Name: Generowanie humanizowanej linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj generowanie humanizowanej linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na inhibitory kinezyny-5. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów korekcji błędów podczas podziału komórkowego z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Patricii Wadsworth za dar w postaci konstruktu kinesin-5. Praca ta była wspierana przez grant NIH (5 R01 GM107026) dla T.J.M. oraz przez grant badawczy nr 5-FY13-205 od Fundacji March of Dimes dla T.J.M., a także wsparcie od Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. do T.J.M.

1. Transfekcja komórek S2
<ol>
	<li>Z uprzednio wyhodowanej kolby o długości 25cm2 dodać komórki S2 wykazujące ekspresję GFP-α-tubuliny10 do końcowej objętości 2 ml przy 100% zbiegu i pozostawić je do częściowego przylegania do dna naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm przez około 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjmij nośnik z naczynia. Transfekcję 2 μg konstruktu Eg5-mCherry11 należy przeprowadzić za pomocą 1 ml pożywki Schneidera uzupełnionej 10% FBS (zwanej dalej pożywką Schneidera) i odczynnikiem do transfekcji, zgodnie z protokołem producenta. Uszczelnić naczynie preparatem Parafilm i inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 16-18 godzin.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki Schneidera. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 25 °C.</li>
	<li>W 3 dniu po transfekcji przenieść 500 μl transfekowanych komórek do nowego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającego 1,5 ml pożywki Schneidera w celu indukcji testowej. Wywołać ekspresję Eg5-mCherry poprzez dodanie CuSO4 do końcowego stężenia 500 μM. Zamknąć szalkę w Parafilm i inkubować w temperaturze 25 °C O/N.</li>
	<li>Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte konkanawaliną A, należy pobrać pipetą wystarczającą objętość roztworu konkanawaliny A (0,5 mg/ml rozpuszczonego wH2O), aby pokryć szkiełko nakrywkowe przemyte kwasem, usunąć nadmiar i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystym naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm, a następnie zasiać 500 μl przy 100% zbiegu indukowanych komórek na szkiełku nakrywkowym i pozostawić komórki do przylegania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby sprawdzić ekspresję Eg5-mCherry, złóż szkiełko nakrywkowe w komorze różanej (lub odpowiednim naczyniu do obrazowania) z pożywką do obrazowania w RT na mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj odpowiednich źródeł światła i zestawów filtrów, aby uwidocznić komórki. Na przykład mikroskop użyty w tym badaniu ma źródło białego światła LED oraz kostki filtrujące EGFP (FITC/Cy2) i DSRed (TRITC/Cy3). Eg5-mCherry lokalizuje się w mikrotubulach i jest wzbogacany w pobliżu biegunów wrzeciona.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że komórki wykazują ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i tubuliny GFP-α, przenieś pozostałą część transfekowanych, nieindukowanych komórek do kolby do hodowli tkankowej o długości 25cm2 zawierającej 4 ml pożywki Schneidera.</li>
	<li>Dodać Blasticydynę S HCL w końcowym stężeniu 25 μg/ml do kolby transfekowanych komórek i kontynuować rozszczepianie w obecności 25 μg/ml Blasticidin S HCl, aż do ustania śmierci komórki, upewniając się, że okresowo sprawdzasz ekspresję Eg5-mCherry. Inkubować linie komórkowe w inkubatorze w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Odsetek komórek wykazujących ekspresję Eg5-mCherry wzrasta z czasem.</li>
	<li>Gdy komórki zostaną stabilnie transfekowane, kontynuuj dzielenie pod nieobecność leku i zamroź12 komórek do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Interferencja RNA
<ol>
	<li>PCR amplifikuje region Klp61F o długości ~ 500 pz z cDNA (LD15641) za pomocą startera z dodaną sekwencją promotora T7 (sekwencja podana w wykazie materiałów), która ma być użyta jako matryca do syntezy dsRNA.
