Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Ogólnym celem tego protokołu obrazowania jest wizualizacja dynamiki limfocytów T CD4-dodatnich w skórze objętej stanem zapalnym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak, jakie są mechanizmy leżące u podstaw ruchliwości komórek odpornościowych i funkcji w tkankach objętych stanem zapalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona minimalnie inwazyjny sposób badania dynamicznego zachowania limfocytów T CD4 in situ.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki przygotowania ucha do obrazowania są trudne do nauczenia, a właściwe ustawienie ucha jest niezbędne do uchwycenia wysokiej jakości obrazów. Nazywam się Alison Gaylo, jestem doktorantką i będę demonstrować ten protokół. Zacznij od zassania 300 mikrolitrów znakowanej fluorescencyjnie zawiesiny efektorowych limfocytów T na mysz do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 i pół grubości.

Następnie obrócić igłę strzykawki do góry i delikatnie przesunąć trzon strzykawki, przesuwając tłok w górę i w dół, w zależności od potrzeb, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Kiedy komórki będą gotowe, przenieś myszy do czystej klatki i umieść je pod lampą grzewczą, aż żyły ogonowe zostaną rozszerzone na naczynia krwione. Następnie przenieś pierwszą mysz do ogranicznika i przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem.

Po zidentyfikowaniu bocznej żyły ogonowej powoli wstrzyknij 200 mikrolitrów komórek do żyły. Po przeniesieniu wszystkich komórek należy pobrać 50 mikrolitrów kompletnej emulsji fluorescensyjnej do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28 i pół i pół rozmiaru i mocno docisnąć tłok, aby usunąć wszelkie duże pęcherzyki powietrza. Następnie umieść naparstek na lewym palcu wskazującym i ostrożnie chwyć ucho myszy między lewym kciukiem a naparstkiem, uchem brzusznym skierowanym do góry.

Następnie wsuń igłę, skośną stroną do góry, do skóry właściwej w zewnętrznej jednej trzeciej małżowiny usznej i nieco poza środek, i powoli wstrzyknij dziesięć mikrolitrów emulsji do tkanki. Po wstrzyknięciu wszystkim zwierzętom należy monitorować myszy, aż w pełni wyzdrowieją. Trzy dni po szczepieniu należy oczyścić naczynia krwionośne zwierząt, którym wstrzyknięto implanty, jak właśnie pokazano.

Po znieczuleniu unieruchomij ogon pierwszej myszy za pomocą kleszczy. Przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie ostrożnie wsuń cewnik igłowy o rozmiarze 30 i pół do bocznej żyły ogonowej, sprawdzając drożność poprzez delikatny nacisk na tłok strzykawki. Gdy cewnik jest na miejscu, nałóż jedną lub dwie krople kleju tkankowego z cyjanoakrylanu na miejsce wstrzyknięcia i pozostaw klej do wyschnięcia na około 30 sekund.

Następnie użyj nożyczek, aby ostrożnie przyciąć wąsy i włosy z tyłu i po bokach ucha. Następnie za pomocą bawełnianego wacika zwilż wewnętrzną powierzchnię ucha PBS. Następnie obróć mysz i spłaszcz wstrzyknięte ucho na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 na 50 milimetrów, aż zrówna się ze szkłem.

Usuń nadmiar PBS. Następnie użyj dwóch par zakrzywionych kleszczy, aby chwycić kawałek taśmy z tkaniny o długości około 20 milimetrów wzdłuż w górnych rogach i umieść dolną część taśmy na szkiełku nakrywkowym w górnej części ucha myszy. Przeciągnij taśmę po pozostałej części ucha, w razie potrzeby odpychając nadmiar włosów za pomocą kleszczy, a następnie za pomocą suchego bawełnianego wacika delikatnie dociśnij taśmę wokół ucha, aby zapewnić szczelne uszczelnienie, uważając, aby nie naciskać na samo ucho.

Istotne jest, aby ucho było prawidłowo przyklejone do szkiełka nakrywkowego z dobrym uszczelnieniem po obu stronach i z minimalną ilością pęcherzyków powietrza, ponieważ wpłynie to na jakość obrazów, które można uzyskać. Teraz przyklej platformę do obrazowania mikroskopem fluorescencyjnym do bloku grzewczego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i nałóż smar próżniowy po obu stronach obszaru ucha platformy. Obróć mysz, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na platformie, uważając, aby ucho było wyrównane na środku filcu.

Gdy ucho jest na swoim miejscu, zatrzaśnij stożek nosowy izofluranu w uchwycie na platformie, upewniając się, że stożek jest bezpieczny i całkowicie zakrywa nos myszy. Następnie za pomocą bawełnianego wacika mocno, ale ostrożnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do platformy obrazowania, rozprowadzając smar próżniowy pod szkiełkiem nakrywkowym. Owiń dwa 20-milimetrowe kawałki i dwa dłuższe kawałki taśmy wokół górnej części platformy, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do platformy.

Następnie przesuń mysz do stolika mikroskopu. Zabezpiecz platformę większą ilością taśmy i nałóż podwójną warstwę smaru próżniowego na szkiełko osłonowe wokół ucha. Następnie owiń mysz kocem grzewczym wypełnionym wodą i napełnij zbiornik tłuszczu próżniowego wodą destylowaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W przypadku obrazowania poklatkowego in vivo zacznij od umieszczenia obiektywu nad środkiem ucha i opuść obiektyw, aż zetknie się z powierzchnią wody w zbiorniku. Następnie, korzystając z zewnętrznego źródła światła, powoli opuść obiektyw, aż powierzchnia ucha stanie się ostra. Następnie opuść wewnętrzną i zewnętrzną kurtynę wokół stolika mikroskopu i dostosuj długość fali laserowej do 900 nanometrów w oknie kontrolera lasera MP, moc lasera w oknie laserowym ustawień akwizycji oraz napięcia PMT w oknie kontroli akwizycji obrazu.

