Name: Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę wyciszania mRNA za pomocą siRNA do oceny wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Technika umożliwia badanie segregacji chromosomów i mechanizmów aneuploidii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez University of Georgia oraz grant (HD071330) od National Institutes of Health dla MMV.

Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Georgii.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Do hodowli oocytów należy zakupić lub świeżo przygotować Minimal Essential Medium (MEM) i uzupełnić je o 3 mg/ml albuminy surowicy wołowej (BSA), zgodnie z opisem w Tabeli 1. Polistyrenową butelkę należy umieścić na wadze analitycznej (tarystować do zera). Należy kolejno dodać wszystkie odczynniki, z wyjątkiem BSA, i uzupełnić objętość końcową wodą MQ przez odważenie do całkowitej masy 250 g. Następnie należy dodać BSA, pozwolić jej się rozpuścić i przeprowadzić sterylizację przez filtrowanie. 
	Uwaga: Opisane pożywka MEM wymaga równoważenia i inkubacji komórek w medycznej mieszaninie gazów: 5% CO2, 5% O2 i 90% N2. Można jednak stosować inne pożywki (np. CZB), które umożliwiają inkubację komórek w 5% CO2 w warunkach atmosferycznych.</li>
	<li>Do mikroiniekcji oocytów należy zakupić lub przygotować pożywkę M2.</li>
	<li>Należy przygotować gonadotropinę z surowicy klaczy ciężarnej (PMSG) o stężeniu 5 IU/100 µl.</li>
	<li>Należy zakupić i zrekonstytuować zapasy siRNA do stężenia roboczego 1 µM.</li>
</ol>
2. Pobieranie oocytów myszy
<ol>
	<li>DZIEŃ 1: Aby pobudzić rozwój pęcherzyków jajnikowych i zwiększyć liczbę pęcherzyków przedowulacyjnych, podaj 5 IU PMSG domięśniowo samicom myszy na 48 h przed pobraniem oocytów.</li>
	<li>DZIEŃ 3: Do pobierania i hodowli oocytów przygotuj szalki hodowlane 35 mm z 3 ml MEM/BSA uzupełnionego o 1 µg/ml milrinonu. Ten inhibitor fosfodiesterazy utrzymuje oocyty w fazie zatrzymania w profazie I i zapobiega rozpadowi pęcherzyka zarodkowego (GVBD). Równoważ szalki hodowlane w medycznej mieszaninie gazów przez co najmniej 15 min. 
	Uwaga: Pożywka uzupełniona milrinonem jest wymagana podczas całego procesu pobierania oocytów, a także podczas mikroiniekcji oocytów i 24-godzinnego okresu hodowli po zastosowaniu siRNA.</li>
	<li>Pobierz jajniki od samic myszy zgodnie z uznanymi procedurami laboratoryjnymi15 i przenieś je do nowej szalki hodowlanej z uprzednio ogrzanym i zrównoważonym MEM/BSA/milrinonem.</li>
	<li>Umieść szalkę hodowlaną na stole stereomikroskopu w celu pobrania oocytów. Uwolnij kompleksy cumulus-oocyt (COC) poprzez ręczne nakłucie pęcherzyków antralnych igłami 27 G. Przymocuj jeden jajnik do dna szalki hodowlanej za pomocą igły 27 G przymocowanej do strzykawki 1 ml, a drugą igłą nakłuj wszystkie duże pęcherzyki. Powtórz czynność dla każdego jajnika.</li>
	<li>Stosując standardowe procedury pipetowania ustnego lub inne metody aspiracji oocytów, zbierz wszystkie oocyty otoczone dwiema lub większą liczbą warstw zwartych komórek cumulus. Przenieś COC do nowej szalki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Ostrożnie usuń otaczające komórki cumulus poprzez wielokrotne, delikatne pipetowanie pipetą 1 ml ustawioną na objętość aspiracji 750 µl. Powtórz etap pipetowania około 12 razy i pozostaw oocyty do regeneracji na 5 min. Kontynuuj w ten sposób, aż wszystkie lub większość komórek cumulus zostanie usunięta. Przenieś odarte z cumulusu oocyty do innej szalki hodowlanej i pozostaw do zrównoważenia w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
	<li>Podziel oocyty odarte z cumulusu na trzy grupy eksperymentalne przeznaczone do: (i) mikroiniekcji specyficznych siRNA przeciwko badanemu celowi, (ii) mikroiniekcji niespecyficznych (kontrolnych) siRNA oraz (iii) grupy kontrolnej nieiniekcyjnej w celu uwzględnienia warunków hodowli.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja oocytów
<ol>
	<li>Przygotować szalki hodowlane z 3 ml pożywki M2 uzupełnionej o milrinon (1 µg/ml) do mikroiniekcji oocytów. Przygotować szalki hodowlane zawierające MEM/BSA/milrinon do przemywania i późniejszej hodowli iniekcyjnych oocytów. 
