Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange
5 lutego 2016
Stworzyliśmy fotokonwertowalny system PSmOrange jako potężne, proste i tanie narzędzie do śledzenia komórek in vivo w transgenicznym tle GFP. Protokół ten opisuje jego zastosowanie w systemie modeli danio pręgowanego.
Ogólnym celem technologii konwersji zdjęć PSmOrange jest śledzenie komórek żywego zwierzęcia podczas rozwoju embrionalnego i choroby. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak odkrycie pochodzenia komórek, które przekształcają się w tkanki i narządy. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować w tłach transgenicznych GFP.
Metoda ta może być również stosowana w różnych dziedzinach badań, takich jak regeneracja, progresja guza i inwazja. Po wygenerowaniu i osadzeniu zarodków z ekspresją PSmOrange i GFP zgodnie z protokołem tekstowym, umieść zarodek pod mikroskopem konfokalnym i użyj obiektywu pneumatycznego 20x oraz laserów 488 i 561 nanometrów, aby zeskanować próbkę w celu zidentyfikowania obszaru do fotokonwersji. Aby wykryć białko PSmOrange przed fotokonwersją, użyj lasera o długości 561 nanometrów o mocy 0,74 miliwata mierzonej w płaszczyźnie ostrości nad obiektywem i dostosuj moc lasera w razie potrzeby.
Dostosuj współczynniki powiększenia, aby podkreślić obszar zainteresowania i skrócić czas pozyskiwania obrazu oraz fototoksyczność. Używając laserów 488 i 561 nanometrów w trybie sekwencyjnym i kroku Z między 1,0 a 2,0 mikrometrów, uzyskaj stos Z pokrywający interesujące nas struktury. Dostosuj średnią linii i częstotliwość skanowania, aby zoptymalizować jakość obrazu.
Następnie zeskanuj próbkę i wybierz obszar zainteresowania lub narzędzie ROI, aby podświetlić obszar do fotokonwersji przed ustaleniem ROI jako obszaru stymulacji. Wybierz moduł wybielania fotoaktywacyjnego, zaznacz pole, aby aktywować laser 488 nanometrów, a następnie ustaw laser 488 nanometrowy na 80%, a prędkość skanowania na 0,5 sekundy na klatkę. Następnie otwórz narzędzie do fotokonwersji i kliknij Dodaj'aby określić protokół fotokonwersji.
W menu stymulacji akwizycji ustaw Fazę pierwszą na akwizycję, a w menu pętli wskaż liczbę obrazów, które mają zostać pozyskane przed fotokonwersją. Ustaw Fazę drugą na stymulację i wprowadź liczbę zdarzeń stymulacji, które mają zostać wykonane. Dostosuj fazę trzecią zgodnie z opisem dla fazy pierwszej.
Opcjonalnie wstaw fazę oczekiwania po fazie drugiej, wprowadzając czas oczekiwania przed ostatnią rundą pozyskiwania obrazu. Po ustawieniu parametrów zastosuj ustawienie stymulacji i uruchom fotokonwersję. Niewłaściwe ustawienia mają kluczowe znaczenie dla fotokonwersji PSmOrange.
Aby zapewnić pomyślną fotokonwersję, zarodek jest obrazowany bezpośrednio po eksperymencie w celu wykrycia fotoprzekształconego białka PSmOrange. Jeśli konwersja się nie powiedzie, procedura jest powtarzana. Korzystając z laserów 488, 561 i 640 nanometrów i ustawiając laser 640 nm na wysoką moc, do 4,5 miliwata, uzyskaj końcowy stos z z ustawieniami opisanymi powyżej.
Aby zdemontować zarodek, wyjmij komorę z mikroskopu i użyj kleszczy, aby usunąć zarodek z agarozy. Przenieś zarodek na nową, wysterylizowaną plastikową szalkę Petriego lub wysterylizowaną 6-dołkową płytkę, zawierającą 0,2 milimolowego PTU w E3. Inkubuj zarodek w temperaturze 28 stopni Celsjusza do pożądanego etapu rozwoju. Aby przeanalizować los komórek wykazujących ekspresję białka PSmOrange fotokonwersowanego, należy ponownie zagnieździć zarodek zgodnie z protokołem tekstowym.
Pod konfokalnym miskroskopem zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować fotokonwertowane komórki w transgenicznej strukturze GFP, która jest przedmiotem zainteresowania. Użyj laserów 488, 561 i 640 nanometrów, aby uzyskać stos z ze stałym stosem od 1 do 2 mikrometrów w trybie sekwencyjnym pokrywającym struktury. Korzystając z oprogramowania Image J Fiji, zidentyfikuj komórki, które wykazują współekspresję GFP i fotoprzekształconego białka.
