Name: Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę śledzenia komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą systemu PSmOrange. Technika ta umożliwia badanie pochodzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego i chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy O. Subachowi za dostarczenie oryginalnego plazmidu H2B-PSmOrange oraz naszemu zespołowi ds. hodowli ryb za opiekę nad rybami. Jesteśmy wdzięczni Centrum Obrazowania firmy Nikon na Uniwersytecie w Heidelbergu za dostęp do sprzętu mikroskopowego i oprogramowania analitycznego. Dziękujemy za wsparcie ze strony Core Facility Live Cell Imaging Mannheim w CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Prace te były wspierane przez Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), Uniwersytet w Heidelbergu do C.A.B. i Wydziału Medycznego Mannheim Uniwersytetu w Heidelbergu oraz DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 i 298/6-1) do M.C.

1. Transkrypcja mRNA H2B-PSmOrange In Vitro i oczyszczanie mRNA
<ol>
	<li>Linearyzować plazmid H2B-PSmOrange zawierający pCS2+ za pomocą enzymu restrykcyjnego NotI zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: Kolejne kroki należy wykonać, stosując odpowiednie zabezpieczenia, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny, aby zapobiec zanieczyszczeniu i degradacji mRNA.</li>
	<li>Oczyść zlinearyzowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR lub metod opartych na fenolu i chloroformie zgodnie z protokołami producentów.</li>
	<li>Użyj 1 μg zlinearyzowanego matrycowego DNA do transkrypcji Sp6-mRNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Usunąć DNA, dodając 1,0 U DNazy wolnej od RNazy przez 10-20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Oczyść mRNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Aby zwiększyć czystość i stężenie mRNA, wytrącić mRNA, dodając 6 μl octanu sodu (3,0 M, pH 5,2) i 150 μl 96% etanolu. Mieszaninę roztworu inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut do 24 godzin.</li>
	<li>Zebrać mRNA, obracając roztwór o stężeniu 18,407 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić ciecz i ponownie zawiesić mRNA w 150 μl 70% etanolu. Wymieszać i odwirować roztwór przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić płyn, wysuszyć osad przez 5 minut na lodzie i ponownie zawiesić mRNA w 20 μl ultraczystej wody wolnej od RNazy.</li>
	<li>Oceń stężenie i czystość mRNA za pomocą pomiaru fotometrycznego rozcieńczenia 1:100 mRNA (1 μl mRNA w 99 μl ultraczystej wody wolnej od RNazy).</li>
	<li>W przypadku krótkotrwałego przechowywania roztwór mRNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać mRNA w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja mRNA H2B-PSmOrange do zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw pary godowe na noc przed wstrzyknięciem za pomocą tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP) podwójnie transgenicznej ryby (lub dowolnej innej transgenicznej ryby GFP). Pozostaw ryby oddzielone, umieszczając między nimi przekładkę, aby kontrolować czas krycia.</li>
	<li>Rano w dniu wstrzyknięcia należy usunąć przekładkę i pozwolić rybie połączyć się w pary przez 20 minut.</li>
	<li>W czasie krycia rozcieńczyć mRNA H2B-PSmOrange do końcowego stężenia 130 pg/nl (w wodzie wolnej od RNazy) i przenieść 6 μl roztworu iniekcyjnego do kapilary mikroiniekcyjnej za pomocą końcówki mikroładowarki. Sprawdzić objętość wstrzyknięcia za pomocą skalibrowanego szkiełka podstawowego. Dostosuj ciśnienie wtrysku, aby wstrzyknąć 2 nl roztworu mRNA (260 pg).</li>
	<li>Zbierz jaja do wysterylizowanej plastikowej szalki Petriego zawierającej 1x pożywkę z zarodków (E3).</li>
	<li>Przenieść od 20 do 30 zarodków do naczynia iniekcyjnego za pomocą plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 nl roztwór zawierający mRNA do komórki lub tuż pod komórką do żółtka na etapie jednokomórkowym 11.</li>
	<li>Przenieść wstrzyknięte zarodki na szalkę Petriego zawierającą 1x pożywkę E3, usunąć niezapłodnione lub nie rozwijające się normalnie zarodki i wyhodować je w temperaturze 28 °C. 
