Mikroprzepływowy model biomimetycznie oddychających zrazikowych dróg oddechowych płuc
9 maja 2016
Miękka litografia została wykorzystana do stworzenia reprezentatywnego modelu pęcherzyków płucnych w prawdziwej skali, które okresowo rozszerzają się i kurczą, naśladując fizjologiczne ruchy oddechowe. Platforma ta odtwarza oddychające przepływy groniaste na chipie i oczekuje się, że ułatwi eksperymentalne badanie dynamiki wdychanego aerozolu i depozycji w ziarniasce płucnej.
Ogólnym celem tego systemu modelowego jest naśladowanie geometrii i ruchu oddechowego Acinusa Pulmonary w celu badania wzorców przepływu powietrza w Acinar i trajektorii mikrocząstek unoszących się w powietrzu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zjawisk transportu akunarnego. Takich jak wpływ grawitacji, leku i dyfuzji na wyniki osadzania cząstek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że eksperymenty są wykonywane w modelu w skali jeden do jednego, a nie w modelu skalowanym. Pozwala to na dokładną obserwację ruchu Browna cząstek. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii wziewnej, ponieważ można lepiej zrozumieć osadzanie się leków w aerozolu.
Na początek użyj głębokiego reaktywnego wytrawiania jonowego krzemu na płytce izolatora, aby wytworzyć główną płytkę krzemową, jak opisano wcześniej. Następnie wymieszaj PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym dziesięć do jednego w czystym małym pojemniku. Odgazować mieszaninę w eksykatorze w próżni do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
Umieść wafel wzorcowy na szalce Petriego i wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na wysokość około jednego milimetra powyżej płytki wzorcowej. Odgazuj wylany PDMS jeszcze raz przez co najmniej 40 minut, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte nad płytką, a pęcherzyki poniżej płytki zostaną zminimalizowane. Upewnij się, że wafel znajduje się jak najbliżej dna talerza.
W razie potrzeby delikatnie dociśnij wafel do dna za pomocą dwóch patyczków do mieszania i ponownie odgazuj. Następnie piecz PDMS w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut w naturalnym piecu konwekcyjnym. Podczas pieczenia PDMS spiłuj część lufy plastikowej dwumililitrowej strzykawki, używając drobnoziarnistego papieru ściernego, aby poprawić jego przyczepność do PDMS.
Ponadto użyj papieru ściernego, aby spłaszczyć podstawę cylindra strzykawki, umieszczając papier ścierny na płaskiej powierzchni i wsuwając na nią podstawę cylindra strzykawki. Usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze strzykawki za pomocą sprężonego powietrza. Następnie umieścić część cylindryczną strzykawki na wierzchu pierwszej warstwy PDMS tak, aby duży otwór był skierowany w stronę powierzchni PDMS.
Wylej drugą warstwę PDMS na pierwszą, na wysokość około pięciu milimetrów, upewniając się, że PDMS nie dostanie się do cylindra strzykawki. Następnie należy ponownie odgazować PDMS. Piecz cały zestaw w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny w naturalnym piecu konwekcyjnym, aby utwardzić PDMS.
Przeciąć foremkę PDMS wokół wzorzystego obszaru wafla głównego za pomocą skalpela. Podczas krojenia skalpel powinien słabo dotykać powierzchni wafla. Następnie delikatnie włóż cienkie narzędzie, takie jak kleszczyki do płytek, w nacięcie utworzone przez skalpel i oderwij odlew PDMS z płytki wzorcowej.
Umieść odlew na miękkiej powierzchni pokrytej folią aluminiową, tak aby wzorzysta strona była skierowana do góry i wybij otwór w PDMS na wlocie komory i wlocie kanału, używając jednomilimetrowego stempla do biopsji. Następnie dodaj część PDMS z utwardzaczem do czystego szkiełka i wiruj cienką warstwę z prędkością 3 000 obr./min przez 30 sekund. Następnie piecz szkiełko w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.
Wyczyść szkiełko i odlew PDMS za pomocą taśmy klejącej. Powierzchnie szkiełka z powlekanego szkła i formowanego PDMS należy traktować plazmą tlenową za pomocą obróbki koronowej. Należy pamiętać, że każda powierzchnia powinna być traktowana przez co najmniej jedną minutę.
Następnie delikatnie dociśnij powierzchnie do siebie i piecz je przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Wymieszaj zawieszone w wodzie fluorescencyjne cząstki polistyrenu z wodą i glicerolem w szklanym naczyniu, aby uzyskać stosunek objętości glicerolu do wody zawierający 0,25% wagowo od 64 do 36. Następnie umieść kroplę roztworu glicerolu na wlocie kanału i kroplę wody DI na wlocie do komory.
Następnie umieść aparat w eksykatorze i podciśnij powietrze przez około pięć minut. Przed zwolnieniem próżni poczekaj, aż bąbelki, które tworzą się w kroplach roztworu glicerolu i wody demineralizowanej, pękną. Po uwolnieniu próżni ciecze są wciągane do pustych przestrzeni wewnątrz urządzenia.
