 G do bocznej żyły ogonowej, sprawdzając drożność poprzez delikatny nacisk na tłok strzykawki. Po prawidłowym umieszczeniu kaniuli nanieś jedną lub dwie krople kleju tkankowego z cyjanoakrylanem w miejscu wstrzyknięcia i pozostaw klej do wyschnięcia przez około 30 sekund.

Następnie za pomocą nożyczek ostrożnie przytnąć wibrysy oraz sierść z tyłu i z boków ucha. Kolejno, za pomocą patyczka higienicznego, nawilżyć wewnętrzną powierzchnię ucha roztworem PBS. Następnie obrócić mysz i dociśnąć wstrzyknięte ucho do szkiełka podstawowego nr 1,5 o wymiarach 24 by 50 millimeter, aż będzie ono przylegać płasko do szkła.

Odsącz nadmiar PBS. Następnie, używając dwóch par zakrzywionych pęset, chwyć wzdłuż górnych rogów kawałek taśmy materiałowej o długości około 20 mm i przyłóż dół taśmy do szkiełka nakrywki u nasady ucha myszy. Przewiń taśmę przez resztę ucha, odsuwając pęsetą nadmiar włosów w razie potrzeby, a następnie za pomocą suchego patyczka bawełnianego delikatnie dociśnij taśmę wokół ucha, aby zapewnić szczelne przyleganie, uważając, by nie uciskać samego ucha.

Niezbędne jest prawidłowe przyklejenie ucha do szkiełka nakrywkowe za pomocą taśmy, zapewniając szczelne zamknięcie po obu stronach oraz minimalną liczbę pęcherzyków powietrza, ponieważ wpływa to na jakość uzyskiwanych obrazów. Następnie przyklej platformę do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym do bloku grzejnego o temperaturze 37 stopni Celsius i nanieś smar próżniowy na obie strony obszaru platformy przeznaczonego na ucho. Obróć mysz, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na platformie, dbając o to, by ucho znajdowało się w centrum filcu.

Po umieszczeniu ucha, wciśnij maskę do izofluranu w uchwyt na platformie, upewniając się, że maska jest stabilnie zamocowana i całkowicie zakrywa nos myszy. Następnie za pomocą patyczka higienicznego mocno, lecz ostrożnie, dociśnij szkiełko nakrywkę do platformy obrazującej, rozprowadzając smar próżniowy pod szkiełkiem. Owiń górną część platformy dwoma kawałkami taśmy o długości 20 mm oraz dwoma dłuższymi kawałkami, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do platformy.

Następnie przenieś mysz na stolik mikroskopu. Zabezpiecz platformę dodatkową taśmą i nałóż podkrywkę podwójną warstwę smaru próżniowego wokół ucha. Następnie owiń mysz wypełnionym wodą kocem grzewczym i wypełnij zbiornik ze smarem próżniowym wodą destylowaną o temperaturze 37 °C.

W przypadku obrazowania timelapse in vivo należy rozpocząć od ustawienia obiektywu nad środkiem ucha, a następnie obniżać go, aż dotknie powierzchni wody w zbiorniku. Następnie, korzystając z zewnętrznego źródła światła, powoli obniżaj obiektyw, aż powierzchnia ucha znajdzie się w ogniskowej. Po tym opuść wewnętrzne i zewnętrzne osłony wokół stolika mikroskopu, a następnie dostosuj długość fali lasera do 900 nanometrów w oknie sterownika lasera MP, moc lasera w oknie ustawień akwizycji lasera oraz napięcia PMT w oknie sterowania akwizycją obrazu.

W oknach ustawień rozmiaru i trybu akwizycji ustaw rozdzielczość mikroskopu na 512 na 512 pikseli, czas przebywania wiązki na piksel na poziomie 2 µs i wybierz opcję XY repeat, aby aktywować tryb obrazowania na żywo podczas skanowania tkanki. Po zlokalizowaniu odpowiedniego pola obrazowania, znajdź najwyższą komórkę w skórze właściwej i kliknij przycisk set zero, aby ustawić pozycję Z na zero. Przewiń w dół w kierunku Z, aby zmierzyć głębokość komórki.