	Uwaga: Ochrona zarodków przed światłem nie jest wymagana przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Hoduj zarodki danio pręgowanego w pożywce 1x E3 i dodaj 0,2 mM PTU (1-fenylo-2 tiomocznik) po gastrulacji, aby zahamować pigmentację. Zmieniaj pożywkę dwa razy dziennie, aby zminimalizować niebezpieczeństwo skażenia bakteryjnego.</li>
</ol>
3. Osadzanie zarodków
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu dwuokularowego wyposażonego w lampę fluorescencyjną i odpowiednie filtry emisyjne wybrać zarodki o współekspresji GFP (zielony) i PSmOrange (pomarańczowy/czerwony). Przenieść dodatnie zarodki na sterylną szalkę Petriego zawierającą 1x pożywkę E3.</li>
	<li>Dekorionate zarodki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy 12.</li>
	<li>Przenieść jeden zarodek do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,0 ml wstępnie podgrzanej 1,0% niskotopliwej agarozy (LMA) przygotowanej w ultraczystej wodzie za pomocą pipety z końcówką tnącą (P200). Uwaga: Podgrzej LMA do 80 °C i schładzaj przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej przed osadzeniem zarodka.</li>
	<li>Przenieść zarodek w 150 μl LMA do komorowego szkła nakrywkowego i dostosować orientację zarodka, np. grzbietem do dołu w doświadczeniu opisanym dla odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego A1R+ (lub innego odpowiedniego mikroskopu), za pomocą cienkiej plastikowej końcówki. Gdy LMA zostanie spolimeryzowany, napełnij komorę wodą dla ryb zawierającą 0,2 mM PTU i 0,02% metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikainy) do znieczulenia.</li>
	<li>Przed obrazowaniem próbki należy odczekać 15 minut, aby upewnić się co do działania trikainy. Znieczulenie zapobiega ruchom zarodka, które można monitorować za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w oświetlenie jasnego pola. 
	Uwaga: Komory mogą być ponownie użyte dwukrotnie.</li>
</ol>
4. Konwersja zdjęć PSmOrange
<ol>
	<li>Umieść próbkę pod mikroskopem konfokalnym i zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować obszar do fotokonwersji za pomocą laserów 488 nm i 561 nm do obrazowania odpowiednio GFP i PSmOrange. 
	Uwaga: Użyj odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego A1R+ na odwróconym stoliku TiEkontrolowanym przez oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego i wyposażonym w lasery 488 nm, 561 nm i 640 nm do fotokonwersji i obrazowania. Jednak zastosowanie z pewnością nie ogranicza się do tego mikroskopu, o ile dostępne są linie laserowe do konwersji i obrazowania.
	<ol>
		<li>Umieść obiektyw pneumatyczny 20X na miejscu (NA: 0.75; szerokość szer.: 1,0 mm; Pole widzenia: 0,64 x 0,64 mm).</li>
		<li>Użyj następujących ustawień mikroskopu, aby wykryć białko PSmOrange przed fotokonwersją: Laser 561 nm, 0,74 mW mierzony na płaszczyźnie ostrości nad obiektywem. 
		Uwaga: Odpowiada to 40% w tym systemie (pomiar w płaszczyźnie ostrości jest jedynym sposobem na określenie mocy efektywnej). Dostosuj moc lasera do potrzeb eksperymentalnych, ponieważ skuteczność iniekcji H2B-PSmOrange może się różnić.</li>
		<li>Dodaj współczynniki powiększenia, aby wyróżnić obszar zainteresowania. Większe powiększenia skracają czas akwizycji obrazu, a tym samym fototoksyczność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj stos z pokrywający interesujące Cię struktury za pomocą laserów o długości fali 488 nm i 561 nm w trybie sekwencyjnym (tryb liniowy 1->4). Ustaw krok z w zakresie od 1,0 do 2,0 μm. Średnia liniowa i częstotliwość skanowania mogą być wykorzystane do optymalizacji jakości obrazu.</li>
	<li>Zeskanuj próbkę i wybierz narzędzie do obszaru zainteresowania (ROI), aby podświetlić obszar do fotokonwersji. Napraw ROI jako obszar stymulacji. Wybierz moduł Aktywacja fotograficzna/wybielanie, aktywuj laser 488 nm, zaznaczając odpowiednie pole i ustaw laser 488 nm na 80% (moc lasera 1 mW mierzona na obiektywie). Ustaw szybkość skanowania na 0,5 sekundy/klatkę.</li>
	<li>Otwórz narzędzie do fotokonwersji (Stymulacja ND) i określ ustawienia fotokonwersji.