	Uwaga: Pożywka M2 zawiera bufor HEPES i wymaga wstępnego ogrzania w temperaturze 37 °C przez 15 min w warunkach atmosferycznych. MEM wymaga wstępnego ogrzania i równoważenia przy użyciu gazów medycznych zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Przygotować układ do mikroiniekcji. Napełnić igłę iniekcyjną 5 µl 1 µM roztworu specyficznego siRNA. Zamocować pipetę trzymającą oraz igłę iniekcyjną w mikromanipulatorach układu do mikroiniekcji i skonfigurować jednostkę iniekcyjną z kalibrowanym wolumenem i ciśnieniem.</li>
	<li>Nanieść mikrokroplę 200 µl pożywki M2 na wewnętrzną stronę pokrywki szalki hodowlanej o średnicy 3 cm i dodać oocyt w celu ustawienia i wyrównania układu do mikroiniekcji.</li>
	<li>Kierując się położeniem oocytu, dostosować pozycje igły trzymającej i iniekcyjnej. Przyłożyć podciśnienie do pipety trzymającej, aby delikatnie unieruchomić oocyt, a następnie ustawić igłę iniekcyjną na wysokości największej średnicy komórki. Dostosować ustawienia, aby umożliwić mikroiniekcję około 10 pl roztworu siRNA w dowolne miejsce cytoplazmy oocytu. 
	 <img alt="Układ do zapłodnienia in vitro; mikroiły trzymające komórki w szalce Petriego; obraz mikroskopowy embrionu." src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
	Rycina 1. Układ do mikroiniekcji oocytów. (A) Reprezentatywny obraz mikrokropli 200 µl pożywki M2 umieszczonej na pokrywce szalki hodowlanej o średnicy 3 cm, z pipetą trzymającą i igłą iniekcyjną ustawionymi odpowiednio po lewej i prawej stronie. (B) Grupa oocytów zatrzymanych w profazie I (stadium GV) przed mikroiniekcją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a> 
	 </li>
	<li>Umieścić pokrywkę z powrotem na stole stereomikroskopu i dodać mikrokroplę 200 µl świeżej pożywki M2. Do mikrokropli przenieść grupę oocytów (~10) za pomocą pipetowania ustnego lub innych metod, a następnie umieścić pokrywkę z mikrokroplą na stole do mikroiniekcji.
	<ol>
		<li>Przystąpić do mikroiniekcji poszczególnych oocytów. Unieruchomić jeden oocyt pipetą trzymającą, powoli wprowadzić końcówkę igły iniekcyjnej do cytoplazmy i wprowadzić objętość iniekcyjną roztworu siRNA. Ostrożnie wycofać igłę iniekcyjną i przenieść iniekcyjny oocyt na dno mikrokropli. Oocyty, w których iniekcja nie powiodła się, przenieść do górnej części mikrokropli.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę mikroiniekcji dla każdego oocytu. Aby zachować optymalną żywotność oocytów, mikroiniekcję należy przeprowadzać tylko dla niewielkiej liczby oocytów naraz. Należy dopilnować, aby proces ten nie trwał dłużej niż kilka minut, aby zapobiec zmianom temperatury i pH w mikrokropli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odssać pomyślnie zainiekowane oocyty lub ostrożnie przenieść pokrywkę z mikrokroplą zainiekcyjnych oocytów pod stereomikroskop. Przenieść żywotne, zainiekowane oocyty za pomocą pipetowania ustnego lub innych metod do pożywki MEM/BSA/milrinon w celu przemycia i równoważenia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Używając kolejnej grupy oocytów, powtórzyć proces mikroiniekcji z nową igłą iniekcyjną napełnioną niespecyficznymi siRNA dla grupy kontrolnej. Przemyć oocyty w MEM/BSA/milrinonie i przenieść do oddzielnej szalki hodowlanej.</li>
	<li>Hodować wszystkie grupy oocytów przez 24 h w MEM/BSA/milrinonie w temperaturze 37 °C w atmosferze gazów medycznych. 
