In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca
16 lutego 2016
Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania szybkim mikro-tomografii komputerowej w obrazowaniu z wbudowaną synchronizacją kardiopulmonarną w celu oceny globalnych i regionalnych funkcji mięśnia sercowego w modelu niedokrwienia serca u myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patofizjologii serca, takie jak: jaki jest wpływ patologii lub błędnych metod leczenia na globalną i regionalną funkcję mięśnia sercowego? Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie szybkiej, podłużnej i nieinwazyjnej oceny najważniejszych parametrów kardiologicznych, którą można z łatwością przeprowadzić bez specjalistycznej wiedzy.
Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię chorób układu sercowo-naczyniowego. Może ona służyć jako narzędzie przedkliniczne do uzyskania zaawansowanego wglądu w rozwój chorób serca. Procedurę zaprezentują Nicole van Vliet, technik, Elza van Deel, pracownik postdoktorski oraz Yanto Ridwan, kolejny technik z naszego laboratorium.
Zacznij od wykonania niewielkiego nacięcia skóry 12-tygodniowej myszy pomiędzy drugą a trzecią żebrem. Następnie, używając małych haczyków, odsunij mięśnie klatki piersiowej, aby odsłonić mięśnie międzyżebrowe. W kolejnym kroku, używając zakrzywionych nożyczek sprężynowych z 2 mm ostrzem, ostrożnie przetnij trzeci mięsień międzyżebrowy, uważając, aby nie uszkodzić płuc.
Następnie za pomocą pęsety przerwij osłonę oserca i użyj kawałka mokrej gazy, aby odsunąć płuca. Przestaw haczyki do wnętrza klatki piersiowej tak, aby widoczna była duża część wolnej ściany lewej komory oraz część lewego przedsionka. Następnie, wykorzystując przedsionek do zlokalizowania lewej tętnicy wieńcowej, wprowadź jedwabną nici chirurgiczną o grubości 7/0 pod lewą tętnicę wieńcową i zawiąż szew 2 mm poniżej brzegu lewego przedsionka, aby ustandaryzować wielkość zawału.
Po wizualnym potwierdzeniu sukcesu indukcji zawału poprzez zblednięcie wolnej ściany lewej komory, ostrożnie ponownie napompuj płuco i szczelnie zamknij klatkę piersiową za pomocą jedwabnej nici chirurgicznej 6/0. Oczyść ranę solą fizjologiczną i użyj kolejnych szwów jedwabnych do zamknięcia skóry, a następnie zastosuj spray do ran w celu stymulacji gojenia i zapobiegania infekcji. Następnie umieść mysz w klatce na macie grzewczej, aż do pełnego powrotu do zdrowia.
Od trzech do czterech godzin po operacji włącz skaner microCT, uruchom oprogramowanie sterujące microCT i rozgrzej lampę rentgenowską. Następnie zdezynfekuj gumowy korek fiolki z jodowym środkiem kontrastowym 70% alkoholem i za pomocą strzykawki o małej objętości martwej pobierz od 5 do 10 µL środka na gram masy ciała zwierzęcia. Po usunięciu pęcherzyków powietrza przemyj ogon znieczulonej myszy 70% alkoholem i rozszerz żyły ogonowe poprzez ogrzanie.
Wstrzyknij środek kontrastowy do bocznej żyły ogonowej. Gdy w oprogramowaniu sterującym pojawi się przycisk trybu na żywo, lampa rentgenowska jest gotowa. Włóż osłonę o małym otworze oraz podest dla małych zwierząt.
Kliknij przycisk nowej bazy danych w oknie bazy danych i wprowadź nazwę dla nowej bazy danych. Po pojawieniu się okna dialogowego kliknij przycisk przeglądaj i przejdź do dysku, na którym zostanie zapisana baza danych. Następnie kliknij OK i sprawdź nową bazę danych w oknie bazy danych.
Aby ustawić warunki skanowania, wybierz odpowiednie parametry. Następnie umieść wstrzykniętą, znieczuloną mysz na stole dla zwierząt w skanerze i przesuń drzwi urządzenia w prawo, aby aktywować blokadę bezpieczeństwa. Kliknij przycisk trybu na żywo, aby zobaczyć obiekt w czasie rzeczywistym oraz obserwować okno przechwytywania X i zwierzę.
Naciskając przyciski przesuwania w przód i w tył sterownika osi Z stolika, przesuń pomost dla zwierzęcia, aż klatka piersiowa myszy znajdzie się w polu widzenia. Następnie użyj strzałek lewo i prawo sterownika pomostu, aby ustawić zwierzę wewnątrz niebieskiej ramki ograniczającej. Wybierz wartość 90 z listy rozwijanej sterownika rotacji w oknie oprogramowania sterującego i kliknij przycisk set, aby obrócić gantri, upewniając się, że zwierzę pozostaje wewnątrz niebieskiej ramki ograniczającej okna akwizycji X.