	<ol>
		<li>Przygotuj cztery reakcje PCR, każda po 50 μl, zawierające 100 ng matrycy DNA, 25 μM każdego startera, odpowiedni bufor i polimerazę. Ustaw protokół PCR na termocyklerze zgodnie z protokołem producenta polimerazy.</li>
		<li>Zebrać i oczyścić cztery reakcje PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z protokołem producenta. Przechowywać czysty szablon w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj dwuniciowy RNA (dsRNA) z matrycy za pomocą zestawu do transkrypcji RNA T7, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Spodziewaj się stężenia dsRNA ~5-15 mg/ml. Przechowywać dsRNA w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby zniszczyć Klp61F za pomocą dsRNA, pozwól komórkom S2 wyrażającym Eg5-mCherry przy 25% konfluencji częściowo przylegać do dna 35-milimetrowej płytki do hodowli tkankowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z szalek i dodać 5 μg dsRNA przeciwko Klp61F (Drosophila kinesin-5) rozcieńczonej w 1 ml pożywki Schneidera bez surowicy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie dodać 1 ml pożywki Schneidera z 10% FBS. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>24 godziny po traktowaniu dsRNA indukować ekspresję Eg5-mCherry poprzez dodanie CuSO4 do końcowego stężenia 500 μM. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez kolejne 24 godziny. </li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Wysiewaj 500 μl komórek, które zostały potraktowane dsRNA i indukowane O/N na szkiełku nakrywkowym pokrytym konkanawaliną A i pozwól im przylegać przez około 1 godzinę.</li>
	<li>Zmontuj szkiełko nakrywkowe w komorze różanej (lub odpowiednim naczyniu) w celu obrazowania.</li>
	<li>Znajdź komórki mitotyczne wykazujące ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i GFP-α-tubuliny. 
	UWAGA: Komórki mitotyczne eksprymujące tylko tubulinę GFP-α powinny mieć wrzeciona monopolarne, ponieważ Klp61F, który jest wymagany do dwubiegunowości wrzeciona, jest strącony10,13.</li>
	<li>Zbierz obrazy poklatkowe wrzecion dwubiegunowych (np. 1 klatka na minutę) w komórkach wyrażających zarówno Eg5-mCherry, jak i GFP-α-tubulinę.</li>
	<li>Podczas obrazowania wyjmij pożywkę z komory rozetowej i zastąp ją pożywką Schneidera zawierającą 1 μM STLC w ciągu 3 kolejnych wymian mediów (łącznie ~5 ml) do komory, aby uwidocznić zapadanie się wrzeciona.</li>
	<li>Aby wypłukać lek i odwrócić zapadanie się wrzeciona, ostrożnie wyjmij pożywkę zawierającą STLC z komory różowej i umyj w pożywce Schneidera 4x (łącznie 6-8 ml) przed ponownym napełnieniem komory różowej po raz ostatni świeżym podłożem. Kontynuuj obrazowanie.</li>
</ol>
4. Test korekcji błędów
<ol>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm pokryte konkanawaliną A w czystych szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Wysiewaj 500 μl komórek, które zostały potraktowane dsRNA Klp61F, na szkiełko nakrywkowe pokryte konkanawaliną A i pozwól im przylegać.</li>
	<li>Po przyklejeniu komórek dodaj 1,5 ml pożywki Schneidera do każdej pożywki, aby uzyskać ostateczną objętość do 2 ml.</li>
	<li>Aby zatrzymać komórki w mitozie, dodaj MG132 do końcowego stężenia 10 μM do każdej z szalek i inkubuj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 1 μM STLC i inkubować przez 1 godzinę, aby umożliwić powstanie monopoli.</li>
	<li>Umyj STLC, spłukując szkiełka nakrywkowe 3x za każdym razem 2 ml świeżej pożywki Schneidera.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka nakrywkowe z pożywką Schneidera jako dodatek do wszelkich leków farmakologicznych (np. inhibitorów kinazy Aurora) lub DMSO jako kontrolę. 
	Uwaga: Stężenia inhibitorów są różne, a właściwe stężenia końcowe muszą być określone przez eksperymentatora. Roztwory podstawowe są zwykle przygotowywane w taki sposób, że inhibitor jest rozcieńczany w stosunku 1:1000 do podłoża. W tym przypadku rozcieńczenie DMSO (lub odpowiedniego rozpuszczalnika) w stosunku 1:1 000 służy jako kontrola nośnika. Stosujemy inhibitor Aurora B binukleinę 2 w końcowym stężeniu 40 μM.</li>
	<li>Utrwal komórki w różnych punktach czasowych, aby obserwować postęp tworzenia wrzeciona dwubiegunowego i ocenić stany przyczepienia kinetochoru. Rozwiązanie problemu:
	<ol>
		<li>Szybko spłucz szkiełka nakrywkowe 2 ml 1x BRB-80.</li>
		<li>Napraw komórki, dodając 2 ml 10% paraformaldehydu rozcieńczonego w 1x BRB-80 przez 10 minut. Ostrożnie odpipetuj paraformaldehyd w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X przez 8 min.</li>
		<li>Szkiełka myjące 3x z 2 ml 1x PBS + 0,1% Triton-X.</li>
		<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe stroną komórkową do góry na arkusz Parafilmu (użyj markera, aby odpowiednio oznaczyć Parafilm, aby śledzić szkiełka) na szalce Petriego o średnicy 150 mm.</li>
		<li>Przykryj szkiełka nakrywkowe 150 μl gotowanej surowicy osła (BDS) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał. 