Zduplikuj oryginalny stos, użyj wtyczki Gaussian Blur i kalkulatora obrazu, aby odjąć gładkie stosy od oryginału. Zastosuj określone progi do kanałów zielonego i dalekiego czerwonego, aby podświetlić komórki fotokonwertowane. Następnie użyj narzędzia Analizuj cząstki, aby wykryć obszary progowe w kanale zielonym z odpowiednim ustawieniem.
Powtórz ten krok dla dalekiego kanału czerwonego. Otwórz wtyczkę kalkulatora obrazów, aby wykryć komórki kolokalizujące. Wyświetlaj na żółto nakładające się ROI w zielonym lub dalekim kanale czerwonym za pomocą narzędzia Analizuj cząstki.
Korzystając z oprogramowania NIS-Elements, przeprowadź ocenę daty 3D i wyświetl stos w 3D za pomocą opcji Pokaż widok objętości. Następnie użyj interfejsu graficznego, aby wybrać kanały zielony, czerwony i daleki czerwony, dostosuj jasność i kontrast, a następnie przytnij stos 3D, aby podświetlić obszar konwersji zdjęć. Pokazany tutaj jest przykład systemu fotokowersji PSmOrange w transgenicznych zarodkach GFP ryb danio pręgowanego z pływającą głową FOXD3.
Po 26 godzinach od zapłodnienia dwa skupiska komórek w przedniej części szyszynki zostały poddane fotokonwersji i natychmiast zobrazowane. Białko wykryto za pomocą lasera dalekiej czerwieni o długości 640 nanometrów, ale nie za pomocą lasera o długości fali 561 nanometrów. W tych komórkach ekspresja GFP była początkowo zmniejszona z powodu fotowybielania.
Przy 52 HPF, GFP i H2B PSmOrange wykryto w fotoprzekształconych komórkach eksprymujących białko H2B PSmOrange. Kilka z tych komórek utworzyło przyszyszynę po lewej stronie mózgu. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami na temat pochodzenia komórek przyszynowych w szyszynce przedniej i pokazuje możliwość zastosowania techniki PSmOrange w żywym zarodku transgenicznych kręgowców GFP.
Po tej procedurze można przeprowadzić analizę śledzenia komórek w genetycznie modyfikowanych zarodkach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące hierarchii molekularnych leżących u podstaw rozwoju komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
System PSmOrange jest efektywnym kosztowo narzędziem do śledzenia komórek in vivo w liniach transgenicznych GFP, w szczególności w modelach rybek zebrafish. Niniejszy protokół umożliwia badanie pochodzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego oraz w przebiegu chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Śledzenie komórek
- Rozwój embrionalny
Wstęp
- Technologia fotokonwersji PSmOrange umożliwia śledzenie komórek w żywych organizmach.
- Metoda ta znajduje zastosowanie w różnych dziedzinach badawczych, w tym w badaniach nad regeneracją i progresją nowotworową.
- Może być stosowana w tła transgenicznym GFP, co zwiększa jej wszechstronność.
- Do wizualizacji i fotokonwersji komórek wykorzystywana jest mikroskopia konfokalna.
Cel badania
- Do śledzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego oraz w przebiegu procesów chorobowych.
- Do odkrywania pochodzenia komórek, z których powstają tkanki i organy.
- Do uzyskania wiedzy na temat zachowania komórek w różnych kontekstach biologicznych.
Zastosowane metody
- Generowanie embrionów wykazujących ekspresję PSmOrange oraz GFP.
- Zatopienie embrionów w medium do analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.
- Wykorzystanie laserów o długości fali 488 i 561 nm do obrazowania.
- Fotokonwersja białka PSmOrange w celu śledzenia.
Główne wyniki
- Skuteczne śledzenie komórek w modelach rybek zebrafish przy użyciu systemu PSmOrange.
- Wykazana zdolność do wizualizacji pochodzenia i zachowań komórkowych.
- Podkreślono możliwość zastosowania tej metody w różnych obszarach badań biologicznych.
- Przedstawiono przejrzysty protokół do stosowania przez badaczy.
Wnioski
- System PSmOrange jest skutecznym narzędziem do śledzenia komórek in vivo.
