Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie linii komórkowej Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowe inhibitory silnika Kinesin-5, dzięki czemu można je wykorzystać do badania korekcji błędów. Korekcja błędów podczas podziału komórki to proces, w którym błędne interakcje kinetochoru i mikrotubul są destabilizowane, aby dać komórce drugą szansę lub inną szansę na utworzenie odpowiednich przyczepów, dzięki czemu genom może być prawidłowo posegregowany. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, związane z procesem korekcji błędów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wykorzystać linię komórkową Drosophila S2, która ma mniej chromosomów i jest wrażliwa na inhibitor Kinesin-5, co ułatwia wizualizację poszczególnych zdarzeń korekcji błędów. Zaczynając od wcześniej wyhodowanej 25-centymetrowej kolby kwadratowej ze 100% zlewającą się tubuliną GFP-Alpha wyrażającą komórki S2, przenieś dwa mililitry kultury do 35-milimetrowej naczynia. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez około godzinę, aby częściowo przylegały.

Wyjmij pożywkę z naczynia i dodaj jeden mililitr pożywki Schneidera, uzupełnionej FBS, do dwóch mikrogramów konstruktu Eg5-mCherry i odczynnika do transfekcji w celu transfekcji komórek zgodnie z protokołem producenta. Użyj Parafilm, aby uszczelnić naczynie i inkubować komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki Schneidera i włóż komórki z powrotem do inkubatora.

W trzecim dniu po transfekcji przenieś 500 mikrolitrów transfekowanych komórek do nowego 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 1,5 mililitra pożywki Schneidera w celu indukcji testowej. Aby wywołać ekspresję Eg5-mCherry, dodaj siarczan miedzi do końcowego stężenia 500 mikromolów. Zamknij naczynie w Parafilm i inkubuj przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Umieść wcześniej przygotowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry Concanavalin A w czystym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 milimetrów. Następnie wysiewaj 500 mikrolitrów 100% zlewających się indukowanych komórek na szkiełku nakrywkowym i pozwól komórkom przylegać w temperaturze pokojowej. Aby sprawdzić ekspresję Eg5-mCherry, złóż szkiełko nakrywkowe w komorze różanej z podłożem i obrazem w temperaturze pokojowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole tekstowym.

Po upewnieniu się, że komórki wykazują ekspresję zarówno Eg5-mCherry, jak i tubuliny alfa GFP, przenieś pozostałą część transfekowanych, nieindukowanych komórek do kolby do hodowli tkankowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej cztery mililitry pożywki Schneidera. Dodać do kolby Blasticidin S HCL w końcowym stężeniu 25 mikrogramów na mililitr i kontynuować dzielenie komórek w obecności Blasticidin S HCL aż do ustania śmierci komórki. Po przygotowaniu dwuniciowego RNA KLP61F zgodnie z protokołem tekstowym, wysiewaj komórki S2 eksprymujące Eg5-mCherry do 35-milimetrowej naczyni hodowlanej przy 25% zbiegu i pozwól im przylegać przez godzinę.

Usuń pożywkę z naczyń i dodaj jeden mililitr pożywki Schneidera bez surowicy do pięciu mikrogramów dwuniciowego RNA KLP61F. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę dodaj jeden mililitr pożywki Schneidera z 10% FBS. Inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

24 godziny po leczeniu dsRNA indukować ekspresję Eg5-mCherry poprzez dodanie siarczanu miedzi do końcowego stężenia 500 mikromolowców. Inkubuj komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dodatkowe 24 godziny. Aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek, umieść szkiełko nakrywkowe Concanavalin A o wymiarach 22 milimetry na 22 milimetry w czystym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 milimetrów.

Wysiew 500 mikrolitrów komórek poddanych działaniu dsRNA, które zostały wywołane przez noc, na szkiełku nakrywkowym i pozwól im przylegać przez około godzinę. Po zebraniu obrazów poklatkowych wrzecion bipolarnych zgodnie z protokołem tekstowym, wyjmij pożywkę z komory różowej i dodaj pożywkę Schneidera zawierającą jeden mikromolowy STLC i zastąp pożywkę STLC jeszcze dwa razy, odrzucając pożywkę po każdym myciu, aby uwidocznić zapadanie się wrzeciona. Aby wypłukać lek i odwrócić zapadanie się wrzeciona, ostrożnie wyjmij pożywkę zawierającą STLC z komory różowej i wyrzuć ją do pojemnika na odpady, a następnie użyj łącznie 6 do 8 milimetrów pożywki Schneidera do czterokrotnego przemycia komórek, wyrzucając pożywkę po każdym myciu.