	<ol>
		<li>Kliknij polecenie "Dodaj", aby określić protokół fotokonwersji.</li>
		<li>Ustaw "Faza" 1 w menu "Akwizycja/Stymulacja" na "Akwizycja" i wskaż liczbę obrazów, które mają zostać pozyskane przed fotokonwersją w menu "Pętle".</li>
		<li>Ustaw "Faza" 2 na "Stymulacja" i wprowadź liczbę zdarzeń stymulacji, które mają zostać wykonane.</li>
		<li>Dostosuj "Fazę" 3 zgodnie z opisem dla "Fazy" 1. Opcjonalnie wstaw oczekującą "Fazę" po "Fazie" 2, wprowadzając czas oczekiwania przed ostatnią rundą pozyskiwania obrazu.</li>
		<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów zastosuj ustawienie stymulacji i uruchom fotokonwersję. 
		Uwaga: Moc lasera, częstotliwość skanowania i liczba iteracji dla każdej rundy fotokonwersji mogą się różnić i różnić w zależności od zarodka. Ustawienie, od którego należy zacząć, przedstawiono w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj końcowy stos z za pomocą laserów 488 nm, 561 nm i 640 nm, stosując ustawienia jak powyżej. Ustaw laser 640 nm tak, aby wizualizował przekonwertowany PSmOrange przy użyciu dużej mocy lasera (do 4,5 mW).</li>
</ol>
5. Zdemontuj zarodek z LMA
<ol>
	<li>Wyjąć komorę zawierającą zarodek z mikroskopu. Ostrożnie usuń zarodek z agarozy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przenieść zarodek do nowej, wysterylizowanej plastikowej szalki Petriego lub do wysterylizowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 1x E3 i 0,2 mM PTU. Inkubować zarodek w temperaturze 28 °C aż do pożądanego stadium rozwoju.</li>
</ol>
6. Analiza losów komórek eksprymujących białko PSmOrange przekształcone w fotokonwersję
<ol>
	<li>Ponownie zagnieździć zarodek zgodnie z opisem w pkt 3.3 i 3.4.</li>
	<li>Umieścić próbkę pod mikroskopem konfokalnym i zeskanować próbkę w celu zidentyfikowania komórek fotokonwertowanych (640 nm) w transgenicznej strukturze GFP (488 nm).</li>
	<li>Uzyskaj stos z pokrywający interesujące nas struktury za pomocą laserów 488 nm, 561 nm i 640 nm w trybie sekwencyjnym (tryb liniowy 1->4). Ustaw krok z w zakresie od 1,0 do 2,0 μm. Średnia liniowa i częstotliwość skanowania mogą być wykorzystane do optymalizacji jakości obrazu.</li>
	<li>Użyj jednej z poniższych metod, aby zidentyfikować komórki, które wykazują współekspresję GFP i fotoprzekształconego białka.
	<ol>
		<li>Wykonany na zamówienie automatyczny Fiji ImageJ Macro3
		<ol>
			<li>Zrównaj oryginalny stos za pomocą wtyczki "GaussianBlur" ( → Process → Filters → GaussianBlur) i odejmij gładkie stosy od oryginału za pomocą wtyczki "Image Calculator" (→ Process → Image Calculator). Ten krok służy do wizualizacji interesujących struktur i skrócenia czasu obliczeniowego analizy.</li>
			<li>Zastosuj określone progi do kanałów zielonego i dalekiej czerwieni, aby podświetlić komórki fotokonwertowane ( → Obraz → Dostosuj próg →). Użyj narzędzia "Analizuj cząstki", aby wykryć obszary progowe z odpowiednim ustawieniem ( → Analizuj → Analizuj cząstki).</li>
			<li>Otwórz wtyczkę "Image Calculator" i wyświetl nakładające się ROI w zielonym kanale i dalekim czerwonym w kolorze żółtym ( → Process → Image Calculator).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego do oceny danych 3D
		<ol>
			<li>Wyświetl stos w 3D za pomocą opcji pokaż widok objętości ( → Menu Wizualizacja 3D → Pokaż widok objętości). Użyj interfejsu graficznego, aby wybrać kanały zielony, czerwony i dalekiej czerwieni, dostosować jasność i kontrast, a następnie przyciąć stos 3D, aby podświetlić obszar konwersji zdjęć (Rysunek 1). 