- Zapewnia on istotne korzyści w badaniach nad biologią rozwoju.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia złożonych procesów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System fotokonwertowalnych białek PSmOrange umożliwia precyzyjne śledzenie komórek in vivo w embrionach transgenicznych rybek zebrafish GFP, rozwiązując kluczowy problem w badaniach nad biologią rozwoju, w których istniejące linie transgeniczne nie posiadają kompatybilnych reporterów do śledzenia linii komórkowych. Możliwość ta wspiera proces redukcji ryzyka mechanistycznego w walidacji celów terapeutycznych, pozwalając na bezpośrednią wizualizację pochodzenia komórkowego i decyzji dotyczących losów komórek w systemach istotnych dla chorób, szczególnie w zastosowaniach onkologicznych i medycynie regeneracyjnej obejmujących progresję nowotworów, inwazję oraz regenerację tkanek. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając ilościowych, rozdzielczo przestrzennych danych na temat migracji i różnicowania komórek wewnątrz nienaruszonych, żywych organizmów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie określonych populacji komórek w liniach transgenicznych w celu wyjaśnienia komórkowego pochodzenia tkanek i organów.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z istniejącymi transgenicznymi liniami GFP, co eliminuje konieczność generowania nowych promotorów i skraca czas opracowania modelu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią obserwację decyzji dotyczących losu komórek, co zwiększa pewność co do powiązań między mechanizmem choroby a celem terapeutycznym.
Przesiewy i rozwój analiz
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne dane przestrzenne i czasowe dotyczące migracji komórek po fotokonwersji, co umożliwia obiektywne porównanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardową mikroskopię konfokalną z sekwencyjną eksytacją laserową (488, 561, 640 nm), nie wymagając specjalistycznego sprzętu poza typowym zapleczem obrazowania.
- Skalowalność: Kompatybilna z obrazowaniem 3D o wysokiej rozdzielczości oraz narzędziami do postprocesingu (ImageJ Fiji, NIS-Elements) w celu przeprowadzenia powtarzalnej analizy kolokalizacji z GFP.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Bezpośrednio stosowalne w badaniach nad inwazją komórek nowotworowych i modelami przerzutowania w ksenograftach u rybek zebrafish lub w transgenicznych modelach nowotworowych.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia płynne przejście od fazy odkryć (śledzenie pochodzenia komórek) do walidacji przedklinicznej poprzez monitorowanie przytwierdzania, migracji i integracji fotokonwertowanych komórek in vivo.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Zapewnia wizualne i ilościowe punkty końcowe dla decyzji typu go/no-go we wczesnym etapie rozwoju przedklinicznego, w oparciu o zachowanie komórek w kontekstach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
System PSmOrange wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkryć do badań przedklinicznych, służąc jako narzędzie do przesiewu fenotypowego i walidacji mechanistycznej, które łączy manipulacje genetyczne z funkcjonalnymi odczytami komórkowymi w żyjących modelach kręgowców.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie mapowania losów specyficznych populacji komórek w odpowiedzi na zaburzenia genetyczne lub środowiskowe w embrionach transgenicznych GFP.
- Przesiewanie: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe (procenty ko-lokalizacji, odległości migracji) odpowiednie dla przesiewów związków chemicznych lub genetycznych supresorów/enhancerów.
- Analityka: Dostarcza wielokanałowe dane fluorescencyjne (GFP, pomarańczowy/czerwony PSmOrange, dalekoczerwony fotokonwertowany PSmOrange), umożliwiając rygorystyczną ko-lokalizację i analizę cząstek w celu obiektywnego fenotypowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez śledzenie zachowania komórek w modelach regeneracji i progresji nowotworowej, dostarczając informacji o mechanistycznej zasadności celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi możliwość ponownego wykorzystania platformy; iniekcja mRNA pozwala na szybkie wdrożenie w wielu liniach transgenicznych bez konieczności generowania nowych szczepów stabilnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów, dostarczając bezpośrednich dowodów wizualnych na dynamikę komórkową w nienaruszonych organizmach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację między laboratoriami dzięki zdefiniowanym protokołom fotokonwersji i ustawieniom lasera (488 nm przy 80% mocy, 0,5 s/klatkę; 640 nm do 4,5 mW dla detekcji).
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wykorzystanie istniejących zasobów transgenicznych GFP, co pozwala uniknąć kosztownej identyfikacji promotorów de novo i generowania linii komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wczesnych, funkcjonalnych danych in vivo na temat zachowania komórek, co redukuje liczbę niepowodzeń na późnych etapach wynikających z nieprzewidzianej złożoności biologicznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii konfokalnej, technik fotokonwersji oraz spektralnego rozdzielania sygnałów fluorescencyjnych (unmixing).
- Metoda jest zależna od dostępu do konfokalnych systemów skanowania laserowego z laserami 488, 561 i 640 nm oraz odpowiednimi zestawami filtrów.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników konieczna jest standaryzacja wyboru obszarów ROI, mocy lasera, prędkości skanowania oraz parametrów stosu z (z-stack) u wszystkich użytkowników.
- Adaptacja do gatunków ryb kostnoszkieletowych innych niż danio przebrany może wymagać optymalizacji dawki mRNA oraz wydajności fotokonwersji.
- Ograniczenie praktyczne: wydajność fotokonwersji zależy od poziomów ekspresji białka oraz dostępności komórek docelowych dla penetracji lasera w grubszych tkankach.