		Uwaga: W tym przypadku protokół fiksacji można zatrzymać, aby kontynuować go w późniejszym czasie. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C do 24 godzin. Aby wykonać komorę wilgotnościową, wyłóż brzeg naczynia o średnicy 150 mm wilgotną chusteczką laboratoryjną i przykryj pokrywką szalki Petriego.</li>
		<li>Usunąć blok i inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze 150 μl przeciwciał pierwszorzędowych odpowiednio rozcieńczonych w BDS w celu wybarwienia kinetochorów i mikrotubul do końcowych stężeń odpowiednio 2 μg/ml (lub zgodnie z zaleceniami producenta) i 1 μg/ml. 
		Uwaga: W tym przypadku protokół fiksacji można zatrzymać, aby kontynuować go w późniejszym czasie. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C do 24 godzin.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe umyć 3x 500 μl 1x PBS + 0,1% Triton-X.</li>
		<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem rozcieńczonymi w BDS.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe umyć 3x 500 μl 1x PBS + 0,1% Triton-X.</li>
		<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe ze 150 μl BDS o końcowym stężeniu 1 μg/ml DAPI przez 5 minut.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe należy umyć 2x za pomocą 1x PBS + 0,1% Triton-X i zamontować szkiełka nakrywkowe stroną do dołu na szkiełku 3x1" z 8 μl nośnika montażowego. Pomaluj rogi lakierem do paznokci, aby unieruchomić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki obrazu z dwubiegunowymi wrzecionami, które wyrażają Eg5-mCherry. Weź serię Z składającą się z 30 płaszczyzn w odstępach 0,2 μm we wszystkich kanałach za pomocą obiektywu 100X. Dokładnie przeanalizuj kinetochory i mikrotubule, aby określić stany przyłączenia (przyczepy dwukierunkowe lub synteliczne).</li>
</ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
<li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+a+new+kind+of+tension%3A+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li>
<li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li>
<li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li>
<li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors%3A+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li>
<li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2(2006).</li>
<li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis%3A+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li>
<li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187(2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wizualizacja korekcji błędów jest cenną techniką do badania etapów związanych z tym ważnym i złożonym procesem komórkowym. W tym celu za pomocą odwracalnych inhibitorów generowane są błędne przyłączenia, a po wypłukaniu leku obserwuje się korekcję błędów. Test ten został pierwotnie opracowany przy użyciu komórek hodowli tkankowych ssaków5. Jednak obecność dużej liczby kinetochorów w wielu modelowych typach komórek ssaków stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych zdarzeń korekcji błędów. Drosophila Komórki S2 posiadają zaledwie 4 pary kinetochorów, co czyni je bardziej preferowaną linią komórkową do obserwacji korekcji błędów. Jednak główną wadą jest to, że wiele inhibitorów jest nieskutecznych w komórkach Drosophila S2. Tak więc zdolność do generowania humanizowanej linii komórkowej Drosophila S2 eksprymującej ludzką kinezynę-5 stanowi cenne narzędzie do badania korekcji błędów.