			Uwaga: Podobne metody analizy danych są dostępne w większości popularnych programów do analizy obrazów.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein%2C+PSmOrange%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li>
<li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19(2013).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling ">http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling </a> (2015).</li>
<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transgeniczne embriony przenoszące fluorescencyjne reportery zasadniczo pomogły w zrozumieniu rozwoju embrionalnego. Nadal jednak istnieje zasadnicza potrzeba stosowania promotorów, którzy ułatwią specyficzną wizualizację poszczególnych konstrukcji. W przypadku ich braku naukowcy polegają na technikach takich jak fotokonwersja białek fluorescencyjnych, aby dowiedzieć się o pochodzeniu i rozwoju ich interesującej struktury. To z kolei jest kluczowym warunkiem wstępnym do zidentyfikowania mechanizmów molekularnych zaangażo...

Wykładniczo ulepszające techniki obrazowania pozwalają śledzić procesy rozwojowe w okresach do około czterech kolejnych dni3. U danio pręgowanego i wielu innych modelowych systemów zwierzęcych określone komórki, tkanki, struktury aksonalne lub naczyniowe są oznaczone transgenicznymi zielonymi lub czasami czerwonymi lub żółtymi białkami fluorescencyjnymi, aby ułatwić wizualizację. Jednak w większości linii transgenicznych transgen nie ulega specyficznej ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania, ale także w dodatkowych strukturach, co utrudnia precyzyjne śledzenie na przykład pojedynczych komórek lub grup komórek.
Fluorescencyjne białka fotokonwertowalne są dobrze przystosowane do śledzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego. Warunkami wstępnymi do zastosowania takich białek są długowieczność, dobrze oddzielony zakres emisji po konwersji i jasna fluorescencja. Dostępne białka fotokonwertowalne obejmują te, które zmieniają swój zakres emisji po konwersji, takie jak Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 lub Dendra27 i inne, które są fluorescencyjne tylko po fotoaktywacji (PAmCherry8, PAGFP9 lub PATagRFP10). Ich zastosowania do śledzenia komórek u istniejących zwierząt transgenicznych FP są jednak ograniczone, ponieważ często obejmują one stan zielonej fluorescencji lub nie spełniają wszystkich powyższych kryteriów. Dopiero niedawno Subach i współpracownicy opisali białko PSmOrange, które zmienia swoją emisję z pomarańczowo-czerwonej na daleką czerwoną po fotokonwersji i zostało z powodzeniem zastosowane w komórkach w hodowli i hodowanych komórkach wstrzykniętych myszom2.