Następnie ustaw pozycje początkową i końcową w oknie ustawień akwizycji mikroskopu oraz dostosuj napięcia PMT instrumentu i moc lasera w oknie jasnego Z, aby zoptymalizować wizualizację komórek w całej głębokości pola obrazowania. Zaznacz przyciski głębokości (depth) i czasu (time), a w oknie trybu filtra sterowania akwizycją obrazu ustaw wspólny filtr, aby zeskanować obraz trzy razy na linię. Dostosuj głębokość warstwy Z w oknie mikroskopu akwizycji obrazu tak, aby zarejestrowanie pełnego stosu trwało około jednej minuty, zgodnie z informacją w oknie podglądu czasu.

Następnie, aby ocenić stabilność tkanki, ustaw liczbę powtórzeń na pięć w oknie ustawień akwizycji skanowania czasowego i kliknij przycisk skanowania, aby zarejestrować obraz poklatkowy obszaru z pięciominutowym odstępem czasu. Jeśli tkanka pozostanie stabilna po pięciu minutach, ustaw liczbę powtórzeń w zakresie od 30 do 45 w oknie ustawień akwizycji skanowania czasowego i zarejestruj obraz poklatkowy z przedziału 30 do 45 minut, monitorując ewentualny niewielki dryft tkanki podczas zbierania obrazów. Zapisz obraz przed aplikacją przeciwciał w odpowiednim formacie, a następnie nabierz mieszaninę przeciwciał do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL, dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza.

Delikatnie naciśnij tłok, aby roztwór przeciwciał utworzył kroplę na końcówce igły, a następnie podnieś osłony wokół stołu, aby zlokalizować cewnik. Zastąp strzykawkę z PBS strzykawką z przeciwciałami, a następnie powoli wstrzyknij przeciwciała do cewnika. Po pomyślnym wstrzyknięciu przeciwciał ponownie opuść osłony i zanotuj czas iniekcji.

Następnie niezwłocznie rozpocznij nową 20- do 40-minutową sekwencję obrazowania, w tym samym miejscu, korzystając z tych samych ustawień instrumentu, co przy obrazowaniu przed podaniem przeciwciała. Na koniec zapisz plik obrazu po podaniu przeciwciała w odpowiednim formacie i ostrożnie zdejmij mysz ze stolika mikroskopu, monitorując zwierzę do czasu jego pełnego wybudzenia. Obrazowanie nienaruszonej skóry właściwej ucha zgodnie z tym protokołem umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości oraz obrazów poklatkowych dynamiki efektorowych limfocytów T w zapalnej skórze właściwej.

W tym filmie można zaobserwować zielone, adoptywnie przetransferowane efektorowe limfocyty T przemieszczające się w tkance skóry właściwej. Jednak po podaniu przez cewnik przeciwciał blokujących entogrinę antibeta one i antibeta three, uprzednio ruchliwe komórki zatrzymują się w skórze właściwej. Po podaniu przeciwciał komórki wykazują zmniejszoną średnią prędkość, a także znaczący spadek indeksu meandrowania.

Oznacza to stosunek całkowitego przesunięcia do całkowitej długości toru. Autofluorescencja mieszków włosowych, cieniowanie i autofluorescencja nakładających się włosów oraz pęcherzyki powietrza uwięzione między powierzchnią ucha a szkiełkiem podstawowym mogą prowadzić do powstawania artefaktów obrazowania, które utrudniają wizualizację limfocytów T i zakłócają działanie oprogramowania do zautomatyzowanej analizy obrazu. Ponadto stosowanie wielu źródeł ciepła może powodować problemy ze stabilnością tkanki, co prowadzi do dużych oscylacji podczas obrazowania, utrudniając interpretację wyników.

Po opanowaniu techniki obrazowanie limfocytów T CD4 w skórze właściwej można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu odpowiednich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i zasad ich wykorzystywania w pracy z myszami. Procedurę tę można dostosować w celu wizualizacji innych subpopulacji limfocytów T lub rodzajów komórek odpornościowych w uchu, stosując różne modele infekcji lub odmienne metody indukcji stanu zapalnego.

Po opracowaniu, obrazowanie intravitalne utorowało drogę badaczom w dziedzinie immunologii do eksploracji dynamiki trwających odpowiedzi immunologicznych u żywych zwierząt. Należy pamiętać, że praca z laserem wielofosforowym może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie ekranowanie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać stan zapalny w skórze właściwej ucha myszy oraz jak wykorzystać obrazowanie intravitalne do rejestracji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) aktywności limfocytów T CD4 przed i po podaniu przeciwciał.