Chociaż komórki Drosophila S2 mogą być lepszą linią komórkową do badania korekcji błędów, wiele etapów związanych z uzyskaniem linii komórkowej i zniszczeniem niezbędnych genów stanowi pewne wyzwanie dla tej techniki. Na przykład wydajność transfekcji może być dość niska. Jeśli mniej niż 20% komórek wykazuje ekspresję Eg5-mCherry, transfekcję należy powtórzyć, ponieważ proces selekcji potrwa dłużej. Również odsetek komórek wykazujących ekspresję obu białek fluorescencyjnych może z czasem ulec zmniejszeniu. Można to przezwyciężyć poprzez podział komórek w obecności blastycydyny S HCl i higromycyny B w celu wyselekcjonowania komórek wykazujących ekspresję odpowiednio Eg5-mCherry i GFP-α-tubuliny. Ważne jest również, aby pamiętać, że komórki Drosophila S2 mają ortologie do wielu ludzkich białek i; Dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie warunków knockdown dla białek endogennych. Optymalne warunki knockdown mogą różnić się ilością dsRNA i długością leczenia. Biorąc pod uwagę pojawienie się i szybki postęp technologii CRISPR-Cas915-17, generacja linii komórkowej Drosophila z genem Klp61F zastąpionym ludzkim Eg5 stanowi potężną alternatywę, która pokonałaby ograniczenia podejścia opartego na transfekcji i knockdown. Nasza praca pokazuje, że wymiana genów z muchy na człowieka powinna być w tym przypadku realną opcją, chociaż obecnie opracowywane są niezbędne odczynniki do tego w komórkach Drosophila S2.
Procedura ta nie ogranicza się do Eg5, ale może być stosowana do badania funkcji innych interesujących białek. W przypadku stosowania inhibitorów, które wcześniej okazały się nieskuteczne w komórkach Drosophila S2, protokół ten można zmodyfikować w celu zbadania bezpośredniego wpływu inhibitorów na żywe komórki bez obaw o efekty niepożądane. Linia komórkowa wytworzona przy użyciu tego protokołu może być również wykorzystana w wysokoprzepustowych analizach przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnych leków ukierunkowanych na białka zaangażowane w korekcję błędów.

Jednakowa segregacja genomu podczas podziału komórki wymaga prawidłowych interakcji między replikowanym DNA a mikrotubulami wrzeciona. Mikrotubule fizycznie oddziałują z chromosomami poprzez zestaw białek, który gromadzi się w centromerach znanych jako kinetochor1. Prawidłowa dystrybucja chromosomów wymaga, aby kinetochory siostrzane były dwukierunkowe, w których każda siostra jest związana z mikrotubulami pochodzącymi z przeciwległych biegunów wrzeciona. Przyczepy mikrotubul kinetochorowych (kt-MT), które nie są w konformacji dwukierunkowej, są szybko i skutecznie destabilizowane, aby zapewnić możliwość ustanowienia dwuorientacji w procesie znanym jako korekcja błędów. Test korekcji błędów, który został wcześniej opracowany w komórkachssaków5, wymaga montażu wrzecion monopolarnych przy użyciu odwracalnych inhibitorów małych cząsteczek przeciwko Eg5 (kinezynie-5). Leczenie farmakologiczne generuje wiele błędnych przyczepów syntelicznych, w których oba siostrzane kinetochory przyczepiają się do tego samego bieguna wrzeciona. Późniejsze wypłukanie leku pozwala na wizualizację procesu korekcji błędów. Test korekcji błędów można przeprowadzić w obecności inhibitorów małych cząsteczek lub knockdownów w celu zbadania udziału białek kandydujących w korygowaniu błędnych przyłączeń kt-MT.
Możliwość wizualizacji korekcji błędów w żywych komórkach jest potężnym narzędziem do dalszego zrozumienia mechanizmu molekularnego związanego z tym złożonym procesem. Jednak duża liczba chromosomów obecnych w większości linii komórkowych stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych przyłączeń kt-MT. Drosophila Komórki S2 byłyby idealne do zastosowania testu korekcji błędów, ponieważ zawierają zaledwie 4 chromosomy6, ale małocząsteczkowe inhibitory kinezyny 5, takie jak S-trytylo-L-cysteina (STLC) i monoastrol7-9, nie wpływają na montaż wrzeciona ani funkcję motoryczną kinezyny-5 w komórkach Drosophila. W związku z tym wygenerowaliśmy linię komórkową Drosophila S2 wykazującą ekspresję ludzkiej kinezyny-5 pod indukowalnym promotorem, który jest wrażliwy na inhibitory kinezyny-5. Protokół ten opisuje, w jaki sposób zniszczyć endogenny homolog kinezyny-5 Drosophila, Klp61F, i użyć tej linii komórkowej w teście korekcji błędów na bazie komórek.