Aby zbadać przydatność białka do śledzenia komórek w żywym embrionie, stworzyliśmy konstrukt ekspresji do mikroiniekcji znakowanego nuklearnie H2B-PSmOrange do embrionów danio pręgowanego. Odkryliśmy, że białko spełnia wszystkie warunki wstępne do pomyślnego śledzenia komórek w transgenicznym tle GFP w ciągu pierwszych 4 (a być może więcej) dni rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. W tym czasie większość migracji komórek odbywa się u ryb, co sprawia, że system PSmOrange jest doskonałym dodatkiem do zestawu narzędzi dla danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Zestaw do czyszczenia</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe</td><td>laboratoria Pasteura alpha</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Oryginalny plazmid H2B-PSmOrange</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>Plazmid opisany w artykule to dostępny w</td></tr><tr><td>mikrowtryskiwaczu Carl lab FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Niemcy</td><td>Nr numeru</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; Obiektyw pneumatyczny 20X&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Niemcy</td><td>nr numeru</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software (wersja 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Niemcy/Laboratory Imaging</td><td>No Number</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego gfp za pomocą fotokonwertowalnego systemu psmorange

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Szybki rozwój przezroczystych zarodków danio pręgowanego (Danio rerio) w połączeniu z fluorescencyjnym znakowaniem komórek i tkanek pozwala na wizualizację procesów rozwojowych zachodzących u żywego zwierzęcia. Interesujące komórki można znakować za pomocą specyficznego dla tkanki promotora do sterowania ekspresją białka fluorescencyjnego (FP) w celu wytworzenia linii transgenicznych. Wykorzystanie do tego celu fluorescencyjnych białek fotokonwertowalnych pozwala dodatkowo na precyzyjne śledzenie zdefiniowanych struktur w obrębie domeny ekspresji. Oświetlenie białka w obszarze zainteresowania zmienia jego widmo emisyjne i uwydatnia konkretną komórkę lub klaster komórek, pozostawiając inne komórki transgeniczne w ich pierwotnym kolorze. Głównym ograniczeniem jest brak znanych promotorów dla dużej liczby tkanek danio pręgowanego. Z drugiej strony, badania przesiewowe pułapek genowych i wzmacniających wygenerowały ogromne zasoby transgeniczne, dyskretnie znakując dosłownie wszystkie struktury embrionalne, głównie za pomocą GFP lub w mniejszym stopniu czerwonych lub żółtych FP. Podejście do śledzenia zdefiniowanych struktur w takich transgenicznych tłach polegałoby na dodatkowym wprowadzeniu wszechobecnego białka fotokonwertowalnego, które mogłoby zostać przekształcone w komórkę (komórki) będącą przedmiotem zainteresowania. Jednak dostępne białka fotokonwertowalne obejmują zielony i/lub rzadziej czerwony stan emisji1 i dlatego często nie mogą być wykorzystywane do śledzenia komórek na tle FP istniejących linii transgenicznych. Aby obejść ten problem, stworzyliśmy system PSmOrange dla danio pręgowanego2,3. Prosta mikroiniekcja syntetycznego mRNA kodującego jądrową formę tego białka znakuje wszystkie jądra komórkowe pomarańczowo-czerwoną fluorescencją. Po ukierunkowanej fotokonwersji białka przełącza swoje widmo emisyjne na daleką czerwień. Wydajność kwantowa i stabilność białka sprawia, że PSmOrange jest doskonałym narzędziem do śledzenia komórek dla danio pręgowanego i prawdopodobnie innych gatunków teleostów.

Rysunek 1 przedstawia przykład systemu fotokonwersji PSmOrange. Kompleks szyszynkowy jest konserwowaną strukturą w grzbietowej części diencefalonu kręgowców. Podobnie jak u wielu innych kręgowców, kompleks ten składa się z narządu szyszynkowego w centrum diencefalonu oraz komórek parapinealnych po lewej stronie. Precyzyjne, lecz czasochłonne eksperymenty z uwalnianiem klatek (uncaging) wykazały, że komórki parapinealne pochodzą z przedniej części narządu szyszynkowego<sup...

Stworzyliśmy fotokonwertowalny system PSmOrange jako potężne, proste i tanie narzędzie do śledzenia komórek in vivo w transgenicznym tle GFP. Protokół ten opisuje jego zastosowanie w systemie modeli danio pręgowanego.