W oknie przechwytywania X kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zmienić rozmiar obszaru zainteresowania układu krążenia i oddechowego. Przeciągaj krawędzie tak, aby ślady krążeniowo-oddechowe były wyraźnie widoczne w widoku synchronizacji. Naciśnij przycisk pozycji domyślnej i zmień rozmiar obszaru zainteresowania dla układu krążenia i oddechowego.
Upewnij się, że obszar zainteresowania obejmuje przeponę oraz część szczytową serca we wszystkich pozycjach gantry. Następnie obróć gantry o 90 stopni, aby upewnić się, że zapisy krążeniowo-oddechowe są nadal wyraźnie widoczne. Gdy zwierzę znajdzie się w odpowiedniej pozycji, kliknij przycisk CT scan, aby rozpocząć akwizycję.
Pojawi się komunikat potwierdzający skanowanie TK. Kliknij tak. Czerwony wskaźnik energii promieni rentgenowskich włączy urządzenie i rozpocznie się skanowanie.
Po zakończeniu skanowania obejrzyj rekonstrukcje w przekrojach transaksjalnym, czołowym i strzałkowym w oprogramowaniu do wizualizacji 2D. Następnie wyjmij zwierzę ze skanera i monitoruj je aż do pełnego wybudzenia. Poniżej przedstawiono reprezentatywne przekroje poprzeczne w krótkiej osi serca myszy z zawałem mięśnia sercowego w fazie końca rozkurczu i końca skurczu, z uwidocznioną pulą krwi.
Na tych obrazach krótkie osiowe przekroje końcowoskurczowe i końcoworozkurczowe serca myszy bez zawału mięśnia sercowego wykazują doskonałe obrysowanie jamy lewej komory przy niewielkim szumie tła. Zwróć uwagę, jak obszary rzednięcia kontrastu, odpowiadające zawałowi mięśnia sercowego, zostały wyraźnie zaznaczone na obrazach krótkich osiowych serca myszy poddanej ligacji lewej przedniej tętnicy wieńcowej. Nie zaobserwowano tego u zwierzęcia w grupie kontrolnej (sham).
Zgodnie z 17-segmentowym modelem American Heart Association, lewą komorę można podzielić na podstawową, środkową i wierzchołkową część w przekroju krótkiej osi. Na tych reprezentatywnych, obwodowych wykresach polarnych wyraźnie widoczna jest odmienna perfuzja w segmentach: środkowym przednim, środkowym dolno-bocznym, środkowym przednio-bocznym, wierzchołkowym przednim oraz wierzchołkowym bocznym u myszy z zawałem mięśnia sercowego w porównaniu z zwierzęciem poddanym operacji pozornej. Po opanowaniu techniki, indukcja zawału mięśnia sercowego może zostać przeprowadzona w 45 minut, natomiast późniejsze obrazowanie microCT wymaga czterech godzin.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że sprawność czynnościowa serca zależy od rodzaju i stopnia znieczulenia. Z tego względu, w celu uzyskania dokładnych pomiarów, podczas akwizycji obrazów należy utrzymywać częstotliwość akcji serca na poziomie jak najbardziej fizjologicznym. Po opracowaniu, technika ta otworzyła badaczom z dziedziny farmakologii drogę do eksploracji strategii interwencyjnych u myszy oraz analizy wpływu strategii leczenia na progresję choroby.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat operacji zawału mięśnia sercowego oraz wiedzieć, jak korzystać z szybkim systemem mikroCT w połączeniu z jodowym środkiem kontrastowym do puli krwi. Należy pamiętać, że praca z izofluranem może być niebezpieczna i podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak zapewnienie dobrej wentylacji.
Przegląd
Niniejsza metoda opisuje zastosowanie kwantowej mikrotomografii komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca z użyciem jodowanego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta umożliwia szybką, podłużną i nieinwazyjną ocenę krytycznych parametrów kardiologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kardiologia
- Techniki obrazowania
- Badania przedkliniczne
Wstęp
- niedokrwienie mięśnia sercowego stanowi istotny model badania chorób serca.
- Nieinwazyjne techniki obrazowania są niezbędne do prowadzenia badań podłużnych.
- Mikro-TK pozwala na szczegółową ocenę funkcji i struktury serca.
- Zrozumienie patofizjologii serca jest kluczowe dla opracowywania terapii.
Cel badania
- W celu zademonstrowania zastosowania mikro-tomografii komputerowej (MicroCT) w ocenie funkcji mięśnia sercowego.