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik do transfekcji Effectine</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Nazwa genu LD15641</td></tr><tr><td>Schneider' s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Inaktywowana termicznie, pochodzący z USA</td></tr><tr><td>siarczan miedzi(II) (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp; mM kolba</td></tr><tr><td>S-trytyl-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp; Zapasy mM w DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp; mg / ml zapas w 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 System do produkcji RNA na dużą skalę</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Przybliżone stężenie dsRNA z każdej reakcji wynosi około 5-15&nbsp; &mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp; mg/ml roztwór sporządzony przez rozpuszczenie w 1x PBS.</td></tr><tr><td>Gotowana surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% roztwór podstawowy w 1x buforze PHEM, doprowadzić roztwór do wrzenia. Przechowywane w 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Nośniki montażowe</td><td></td><td></td><td>20&nbsp; mM Tris pH 8,0,0,&nbsp; 0,5% galusanu N-propylu, 90% glicerolu. Przechowywane w 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM RURY pH 6,9; 1&nbsp; mM EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Źródło światła białego</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filtr Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td>przeciwciało</tr><tr><td>anty-NDC80&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wykonane na zamówienie przez Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha; (anty-&alfa;-tubulina)</td><td>Przeciwciało anty-CID Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie "humanizowanej" linii komórkowej drosophila s2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores to duże struktury oparte na białkach, które gromadzą się na centromerach podczas podziału komórki i łączą chromosomy z mikrotubulami wrzecionowatymi. Prawidłowa dystrybucja materiału genetycznego wymaga, aby kinetochory siostrzane na każdym chromosomie stały się dwukierunkowe poprzez przyłączanie się do mikrotubul z przeciwległych biegunów wrzeciona przed przejściem do anafazy. Jednak błędne, niedwukierunkowe stany przyłączenia są powszechne i istnieją szlaki komórkowe, które zarówno wykrywają, jak i korygują takie przyłączenia podczas podziału komórki. Proces, w którym destabilizowane są nieprawidłowe interakcje kinetochor-mikrotubule, jest określany jako korekcja błędów. Aby zbadać korekcję błędów w żywych komórkach, nieprawidłowe mocowania są celowo generowane poprzez chemiczne hamowanie silnika kinezyny-5, co prowadzi do montażu wrzeciona monopolarnego, a przejście od złej orientacji do dwuorientacji obserwuje się po wypłukaniu leku. Duża liczba chromosomów w wielu modelowych typach komórek hodowli tkankowej stanowi wyzwanie w obserwacji poszczególnych zdarzeń korekcji błędów. Drosophila Komórki S2 są lepszymi obiektami do takich badań, ponieważ posiadają zaledwie 4 pary chromosomów. Jednak małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5 są nieskuteczne przeciwko Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Tutaj opisujemy, jak zbudować linię komórkową Drosophila, która skutecznie zastępuje Klp61F ludzką kinezyną-5, co sprawia, że komórki są wrażliwe na farmakologiczne hamowanie motoryczne i nadają się do zastosowania w teście korekcji błędów na bazie komórek.

Klp61F jest niezbędny do formowania dwubiegunowych wrzecion. Ludzka kinezyna-5, Eg5, może przywrócić funkcję Klp61F w komórkach Drosophila S2 (Rysunek 1A i D). Po dodaniu inhibitora kinezyny-5 (STLC) poziom motoru związanego z mikrotubulami spada (Rysunek 1B i E), a wrzeciono zapada się, co prowadzi do powstania monopola (Rysunek 1C i F) w komórkach pozbawionych endogennego Klp61F w wyniku skutecznego RNAi (Film uzupełniający 1). Warto zauważyć, że dwubiegunowe wrzeciona zapadają się po dodaniu STLC w zhumanizowanych komórkach S2, mimo że aktywność kinezyny-5 nie jest wymagana do utrzymania dwubiegunowości wrzeciona w komórkach ludzkich. Ta interesująca rozbieżność może wynikać z różnic w stopniu nakładania się mikrotubul interpolarnych i/lub ich stabilności w tych dwóch systemach modelowych14. Inhibicję kinezyny-5 (Rysunek 2A i E) można odwrócić poprzez wypłukanie leku, a następnie obserwować w czasie powrót do formy dwubiegunowego wrzeciona. Po usunięciu inhibitora (Rysunek 2B i F) białko Eg5-mCherry ponownie wiąże się z mikrotubulami w miarę montażu dwubiegunowego wrzeciona (Rysunek 2C i G), a komórki mogą przejść do dwubiegunowej anafazy (Rysunek 2D i H, Film uzupełniający 2).