Jeśli resztki powietrza pozostaną w kanałach, wyeliminuj je, wywierając zewnętrzny nacisk na płyny za pomocą strzykawki i pozwalając powietrzu dyfundować do PDMS. Następnie wstrzyknij około dwóch milimetrów wody dejonizowanej do górnej komory, aż zostanie całkowicie wypełniona wodą. Następnie przykryj komorę końcówką strzykawki o rozmiarze 19.
Odetnij końcówkę kolejnej końcówki strzykawki o rozmiarze 19 i włóż tę końcówkę do wlotu komory bocznej. Podłącz obie końcówki strzykawki do strzykawki o pojemności jednego mililitra za pomocą cienkiej, teflonowej rurki i łącznika w kształcie litery T. Upewnij się, że strzykawka o pojemności jednego mililitra, rurka teflonowa, łącznik w kształcie litery T i górna komora są wypełnione wodą, bez żadnych pęcherzyków.
Następnie podłącz jednomililitrową strzykawkę do pompy strzykawkowej i zaprogramuj ją tak, aby naśladowała cichy cykl oddychania, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. W celu uzyskania obrazów symetrii mikrocząstek należy umieścić urządzenie na stoliku mikroskopu odwróconego. Następnie włącz dwuimpulsowy laser Nd:YAG i załaduj oprogramowanie do analizy obrazu na komputer.
Podczas uruchamiania urządzenia należy uzyskać serię dwuramkowych obrazów przepływu cząstek z blokadą fazową od dziewięciu do dwunastu faz, korzystając z systemu symetrii obrazu mikrocząstek zgodnie ze specyfikacjami producenta. Aby uzyskać obrazy dwuklatkowe z synchronizacją fazową, należy uzyskać serię podwójnych klatek z częstotliwością 10 herców. Następnie należy ponownie uporządkować dane w taki sposób, aby wszystkie pary w ramkach, które są oddzielone pełnym czasem cyklu, tworzyły nowy szereg czasowy.
Użyj algorytmu sumy korelacji, aby obliczyć mapę wektora prędkości sprzężenia fazowego, aby uzyskać wynikowe pole przepływu z serii obrazów. Powtórz ten proces kilka razy z różnymi czasami opóźnienia między pierwszą a drugą klatką każdej pary ramek, aby rozwiązać różne obszary przepływu wewnątrz jamy pęcherzyków płucnych. Następnie użyj programu do analizy danych, aby połączyć poszczególne mapy przepływu w kompletną i bardzo szczegółową mapę wzorców przepływu, uśredniając nakładające się punkty danych.
Krytyczną cechą przedstawionej tutaj mikroprzepływowej platformy groniastej jest jej zdolność do odtwarzania fizjologicznie realistycznych ruchów oddechowych, które powodują powstanie fizjologicznych profili przepływu i prędkości w przewodach groniastych i pęcherzykach płucnych. Profile prędkości przepływu na całej szerokości kanałów wskazują na stały spadek natężenia przepływu w kierunku głębszych generacji ziarniastych. Profile przepływu w pobliżu i w jamach pęcherzyków płucnych pokazują, że wielkości przepływu gwałtownie spadają wzdłuż otworu pęcherzyków płucnych.
Powoduje to prędkość przepływu o dwa do trzech rzędów wielkości wolniejszą wewnątrz pęcherzyków płucnych w porównaniu z kanałami. Ponadto wzorce przepływu zmieniają się znacznie wraz ze wzrostem wytwarzania ziarniaków. Podczas gdy generacja pierwsza charakteryzuje się strefą recyrkulacji, która w przybliżeniu pokrywa się ze środkiem pęcherzyków płucnych, generacja trzecia charakteryzuje się strefą recyrkulacji, która jest przesunięta w kierunku bliższej strony pęcherzyków płucnych z bardziej otwartym wzorem linii strumienia.
Wreszcie, w piątej generacji urządzeń obserwuje się promieniste linie strumieniowe bez strefy recyrkulacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą, która umożliwia wizualizację przepływu w geometriach ziarniastych, platforma może być używana do śledzenia pojedynczych cząstek unoszących się w powietrzu w celu zbadania dynamiki i położenia wdychanych cząstek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia model dróg oddechowych pęcherzykowych w skali rzeczywistej, zaprojektowany w celu odtworzenia fizjologicznego ruchu oddechowego. Model ten ułatwia badanie dynamiki i depozycji wdychanego aerozolu w obrębie acrynusa płucnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu oddechowego
- Dynamika aerozoli
- Terapia inhalacyjna
Wstęp
- Acini płucne mają kluczowe znaczenie dla wymiany gazowej i depozycji aerozolu.
- Zrozumienie wzorców przepływu powietrza i trajektorii cząstek jest niezbędne dla zdrowia układu oddechowego.
- Tradycyjne modele mogą nie oddawać dokładnie rzeczywistych warunków fizjologicznych.