- W celu oceny wpływu zastosowanych terapii na patologię serca.
- W celu uzyskania wglądu w mechanizmy rozwoju chorób serca.
Zastosowane metody
- Indukcja zawału mięśnia sercowego u myszy za pomocą technik chirurgicznych.
- Podanie jodowego środka kontrastowego do obrazowania.
- Wykorzystanie MicroCT do rejestracji obrazów serca.
- Analiza morfologii i funkcji serca za pomocą oprogramowania do obrazowania.
Główne wyniki
- Pomyślną indukcję zawału mięśnia sercowego potwierdzono wizualnie.
- MikroTK zapewniło wyraźne wyznaczenie jam lewej komory.
- Obszary rzednięcia kontrastu odpowiadające zawałowi były dobrze odgraniczone.
- Różnice w perfuzji zaobserwowano pomiędzy sercami z zawałem a sercami z grupy operacji pozornej.
Wnioski
- Mikro-TK jest cennym narzędziem do nieinwazyjnego obrazowania serca.
- Technika ta może pogłębić zrozumienie chorób serca.
- Umożliwia ona szybką ocenę funkcji serca w modelach przedklinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ta metoda umożliwia szybką, podłużną i nieinwazyjną ocenę struktury i funkcji serca w modelach przedklinicznych, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków kardio-naczyniowych. Dzięki dostarczaniu ilościowych danych anatomicznych i funkcjonalnych w 3D zwiększa ona pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków oraz w decyzjach dotyczących etapów przedklinicznych. Technika ta zmniejsza zależność od punktów końcowych wymagających uboju zwierząt i wspiera skalowalne, powtarzalne przepływy pracy dla międzyfunkcyjnych zespołów badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościową ocenę globalnej i regionalnej funkcji mięśnia sercowego w modelach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki zapewnieniu podłużnego, nieinwazyjnego monitorowania progresji patologii serca.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie powtarzalnych odczytów perfuzji i żywotności, które korelują z skutecznością terapeutyczną.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszej oceny związków poprzez ustalenie bazowej funkcji serca i powtarzalności zawału.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza zestandaryzowane, wysokorozdzielcze pomiary 3D objętości komór, ruchu ścian oraz defektów perfuzji w celu standaryzacji analizy.
- Skalowalność przesiewowa: Umożliwia niezawodną ocenę związków dzięki zautomatyzowanemu pozyskiwaniu i analizie obrazów, kompatybilnym z przepływami pracy o wysokiej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje zawał mięśnia sercowego u ludzi poprzez trwałe zamknięcie LAD, zapewniając ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na wczesne poznanie efektów leczenia w zakresie metabolizmu i żywotności serca, co zmniejsza odsetek niepowodzeń biologicznych w późnych etapach badań.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez powiązanie punktów końcowych obrazowania funkcjonalnego z istotnością patofizjologiczną w modelach chorób układu sercowo-naczyniowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, umożliwiając iteracyjną ocenę sygnałów dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności kardiologicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację regionalnej dysfunkcji mięśnia sercowego w modelach niedokrwiennych.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analiz poprzez powtarzalne obrazowanie z kontrastem i standaryzowane protokoły indukcji zawału.
- Analityka: Dostarcza ilościowe zmienne zależne, w tym frakcję wyrzutową, grubość ścian oraz wielkość defektu perfuzji, do porównań między grupami.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez podłużne monitorowanie zmian metabolicznych i żywotności po interwencji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania w wielu wskazaniach sercowo-naczyniowych i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w patofizjologii serca.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zautomatyzowanemu wycinaniu populacji (gatingowi) oraz ustandaryzowanym protokołom dawkowania kontrastu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrywanie związków kardiotoksycznych lub nieefektywnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez obiektywne, ilościowe punkty końcowe, które stanowią podstawę decyzji o dalszym rozwoju.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w chirurgii małych zwierząt, prowadzeniu znieczulenia oraz obsłudze mikrotomografii komputerowej (microCT).
- Zależność od szybkich systemów microCT z synchronizacją z cyklem pracy serca i oddechem (cardio-respiratory gating) oraz kompatybilnością z jodowymi środkami kontrastowymi.
- Konieczność standaryzacji protokołów indukcji zawału, podawania kontrastu i analizy obrazu pomiędzy zespołami badawczymi.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie parametrów do konkretnego modelu w zakresie tętna, częstości oddechów i kinetyki kontrastu dla różnych gatunków.
- Ograniczenia praktyczne obejmują limity dawki promieniowania w badaniach podłużnych oraz potrzebę stosowania specjalistycznych środków kontrastowych, takich jak eXIA160, do oceny funkcjonalnej.