	Uwaga: Okres hodowli z „blokadą milrinonową” jest niezbędny do wydajnej deplecji docelowego mRNA/białka.</li>
</ol>
4. Hodowla oocytów w celu dojrzewania meiotycznego
<ol>
	<li>DZIEŃ 4: Dla każdej eksperymentalnej grupy oocytów przygotuj 4 naczynia hodowlane (35 mm) z 3 ml MEM/BSA. Jedno naczynie z pożywką dla każdej grupy uzupełnij o 10% (wysokiej jakości) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby wykorzystać ją do dojrzewania oocytów. Pozostaw wszystkie naczynia hodowlane do wyrównania temperatury do 37 °C w obecności medycznej mieszaniny gazów.</li>
	<li>Aby znieść „blokadę milrinoną”, przemyj oocyty sekwencyjnie trzy razy w naczyniach zawierających MEM/BSA, a następnie przenieś je do naczynia do dojrzewania zawierającego pożywkę z 10% FBS. Hoduj wszystkie grupy oocytów przez 17 hr w 37 °C, aby umożliwić wznowienie i postęp mejozy.</li>
	<li>DZIEŃ 5: Przygotuj roztwory do fiksacji oocytów, w tym: (i) 4% paraformaldehyd (PFA) w buforze PEM (100 mM PIPES [pH 6.9], 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA) z 0,5% Triton-X 100 oraz (ii) PBS uzupełniony o 5% FBS, który posłuży do przemywania i blokowania oocytów. 
	Uwaga: Roztwory te wymagają uprzedniego ogrzania do 37 °C przed fiksacją oocytów.</li>
	<li>Do fiksacji oocytów (po 17 hr hodowli) szybko przenieś każdą eksperymentalną grupę oocytów metodą pipetowania ustnego lub innymi metodami do poszczególnych dołków (w naczyniu 4-dołkowym) zawierających 750 µl uprzednio ogrzanego 4% roztworu PFA i inkubuj w 37 °C przez 1 hr. Następnie przemyj każdą grupę oocytów 3 razy (po 15 min każde) w 750 µl uprzednio ogrzanego PBS zawierającego 5% FBS.</li>
	<li>Blokuj oocyty w 200 µl PBS/5% FBS przez noc (O/N) w 4 °C, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.</li>
</ol>
5. Analiza immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>DZIEŃ 6:  
	Uwaga: Immunobarwienie przeprowadza się w płytce wielodołkowej, a oocyty są sekwencyjnie przenoszone do kolejnych dołków zawierających odpowiednie roztwory przeciwciał i roztwory płuczące. Można stosować płytki 48- lub 96-dołkowe, dostosowując objętość roztworu do wielkości dołka. W przypadku płytek 96-dołkowych należy użyć 200 µl na dołek. Oocyty są przenoszone do poszczególnych roztworów w następującej kolejności: roztwór przeciwciał pierwszorzędowych - 3 dołki do płukania - roztwór przeciwciał wtórnych - 3 dołki do płukania. Aby ograniczyć ekspozycję na światło, płytkę można przykryć folią. 
	Przygotować świeży PBS/5% FBS i użyć tego roztworu do przygotowania rozcieńczeń przeciwciał (np. królicze przeciwciało anty-pericentrin (1/1,000), mysie przeciwciało anty-tubulin (1/1,000)).</li>
	<li>Przenieść utrwalone oocyty z każdej grupy eksperymentalnej do oddzielnych dołków zawierających 200 µl (lub 100 µl, jeśli preferowana jest mniejsza objętość) roztworu przeciwciał pierwszorzędowych i przykryć dołek paraflemem. Inkubować zgodnie z optymalnymi warunkami dla danego przeciwciała (np. 37 °C przez 1 hr lub 4 °C O/N). 