<img alt="Mikroskopia time-lapse Eg5-mCherry i GFP-α-tubuliny, efekt STLC, 11 min, analiza oddziaływań białkowych." src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Dodanie 1 µM STLC prowadzi do powstania wrzecion monopolarnych w komórkach Drosophila S2. Reprezentatywne obrazy z obrazowania time-lapse komórki Drosophila S2 wykazującej ekspresję Eg5-mCherry (A-C) oraz GFP-α-tubuliny (D-F) podczas dodawania 1 µM STLC. Inhibitor Eg5 dodano w 3 min. Pasek skali = 5 µm. Znacznik czasu = min:sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa po wypłukaniu STLC pokazująca dynamikę Eg5-mCherry i GFP-α-tubuliny." src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ponowna formacja wrzeciona dwubiegunowego po usunięciu STLC. Reprezentatywne obrazy z obrazowania poklatkowego komórki Drosophila 2 wykazującej ekspresję Eg5-mCherry (A-D) oraz GFP-α-tubuliny (E-H) podczas eksperymentu z wypłukiwaniem STLC. STLC wypłukano w 5 min. Wrzeciono dwubiegunowe odtwarza się w ciągu 1 h od usunięcia STLC. Pasek skali = 5 µm. Znacznik czasu: min:sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek; lewo: stan początkowy; prawo: zwiększony kontrast, skala 5 µm." src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Movie 1"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov" target="_blank">Dodatkowy film 1. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a> Obrazowanie fluorescencyjne w szerokim polu widzenia reprezentatywnego przykładu komórki Drosophila S2 wykazującej ekspresję Eg5-mCherry (lewo) oraz GFP-α-tubuliny (prawo). W 2 min dodano 1 µM STLC, a wrzeciono utworzyło monopol w ciągu 10 min po dodaniu inhibitora. Obrazy były pozyskiwane co 1 min i odtwarzane z prędkością 10 klatek na sekundę. Pasek skali = 5 µm.
<img alt="Mikroskopia poklatkowa, analiza emisji w obrazowaniu komórkowym, skala 5μm, badanie fluorescencyjne." src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Movie 2"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Dodatkowy film 2. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a> Obrazowanie fluorescencyjne w szerokim polu widzenia reprezentatywnego przykładu komórki Drosophila S2 wykazującej ekspresję Eg5-mCherry (po lewej) i GFP-α-tubuliny (po prawej). Po 5 min usunięto podłoże zawierające 1 µM STLC i wypłukano komórki. Bipolarny wrzecion podziałowy odtwarza się w ciągu 1 hr od usunięcia inhibitora. Obrazy były pobierane co 1 min i odtwarzane z prędkością 10 klatek na sekundę. Pasek skali = 5 µm.

Ten protokół opisuje, jak wygenerować linię komórkową Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5. Przedstawiono również zastosowanie tych komórek w teście korekcji błędów opartym na komórkach.

Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest stworzenie linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na małocząsteczkowe inhibitory białka motorycznego Kinezyna-5, aby można było wykorzystać ją do badania korekcji błędów. Korekcja błędów podczas podziału komórki jest procesem, w którym błędne oddziaływania kinetochorów i mikrotubul ulegają destabilizacji, co daje komórce drugą szansę lub kolejną możliwość utworzenia prawidłowych połączeń, tak aby genom mógł zostać właściwie rozdzielony. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki dotyczące procesu korekcji błędów.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania linii komórkowej Drosophila S2, która posiada mniej chromosomów i wykazuje wrażliwość na inhibitor Kinezyny-5, co w obu przypadkach ułatwia wizualizację pojedynczych zdarzeń korekcji błędów. Rozpoczynając od uprzednio hodowanych, 100% konfluentnych komórek S2 wykazujących ekspresję GFP-Alpha Tubulin w kolbie kwadratowej o wymiarach 25 centymetrów, przenieść dwa mililitry hodowli do szalki o średnicy 35 milimetrów. Następnie inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę do momentu częściowej adhezji.Usunąć pożywkę z naczynia, a następnie dodać jeden mililitr pożywki Schneidera z dodatkiem FBS, dwa mikrogramy konstruktu Eg5-mCherry oraz odczynnik do transfekcji, aby przeprowadzić transfekcję komórek zgodnie z protokołem producenta. Uszczelnić naczynie za pomocą Parafilmu i inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 16 do 