W oknach ustawień akwizycji, rozmiaru i trybu, ustaw mikroskop na rozdzielczość pięć dwanaście na pięć dwunastu pikseli, z czasem przebywania dwóch mikrosekund na piksel, a następnie wybierz opcję Powtórz XY, aby aktywować tryb obrazowania na żywo w celu skanowania przez tkankę. Po zlokalizowaniu odpowiedniego pola obrazowania zlokalizuj najwyższą komórkę w skórze właściwej i kliknij przycisk ustaw zero, aby ustawić pozycję Z na zero. Przewiń w dół w kierunku Z, aby zmierzyć głębokość komórki.

Następnie ustaw pozycję początkową i końcową w oknie mikroskopu ustawień akwizycji i dostosuj napięcia PMT instrumentu i moc lasera w jasnym oknie Z, aby zoptymalizować wizualizację komórek na całej głębokości pola obrazowania. Sprawdź przyciski głębi i czasu, a następnie ustaw wspólny filtr, aby skanować obraz trzy razy w każdym wierszu w oknie trybu filtra kontroli akwizycji obrazu. Dostosuj głębokość wycinka Z w oknie mikroskopu akwizycji obrazu tak, aby uchwycenie całego stosu trwało około jednej minuty, jak zaznaczono w oknie podglądu czasu.

Następnie, aby ocenić stabilność tkanki, ustaw liczbę powtórzeń na pięć w oknie skanowania ustawień czasu akwizycji i kliknij przycisk skanowania, aby uchwycić pięciominutowy obraz poklatkowy tego obszaru. Jeśli tkanka jest stabilna po pięciu minutach, ustaw liczbę powtórzeń na od 30 do 45 w oknie skanowania ustawień akwizycji i zbierz obraz poklatkowy od 30 do 45 minut, monitorując wszelkie drobne dryfy tkanki podczas zbierania obrazu. Zapisz obraz przeciwciał w odpowiednim formacie, a następnie narysuj mieszaninę przeciwciał do jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej , uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.

Delikatnie nacisnąć tłok tak, aby roztwór przeciwciała utworzył kropelkę na końcu igły, a następnie podnieść zasłony wokół sceny, aby zlokalizować cewnik. Zastrzykać PBS strzykawką z przeciwciałami, a następnie powoli wstrzyknąć przeciwciała do cewnika. Po pomyślnym wstrzyknięciu przeciwciał należy ponownie opuścić zasłony i zanotować czas wstrzyknięcia.

Następnie natychmiast rozpocznij pobieranie nowej 20-40-minutowej sekwencji obrazowania w tym samym miejscu, przy użyciu tych samych ustawień instrumentu, co w przypadku obrazu przed przeciwciałami. Na koniec zapisz plik obrazu po przeciwciałach w odpowiednim formacie i ostrożnie wyjmij mysz ze stolika mikroskopu, monitorując zwierzę aż do całkowitego wyzdrowienia. Obrazowanie nienaruszonej skóry właściwej ucha za pomocą tego protokołu ułatwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości i poklatkowych obrazów dynamiki efektorowych limfocytów T w zapalnej skórze właściwej.

W tym filmie można zaobserwować zielone, adoptywnie przeniesione efektorowe limfocyty T poruszające się w tkance skórnej. Jednak po podaniu przeciwciał blokujących entogrynę antybeta jeden i antybeta trzy przez cewnik, wcześniej ruchliwe komórki zatrzymują się w skórze właściwej. Komórki wykazują zmniejszoną średnią prędkość po podaniu przeciwciał, a także znaczny spadek ich meandrującego indeksu.

Oznacza to, że stosunek całkowitego przemieszczenia do całkowitej długości toru. Autofluorescencje z mieszków włosowych, cienie i autofluorescencje z włosów pokrywających oraz pęcherzyki powietrza uwięzione między powierzchnią ucha a szkiełkiem nakrywkowym mogą prowadzić do artefaktów obrazowania, które zaciemniają wizualizację limfocytów T i zakłócają działanie oprogramowania do automatycznej analizy obrazu. Ponadto korzystanie z wielu źródeł ciepła może powodować problemy ze stabilnością tkanek, co prowadzi do dużych oscylacji podczas obrazowania, które utrudniają interpretację wyników.

Po opanowaniu obrazowanie limfocytów T CD4 w skórze właściwej można zakończyć w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli procedura została wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu odpowiednich wytycznych dotyczących pielęgnacji zwierząt i stosowania ich podczas pracy z myszami. Procedura ta może być dostosowana do wizualizacji innych podzbiorów limfocytów T lub typów komórek odpornościowych w uchu, przy użyciu różnych modeli infekcji lub różnych metod wywoływania stanu zapalnego.

Po jego opracowaniu, obrazowanie przyżyciowe utorowało drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania dynamiki trwających odpowiedzi immunologicznych u żywych zwierząt. Nie zapominaj, że praca z laserem wieloluminoforowym może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiednie ekranowanie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać stan zapalny w skórze właściwej ucha myszy, jak używać obrazowania przyżyciowego do uchwycenia poklatkowych obrazów aktywności limfocytów T CD4 przed i po podaniu przeciwciał.