	Uwaga: Rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych, a także czas i temperatura inkubacji wymagają optymalizacji dla różnych stosowanych przeciwciał.</li>
	<li>Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi wypłukać oocyty trzykrotnie w PBS/5% FBS (po 10-15 min każdy etap).</li>
	<li>Przenieść oocyty do roztworu zawierającego koniugaty przeciwciał wtórnych z fluorochromami (np. rozcieńczenie 1/1,000 przeciwciał anty-króliczych i anty-mysich sprzężonych z fluorochromami o różnych długościach fal). Inkubować przez 1 hr w 37 °C.</li>
	<li>Wypłukać oocyty trzykrotnie w PBS/5% FBS (po 10 – 15 min każdy etap).</li>
	<li>Po ostatnim etapie płukania przenieść oocyty na czyste szkiełko przedmiotowe i delikatnie odessać nadmiar roztworu płuczącego. Pozwoli to na unieruchomienie oocytów na powierzchni szkła. Dodać 8 µl medium montażowego (zawierającego DAPI) i ostrożnie przykryć medium szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 22 mm. Opuszczać szkiełko powoli, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza i/lub uszkodzenia oocytów. 
	Uwaga: Alternatywnie, aby zachować trójwymiarowe właściwości oocytu do analizy w mikroskopii konfokalnej, przed montażem na szkiełku dodać do narożników szkiełka nakrywkowego niewielką objętość kulek szklanych o średnicy 100 µm (wymieszanych z wazeliną).</li>
	<li>Przechowywać szkiełka w 4 °C lub przystąpić do oceny postępu mejozy oraz analizy poziomów ekspresji i subkomórkowej lokalizacji białek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dopasowane do użytych przeciwciał wtórnych.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li>
<li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li>
<li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li>
<li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li>
<li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome%3A+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li>
<li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1%2FEg2+in+maturing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li>
<li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+%28GV%29+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li>
<li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li>
<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Chociaż istnieje wiele metod transferu egzogennych kwasów nukleinowych do komórek somatycznych, takich jak elektroporacja i transfekcja, mikroiniekcja jest optymalną metodą dostarczania cząsteczek RNA do transkrypcyjnie uśpionych oocytów myszy. Obecny protokół zapewnia skuteczne podejście do zubożenia in vitro określonych mRNA, które umożliwia testowanie funkcjonalne różnych czynników wrzeciona i/lub MTOC w oocytach. Takie podejście powoduje efektywne zubożenie transkryptu i jest wysoce elastyczne. Chociaż siRNA...

Mejoza to unikalny proces podziału, który zachodzi w gametach (oocytach i plemnikach) i obejmuje dwa kolejne podziały bez ingerencji syntezy DNA w celu segregacji homologicznych chromosomów i chromatyd siostrzanych podczas mejozy-I i mejozy-II, odpowiednio1. Błędy w segregacji chromosomów podczas podziału mejotycznego w oocytach mogą skutkować aneuploidią, która jest dziedziczona przez zarodek podczas zapłodnienia. Warto zauważyć, że częstość występowania aneuploidii w rozwijających się zarodkach wzrasta wraz z wiekiem matki i jest główną przyczyną wrodzonych wad wrodzonych, a także utraty ciąży u kobiet1,2, co podkreśla ważną potrzebę zrozumienia molekularnych podstaw aneuploidii podczas podziału mejotycznego.