18 godzin. Następnie dodać jeden mililitr pożywki Schneidera i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.W trzeciej dobie po transfekcji przenieś 500 µL transfekowanych komórek do nowej 35 mm szalki hodowlanej zawierającej 1,5 mL pożywki Schneidera w celu przeprowadzenia indukcji testowej. Aby zindukować ekspresję Eg5-mCherry, dodaj siarczan miedzi do stężenia końcowego 500 µM. Uszczelnij szalkę Parafilmem i inkubuj w temperaturze 25 °C przez noc.Umieść wcześniej przygotowany szkiełko podstawowe o wymiarach 22 milimetrów na 22 milimetry powlekone konkanawaliną A w czystej naczyniu do hodowli tkanek o średnicy 35 milimetrów. Następnie nanieś 500 mikrolitrów w 100% konfluencyjnych komórek indukowanych na szkiełko i pozwól komórkom przywrzeć w temperaturze pokojowej. Aby sprawdzić ekspresję Eg5-mCherry, zamontuj szkiełko w komorze Rose z pożywką i wykonaj obrazowanie w temperaturze pokojowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole tekstowym.Po upewnieniu się, że komórki wykazują ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i GFP alpha tubulin, przenieś pozostałe przetransfekowane, nieindukowane komórki do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm², zawierającej 4 ml pożywki Schneidera. Do kolby dodaj Blasticidin S HCL do stężenia końcowego 25 µg/ml i kontynuuj pasażowanie komórek w obecności Blasticidin S HCL do momentu ustania śmierci komórek. Po przygotowaniu dwuniciowego RNA KLP61F zgodnie z protokołem tekstowym, wysiej komórki S2 wykazujące ekspresję Eg5-mCherry do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm przy 25% konfluencji i pozostaw je na jedną godzinę w celu adhezji.Usuń pożywkę z naczyń i dodaj jeden mililitr bezseremowej pożywki Schneidera do pięciu mikrogramów dwuniciowego RNA KLP61F. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę dodaj jeden mililitr pożywki Schneidera z 10% FBS. Inkubuj komórki w temperaturze 25 °C.24 godziny po traktowaniu dsRNA indukuj ekspresję Eg5-mCherry, dodając siarczan miedzi do końcowego stężenia 500 micromolar. Inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsius przez kolejne 24 godziny. Aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek, umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetr na 22 milimetr powlekane konkanawaliną A w czystej 35 milimetrowej płytce do hodowli tkanek.Wysiać 500 µL komórek traktowanych dsRNA, które były indukowane przez noc, na szkiełko nakrywką i pozwolić im przywrzeć przez około jedną godzinę. Po wykonaniu obrazowania time-lapse wrzecion bipolarnych zgodnie z protokołem tekstowym, usunąć medium z komory typu rose i dodać medium Schneidera zawierające 1 µM STLC, a następnie wymienić medium z STLC jeszcze dwa razy, wylewając medium po każdym płukaniu, aby zwizualizować zapadanie się wrzeciona. Aby wypłukać lek i odwrócić zapadanie się wrzeciona, ostrożnie usunąć medium zawierające STLC z komory typu rose i wylać je do pojemnika na odpady, a następnie użyć łącznie od 6 do 8 mm medium Schneidera do czterokrotnego przemycia komórek, wylewając medium po każdym płukaniu.Następnie, po dodaniu świeżej pożywki w celu ponownego napełnienia komory, kontynuuj obrazowanie. Aby uzyskać dostęp do pożywki w celu przepłukania komórek lekiem lub jego usunięcia, ostrożnie zdejmij górną szkiełko nakrywkę z komory rose, gdy ta jest zamocowana na mikroskopie. Alternatywnie, do obrazowania żywych komórek można zastosować szalkę Petriego z szklanym dnem, poddaną takiej samej obróbce z użyciem konkanawaliny A jak szkiełka nakrywki.Po wysianiu 500 µL komórek S2 traktowanych dsRNA KLP61F na szkiełko podstawowe z konkanawaliny A i odczekaniu do czasu ich przyczepienia, należy dodać 1,5 mL pożywki Schneidera, aby uzyskać końcową objętość 2 mL. Gdy komórki zostaną zatrzymane w fazie mitozy zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 1 µM STLC i inkubować przez jedną godzinę, aby umożliwić powstanie monopoli. STLC należy wypłukać, przemywając szkiełka podstawowe trzykrotnie przy użyciu 2 mL świeżej pożywki Schneidera.Aby utrwalić komórki w różnych punktach czasowych formowania dwubiegunowego wrzeciona oraz ocenić miejsca przyczepienia kinetochorów, należy rozpocząć od szybkiego wypłukania szkiełek