- Miękka litografia pozwala na tworzenie precyzyjnych modeli w skali jeden do jednego.
Cel badania
- Aby naśladować geometrię i ruchy oddechowe graonki płucnej.
- Aby badać wzorce przepływu powietrza w graonkach oraz trajektorie przenoszonych powietrzem mikrocząsteczek.
- Aby zbadać wpływ grawitacji, leków i dyfuzji na wyniki depozycji cząsteczek.
Zastosowane metody
- Miękka litografia do wytwarzania modelu.
- Układ eksperymentalny do symulacji ruchu oddechowego.
- Obserwacja ruchu Browna cząsteczek w obrębie modelu.
- Analiza dynamiki depozycji aerozolowanego leku.
Główne wyniki
- Model pomyślnie naśladuje fizjologiczny ruchy oddechowe.
- Osiągnięto dokładną obserwację trajektorii cząstek.
- Uzyskano wiedzę na temat wpływu różnych czynników na depozycję cząstek.
- Wyniki mają znaczenie dla doskonalenia terapii inhalacyjnych.
Wnioski
- Ten model w rzeczywistej skali usprawnia zrozumienie dynamiki aerozoli w obrębie kątuplewnych płuc.
- Stanowi on wartościowe narzędzie dla przyszłych badań nad zdrowiem układu oddechowego.
- Technika ta może doprowadzić do postępów w strategiach terapii inhalacyjnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten mikrofluidyczny model umożliwia fizjologicznie istotną symulację przepływu powietrza i transportu cząstek w obrębie pęcherzyków płucnych, wypełniając krytyczną lukę w przedklinicznym rozwoju terapii inhalacyjnych. Poprzez odtworzenie rzeczywistej skali ruchów oddechowych oraz zjawisk przepływu w obrębie acinus, platforma ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki w formie aerozolu dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki depozycji w obszarach pęcherzykowych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, wiążąc właściwości formulacji z efektami płucnymi bez polegania na modelach ekstrapolowanych lub przeskalowanych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących transportu i depozycji aerozoli w drogach oddechowych obszaru pęcherzykowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oceny wpływu zmiennych formulacyjnych na trajektorie cząstek w regionach pęcherzykowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące przepływu i śledzenia cząstek, odpowiednie do standaryzacji testów w badaniach nad inhalacją.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalny screening formulacji aerozoli z wykorzystaniem mikrofluidycznej welocymetrii obrazowej cząstek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną poprzez modelowanie geometrii cewek oskrzelkowych oraz ruchów oddechowych istotnych dla organizmu człowieka.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju produktu w oparciu o ocenę ryzyka dzięki bezpośredniej wizualizacji wzorców depozycji cząsteczek w głębokich obszarach płuc.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając wglądu w mechanizmy zachowania aerozolu przed optymalizacją wiodących związków, co pozwala na projektowanie formulacji w oparciu o empiryczne dane dotyczące przepływu i depozycji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu czynników grawitacyjnych, dyfuzyjnych i formulacyjnych na depozycję cząstek w przewodach pęcherzykowych i pęcherzykach płucnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez powtarzalne generowanie fizjologicznie realistycznych profili przepływu w obrębie pięciu generacji pęcherzykowych.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze mapy wektorów prędkości oraz dane o trajektorii cząstek za pomocą μPIV do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie dynamiki płynów w pęcherzykach płucnych w skali ludzkiej, co jest istotne dla oceny terapii inhalacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modułowa możliwość iteracyjnego testowania formulacji dla wielu klas leków i urządzeń do podawania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w transporcie aerozoli poprzez dostarczenie bezpośrednich, obserwowalnych danych o przepływie i ruchu cząstek w biomimetycznych strukturach pęcherzykowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki produkcji w skali 1:1 oraz sterowaniu ściankami za pomocą ciśnienia, co naśladuje fizjologiczny oddech.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając wczesne przewidywanie regionalnej wydajności depozycji, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach rozwoju leków do podania drogą płucną.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów do podania inhalacyjnego z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane profile depozycji w obrębie pęcherzyków płucnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie miękkiej litografii, mikrofluidyki oraz welocymetrii obrazu cząstek (PIV) w celu montażu urządzenia i analizy przepływu.
- Zależne od dostępu do mikroskopów odwróconych, laserów impulsowych oraz systemów synchronizacji dla obrazowania μPIV z blokadą fazową.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy specjalistami od formulacji, bioinżynierami i specjalistami od obrazowania w celu zapewnienia spójności realizacji eksperymentów.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy rozszerzaniu modelu na typy cząstek inne niż fluorescencyjny polistyren, np. o różnej gęstości lub higroskopijności.
- Uwzględnia praktyczne ograniczenia związane z dostępnością optyczną dla głębokich obszarów pęcherzykowych oraz koniecznością stosowania cieczy dopasowujących współczynnik załamania w celu zminimalizowania zniekształceń optycznych.