Podczas podziału komórki, segregacja chromosomów jest w decydującym stopniu zależna od montażu aparatu wrzeciona mikrotubuli i ustanowienia stabilnych interakcji chromosom-mikrotubula dla prawidłowego przyłączenia do przeciwległych biegunów wrzeciona. Co ważne, tworzenie wrzeciona mejotycznego w oocytach ssaków różni się od mitozy w komórkach somatycznych i jest regulowane przez unikalne centra organizujące mikrotubule (MTOC), które nie mają centrioli3,4. Niezbędne białka niezbędne do zarodkowania i organizacji mikrotubul lokalizują się w MTOC oocytów, w tym γ-tubulina, która katalizuje składanie mikrotubul. Ponadto perycentryna działa jako niezbędne białko rusztowania, które wiąże i zakotwicza γ-tubulinę, a także inne czynniki w MTOC5. Warto zauważyć, że nasze badania pokazują, że wyczerpanie kluczowych białek związanych z MTOC zakłóca organizację wrzeciona mejotycznego i prowadzi do błędów segregacji chromosomów w oocytach, które nie są w pełni rozwiązane przez punkt kontrolny składania wrzeciona (SAC)6,7. W związku z tym defekty stabilności wrzeciona, które nie powodują zatrzymania mejozy, stanowią znaczne ryzyko, przyczyniając się do aneuploidii. Pomimo ich zasadniczej roli w składaniu i organizacji wrzeciona, skład i funkcja białek MTOC oocytów pozostaje słabo poznana.
Testowanie funkcji specyficznych białek docelowych w oocytach ssaków jest wyzwaniem, ponieważ komórki stają się transkrypcyjnie spokojne na krótko przed wznowieniem mejozy8,9. W związku z tym oocyty przedowulacyjne polegają na matczynych zapasach mRNA, aby wznowić mejozę i wspierać podział mejotyczny, a także pierwsze podziały rozszczepienia po zapłodnieniu10,11. Skuteczność degradacji transkryptów mRNA w oocytach ssaków za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) jest dobrze znana, a matczyne RNA rekrutowane do translacji podczas dojrzewania mejotycznego są szczególnie podatne na siRNA ukierunkowane na 12-14. Dlatego mikroiniekcja krótkich interferujących RNA (siRNA) do oocytów stanowi cenne podejście do wyczerpania docelowych mRNA do testów funkcjonalnych.
Tutaj opisujemy metody izolacji mysich oocytów i pośredniczonego przez siRNA zubożenia określonych transkryptów, aby przetestować funkcję niezbędnego białka związanego z MTOC, perycentryny. Ponadto opisujemy warunki analizy immunofluorescencyjnej w celu oceny tworzenia wrzeciona mejotycznego w oocytach.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciężarna gonadotropina surowicy klaczy (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Receptura opisana w Tabeli 1</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Earle'a (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sód Wodorowęglan</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy, sól sodowa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G, sól potasowa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa dwuwodna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy Egzogenne (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina witamin MEM (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka EmbryoMax M2 z Hepes</td><td>SiRNA EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>ukierunkowane na perycentrynę</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>siRNA kontroli negatywnej&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16% roztwór)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anty-perycentryna (królik)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Antyacetylowana a-tubulina (mysz)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Główne wyposażenie</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy świetlówkowy Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System mikroiniekcji Femtojet</td><td>Mikromanipulatory Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły do mikroiniekcji Eppendorf</td><td></td><td></td> (femtotips)Pipety Eppendorf 930000035 <td></td></tr><tr><td>Holding (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>Plasticware</td><td></td></tr><tr><td>Szalki</td> hodowlane ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>System filtrów CA 0,45 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem sirna

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Błędy w segregacji chromosomów podczas podziału mejotycznego w gametach mogą prowadzić do aneuploidii, która jest następnie przekazywana do zarodka po zapłodnieniu. Wynikająca z tego aneuploidia w rozwijających się zarodkach jest uznawana za główną przyczynę utraty ciąży i wrodzonych wad wrodzonych, takich jak zespół Downa. Dokładna segregacja chromosomów jest krytycznie zależna od tworzenia aparatu wrzeciona mikrotubul, jednak proces ten pozostaje słabo poznany w oocytach ssaków. Co ciekawe, montaż wrzeciona mejotycznego różni się od mitozy i jest regulowany, przynajmniej częściowo, przez unikalne centra organizacyjne mikrotubul (MTOC). Ocena białek związanych z MTOC może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów regulacyjnych, które rządzą tworzeniem i organizacją wrzeciona mejotycznego. W tym miejscu opisujemy metody izolowania oocytów myszy i zubożania białek związanych z MTOC przy użyciu podejścia do funkcji testowej za pośrednictwem siRNA. Ponadto opisujemy warunki wiązania oocytów i analizy immunofluorescencyjnej w celu oceny tworzenia i organizacji wrzeciona mejozycznego.