Następnie, po dodaniu świeżej pożywki w celu ponownego napełnienia komory, kontynuuj obrazowanie. Aby uzyskać dostęp do podłoża do mycia i wymywania leków, ostrożnie wyjmij górną szkiełko pokrywy z komory różanej, gdy jest zabezpieczone na mikroskopie. Alternatywnie, do obrazowania żywych komórek można użyć płytki Petriego ze szklanym dnem potraktowanej konkanawaliną A, podobnie jak szkiełka nakrywkowe.

Po wysianiu 500 mikrolitrów komórek S2 potraktowanych dsRNA KLP61F na szkiełku nakrywkowym Concanavalin A i pozostawieniu komórek do przylegania, dodaj 1,5 mililitra pożywki Schneidera, aby uzyskać ostateczną objętość do dwóch mililitrów. Gdy komórki zostaną zatrzymane w mitozie zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj jeden mikromolowy STLC i inkubuj przez godzinę, aby umożliwić utworzenie monopoli. Umyj STLC za pomocą dwóch mililitrów świeżego podłoża Schneidera, aby trzykrotnie spłukać szkiełka nakrywkowe.

Aby zamocować komórki w różnych punktach czasowych tworzenia wrzeciona dwubiegunowego i ocenić miejsca przyczepienia kinetochoru, zacznij od użycia dwóch mililitrów 1X BRB80 do szybkiego wypłukania szkiełek nakrywkowych. W kapturze chemicznym dodaj dwa mililitry 10% PFA w 1X BRB80 i inkubuj przez 10 minut. Następnie, aby przepuszczalność komórek, dodaj 1%Triton X do 1X PBS i inkubuj przez 10 minut.

Następnie użyj dwóch mililitrów 0,1% Triton X w 1X PBS, aby trzykrotnie umyć komórki. Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe, stroną z komórką skierowaną do góry, na arkusz Parafilmu na 150-milimetrowej szalce Petriego. Dodaj 150 mikrolitrów gotowanej surowicy osła lub BDS do szkiełek nakrywkowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.

Po inkubacji usunąć blok i dodać 150 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych przygotowanych zgodnie z protokołem tekstowym przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych dodać sprzężone z fluoro-4 przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w BDS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut. Po trzykrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych inkubuj je ze 150 mikrolitrami BDS, zawierającymi jeden mikrogram na mililitr DAPI przez pięć minut.

Następnie, po dwukrotnym umyciu szkiełek nakrywkowych, użyj ośmiu mikrolitrów podłoża montażowego, aby zamontować próbkę stroną z komórką do dołu, na szkiełku o wymiarach trzy na jeden cal. Użyj lakieru do paznokci, aby pomalować rogi. Na koniec użyj obiektywu 100X, aby zobrazować komórki z dwubiegunowymi wrzecionami wyrażającymi Eg5-mCherry.

Weźmy serię Z, składającą się z 30 płaszczyzn w odstępach 0,2 mikrometra we wszystkich kanałach. Dokładnie przeanalizuj kinetochor i mikrotubule, aby określić stan przyłączenia. KLP61F jest wymagany do tworzenia dwubiegunowych wrzecion w komórkach Drosophila S2; jednak małocząsteczkowe inhibitory Kinesin-5 są nieskuteczne przeciwko niemu.

Obrazy te pokazują, że ludzka Kinezyna-5 Eg5 może uratować funkcję KLP61F w komórkach Drosophila S2. Po dodaniu inhibitora Kinesin-5, STLC, poziom silnika związany z mikrotubulami spada, a wrzeciono zapada się, co powoduje monopol w komórkach pozbawionych endogennego KLP61F w wyniku udanego RNA I. Liczba ta pokazuje, że hamowanie Kinesin-5 można odwrócić poprzez wypłukanie leku, a powrót do zdrowia wrzeciona dwubiegunowego można śledzić w czasie. Po usunięciu inhibitora Eg5-mCherry ponownie wiąże się z mikrotubulami, a komórki mogą przejść w dwubiegunową anafazę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować linię komórkową Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowy inhibitor Kinesin-5. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby planować z wyprzedzeniem, ponieważ ta metoda wymaga przygotowania z kilkudniowym wyprzedzeniem.

Nie zapominaj, że praca z inhibitorami małocząsteczkowymi może być niebezpieczna, więc zawsze noś rękawice. Budowanie humanizowanych komórek muszek owocowych można udowodnić poprzez zastosowanie technologii Crispr-Cas 9 i zastąpienie Drosophila Kinesin-5 jego ludzkim odpowiednikiem. Rozwój humanizowanych komórek Drosophila powinien pogłębić naszą wiedzę na temat korekcji błędów i innych istotnych procesów komórkowych w przyszłości.