nakrywkowych przy użyciu 2 ml 1X BRB80. W dygestorium dodać 2 ml 10% PFA w 1X BRB80 i inkubować przez 10 minut. Następnie, aby przeprowadzić permeabilizację komórek, dodać 1% Triton X w 1X PBS i inkubować przez 10 minut.Następnie należy użyć dwóch mililitrów 0,1% Triton X w 1X PBS, aby przemyć komórki trzykrotnie. Dalej, przenieść szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do góry na arkusz Parafilmu w 150 milimetrowej płytce Petriego. Dodać 150 mikrolitrów gotowanego serum oslego (BDS) na szkiełka nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał.Po inkubacji wyjmij blok i dodaj 150 µL przeciwciał pierwszorzędowych, przygotowanych zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po trzykrotnym przemyciu szkiełek cover slip dodaj przeciwciała wtórnicze sprzężone z Fluoro-4, rozcieńczone w BDS, i inkubuj w temperaturze pokojowej od 30 do 60 minut. Po ponownym trzykrotnym przemyciu szkiełek, inkubuj je przez pięć minut w 150 µL BDS zawierającego 1 µg/mL DAPI.Następnie, po dwukrotnym wypłukaniu szkiełek cover-slip, należy użyć 8 µL medium montażowego, aby zamontować próbkę stroną komórkową do dołu na szkiełku o wymiarach 3x1 cal. Narożniki należy zabezpieczyć lakierem do paznokci. Na koniec, używając obiektywu 100X, należy wykonać obrazowanie komórek z dwubiegunowymi wrzecionami wykazującymi ekspresję Eg5-mCherry.Wykonaj serię Z, składającą się z 30 płaszczyzn w odstępach 0,2 µm we wszystkich kanałach. Dokładnie przeanalizuj kinetorchory i mikrotubule, aby określić stan przyłączenia. KLP61F jest niezbędny do tworzenia wrzecion bipolarnych w komórkach Drosophila S2; jednak małocząsteczkowe inhibitory Kinezyny-5 są wobec niego nieskuteczne.Obrazy te pokazują, że ludzka kinesyna-5 Eg5 może przywrócić funkcję KLP61F w komórkach Drosophila S2. Po dodaniu inhibitora kinesyny-5, STLC, poziom motoru związanego z mikrotubulami spada, a wrzeciono zapada się, co prowadzi do powstania monopola w komórkach pozbawionych endogennej KLP61F w wyniku skutecznego RNAi. Rysunek ten demonstruje, że inhibicję kinesyny-5 można odwrócić poprzez wypłukanie leku, a powrót do dwubiegunowego wrzecionia można śledzić w czasie. Po usunięciu inhibitora Eg5-mCherry ponownie wiąże się z mikrotubulami, a komórki mogą przejść do dwubiegunowej anafazy.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć linię komórkową Drosophila S2 wrażliwą na małocząsteczkowy inhibitor Kinezyny-5. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w około sześć godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest wcześniejsze zaplanowanie prac, ponieważ metoda ta wymaga przygotowań z kilkudniowym wyprzedzeniem.Należy pamiętać, że praca z inhibitorami małocząsteczkowymi może być niebezpieczna, dlatego zawsze należy używać rękawiczek. Stworzenie humanizowanych komórek muszki owocówki może zostać udowodnione poprzez zastosowanie technologii Crispr-Cas 9 oraz zastąpienie kinesyny-5 Drosophila jej ludzkim odpowiednikiem. Opracowanie humanizowanych komórek Drosophila powinno w przyszłości poszerzyć naszą wiedzę na temat korekcji błędów i innych istotnych procesów komórkowych.

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila Schneider (S2) są coraz popularniejszym systemem służącym do odkrywania i analizy funkcjonalnej genów. Naszym celem jest opisanie niektórych technik mikroskopowych, które sprawiają, że komórki S2 stają się tak istotnym systemem eksperymentalnym.

Przygotowanie komórek S2 Drosophila do mikroskopii świetlnej

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Analiza klonów mozaiki w nabłonku dysku imaginalnego Drosophila to potężny system modelowy do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji guzów w dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS i wprowadzamy metodę diagnozy w celu klasyfikacji fenotypów guza.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj generowanie humanizowanej linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na inhibitory kinezyny-5. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów korekcji błędów podczas podziału komórkowego z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek.

Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Przeglądaj więcej filmów