Mikroiniekcja siRNA stanowi skuteczne podejście do degradacji mRNA i następującego po niej wyczerpania białka w oocytach, co umożliwia wydajne i wysoce specyficzne testowanie funkcjonalne różnych czynników docelowych in vitro. Następnie immunofluorescencję wykorzystuje się do specyficznej analizy fenotypu, a także w celu walidacji wyczerpania białka w oocytach po iniekcji siRNA. W niniejszym przykładzie znakowanie fluorescencyjne poszczególnych oocytów barwnikiem DAPI wraz z przeciwciałami anty-tubulinowymi i an...

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena formowania i organizacji wrzeciona podziałowego w cytes po wyciszeniu za pomocą irna kluczowych białek związanych z MTOC, takich jak perrin. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak mechanizmy regulujące segregację chromosomów oraz potencjalne zaburzenia prowadzące do aneuploidii w obrębie wszystkich miejsc. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wydajny knockdown transkryptu oraz specyficzną analizę immunofluorescencyjną poszczególnych cytes.Niniejszą procedurę można dostosować do badania niemal każdego białka docelowego. Na 48 godzin przed dniem zbioru potraktować samice myszy przeznaczonych do pobierania oocytów pięcioma jednostkami międzynarodowymi PMSG wstrzykniętymi domięśniowo. Po pobraniu jajników zgodnie ze standardowymi praktykami, przenieść je do naczynia z uprzednio ogrzanym, zrównoważonym medium MEM uzupełnionym o BSA i mil reone, a następnie przygotować się do izolacji oocytów pod mikroskopem stereologicznym. Uwolnić kompleksy oocyt-komórki cumulusa (COC), mocując jajnik do dna naczynia hodowlanego za pomocą igły o rozmiarze 27 G i używając drugiej igły do nakłucia pęcherzyków antralnych poprzez aspirację oocytów lub standardową technikę pipetowania ustnego.Należy zebrać oocyty otoczone dwiema lub większą liczbą warstw zwartych komórek cumulus. Przenieść te kompleksy oocyt-cumulus (COC) do nowej szalki z pożywką M-E-M-B-S-A mild reone i inkubować je przez godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie przystąpić do denudacji oocytów, stosując standardowe metody.Przygotować szalkę do iniekcji z trzema mililitrami pożywki M2 zawierającej jeden mikrogram na mililitr milone. Przygotować również szalki do przemywania i hodowli z MEM BSA milone. Następnie nabić pięć mikrolitrów 1 mM roztworu INA do igły iniekcyjnej i przygotować go do mikroiniekcji.Następnie nanieś kroplę 100 µL pożywki M2 na pokrywkę szalki o średnicy 3 cm. Umieść jeden oocyt w kropli i wykorzystaj go do ustawienia pozycji pipety holdingowej. Zabezpiecz oocyt, mocując go do pipety holdingowej za pomocą podciśnienia.Następnie dostosuj położenie igły iniekcyjnej do najszerszego średnicy oocytu. Po ustawieniu wstrzyknij około 10 picoliters roztworu do cytoplazmy oocytu, unikając jądra komórkowego. Nałóż pokrywkę z powrotem na stolik stereomikroskopu i dodaj 100 microliters świeżej pożywki M two.Przenieś około 10 oocytów do pożywki. Następnie, korzystając ze stanowiska do mikroiniekcji, przeprowadź procedurę mikroiniekcji. Unieruchom każdy oocyt za pomocą pipety holdingowej i powoli wprowadź igłę do iniekcji do cytoplazmy.Wstrzyknij roztwór S irna i ostrożnie wycofaj pipetę do iniekcji. Przenieś pomyślnie wstrzyknięte cyty na jeden koniec kropli, a cyty, w których iniekcja się nie powiodła, na przeciwny koniec kropli. Iniekcja 10 cytów powinna zająć tylko kilka minut, co jest kluczowe dla zachowania ich żywotności.Przenieś pokrywkę na stolik mikroskopu stereoskopowego i przenieś wszystkie pomyślnie wstrzyknięte komórki do naczynia z pożywką M-E-M-B-S-A Mel podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Przenieś komórki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z medyczną atmosferą gazową i inkubuj przez 24 godziny. Rozpocznij od uwolnienia komórek z bloku mil reone poprzez trzykrotne przemycie komórek w M-E-M-B-S-A.Następnie przenieś oocyty do pożywki dojrzewania zawierającej 10% FBS. Inkubuj komórki przez 17 godzin w temperaturze 37°C, aby mejoza mogła zostać wznowiona następnego dnia.Utrwal komórki. Za pomocą aspiracji komórek lub pipetowania ustnego szybko przenieś poszczególne grupy eksperymentalne do studzienek płytek czterostudzienkowych zawierających 750 µl uprzednio podgrzanego 4% PFA. Pozostaw komórki do inkubacji na kolejną godzinę.Każdą grupę przemyj trzykrotnie 750 µL ogrzanego PBS z 5% FBS. Każde przemywanie powinno trwać 15 minut w inkubatorze, a następnie zablokuj każdą grupę miejsc O w 5% FBS w BS. Blokowanie powinno trwać przez noc w temperaturze 4 °C przed barwieniem immunologicznym. Użyj rzędu ośmiu dołków na płytce wielodołkowej dla każdej eksperymentalnej grupy cytów.4 płytki 96-dołkowe przyjmują 200 µL roztworu na dołek. Proces barwienia należy rozpocząć od użycia świeżo przygotowanego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Następnie należy przykryć dołki param i inkubować cyty zgodnie ze specyfikacją przeciwciała po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego.Przemyj komórki trzykrotnie 5% FBS w PBS przez 10 do 15 minut podczas każdego płukania. Po trzech przemyciach przenieś komórki do dołka z roztworem przeciwciała wtórnego. Przykryj te dołki parafildem.Inkubować komórki przez godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przemyć trzykrotnie w ten sam sposób co wcześniej. Po przemyciu przenieść oocyty na czyste szkiełka przedmiotowe. Wszystkie oocyty z jednej grupy eksperymentalnej przenosi się na jedno szkiełko.Odssać nadmiar roztworu, aby unieruchomić komórki, a następnie natychmiast dodać osiem µL dappy zawierającego medium do montażu. Następnie ostrożnie przykryć je szkiełkiem podstawowym, unikając powstania pęcherzyków powietrza lub uszkodzenia cytów. Cyty zostały mikroiniekowane niespecyficzną kontrolą lub perrin irna; po 17 godzinach hodowli większość kontroli osiągnęła stadium metafazy II i zawierała zorganizowane wrzeciona mitotyczne z ustawionymi chromosomami. Labelowanie perrin, przedstawione na czerwono, było jasne i skupione w biegunach wrzeciona.Transkrypty zostały skutecznie wyciszone, ponieważ w komórkach wstrzykniętych z irna nie wykryto barwienia perrin. Większość tych oocytów pozostała w metafazie I i wykazywała zdezorganizowane struktury wrzeciona z nieprawidłowo ułożonymi chromosomami. Kilka z nich przeszło do metafazy II, lecz one również wykazywały zaburzenia wrzecion.W tym momencie powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak pobierać i mikroiniekować oocyty mysie swoistym siRNA, a następnie przeprowadzać ich immunubarwienie w celu analizy fluorescencyjnej formowania i organizacji wrzeciona. Ważne jest, aby pracować sprawnie i z dużą ostrożnością, aby zachować żywotność i jakość oocytów.

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Przedstawiamy zarys protokołu klinicznego do nieinwazyjnej oceny dojrzałości ludzkiego jaja za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego.

Ocena dojrzałości ludzkich komórek jajowych i jej zastosowanie kliniczne

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę wyciszania mRNA za pomocą siRNA do oceny wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Technika umożliwia badanie segregacji chromosomów i mechanizmów aneuploidii.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Przeglądaj więcej filmów