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Ogólnym celem technologii fotokonwersji PSmOrange jest śledzenie komórek w żywym organizmie podczas rozwoju embrionalnego oraz przebiegu chorób. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak odkrycie pochodzenia komórek, z których powstają tkanki i organy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania w organizmach transgenicznych wykazujących ekspresję GFP.Metodę tę można zastosować również w innych obszarach badawczych, takich jak regeneracja, progresja i inwazja nowotworowa. Po wygenerowaniu i zatopieniu embrionów wykazujących ekspresję PSmOrange i GFP zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić embrion pod mikroskopem konfokalnym i użyć obiektywu powietrznego 20x oraz laserów 488 i 561 nanometr, aby przeskanować preparat i zidentyfikować obszar do fotokonwersji. W celu wykrycia białka PSmOrange przed fotokonwersją należy użyć lasera 561 nanometr o mocy 0,74 miliwat mierzonej w płaszczyźnie ogniskowej nad obiektywem i w razie potrzeby dostosować moc lasera.Dostosuj stopień powiększenia, aby wyróżnić obszar zainteresowania oraz skrócić czas akwizycji obrazu i ograniczyć fototoksyczność. Korzystając z laserów o długości fali 488 i 561 nanometrów w trybie sekwencyjnym oraz kroku Z od 1,0 do 2,0 mikrometrów, wykonaj stos Z (Z stack) obejmujący badane struktury. Dostosuj średnią linii i częstotliwość skanowania w celu zoptymalizowania jakości obrazu.Następnie należy przeskanować próbkę i wybrać narzędzie regionu zainteresowania (ROI), aby zaznaczyć obszar do fotokonwersji, a następnie zatwierdzić ROI jako obszar stymulacji. Wybierz moduł wybielania fotoaktywacyjnego, zaznacz pole aktywacji lasera 488 nm, a następnie ustaw moc lasera 488 nm na 80% i prędkość skanowania na 0,5 sekundy na klatkę. Następnie otwórz narzędzie do fotokonwersji i kliknij „Add”, aby określić protokół fotokonwersji.W menu stymulacji podczas akwizycji ustaw Fazę Pierwszą (Phase One) na akwizycję, a w menu pętli określ liczbę obrazów do pozyskania przed fotokonwersją. Ustaw Fazę Drugą (Phase Two) na stymulację i wprowadź liczbę zdarzeń stymulacji do przeprowadzenia. Dostosuj Fazę Trzecią (Phase Three) zgodnie z opisem dla Fazy Pierwszej.Opcjonalnie można wprowadzić fazę oczekiwania (Waiting Phase) po fazie drugiej, wpisując czas oczekiwania przed ostatnią rundą akwizycji obrazów. Po ustawieniu parametrów należy zastosować ustawienia stymulacji i przeprowadzić fotokonwersję. Ustawienia mikroskopowe są kluczowe dla fotokonwersji PSmOrange.Aby zapewnić pomyślną fotokonwersję, zaraz po zakończeniu eksperymentu wykonuje się obrazowanie embrionu w celu wykrycia fotokonwertowanego białka PSmOrange. Jeśli konwersja nie powiodła się, procedurę powtarza się. Używając laserów o długości fali 488, 561 i 640 nanometrów oraz ustawiając laser 640 nanometrów na wysoką moc, do 4.5 milliwattów, należy pozyskać końcowy stos obrazów z (z stack) przy parametrach opisanych powyżej.Aby odmontować embrion, należy wyjąć komorę z mikroskopu i za pomocą pincety usunąć embrion z agarozy. Przenieść embrion do nowej sterylnej plastikowej szalki Petriego lub sterylnej płytki 6-dołkowej zawierającej 0.2 millimolar PTU w E3. Inkubować embrion w temperaturze 28 stopni Celsius aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Aby przeanalizować losy komórek wykazujących ekspresję fotokonwertowanego białka PSmOrange, należy ponownie osadzić embrion zgodnie z protokołem tekstowym.Pod mikroskopem konfokalnym przeskanuj preparat, aby zidentyfikować komórki poddane fotokonwersji w interesującej strukturze transgenicznej GFP. Użyj laserów o długości fali 488, 561 i 640 nanometrów, aby pozyskać stos obrazów z (z stack) o stałym kroku od 1 do 2 mikrometrów w trybie sekwencyjnym, obejmujący badane struktury. Przy użyciu oprogramowania Image J Fiji zidentyfikuj komórki, które koekspresują GFP i białko poddane fotokonwersji.Zduplikuj oryginalny stos obrazów, a następnie użyj wtyczki Gaussian Blur oraz kalkulatora obrazów, aby odjąć stosy wygładzone od oryginalnych. Zastosuj odpowiednie progi dla kanału zielonego i dalekiej czerwieni, aby wyróżnić komórki poddane fotokonwersji. Następnie użyj narzędzia Analyze Particles z odpowiednimi ustawieniami, aby wykryć obszary przekroczenia progu w kanale zielonym.Powtórz ten krok dla kanału dalekiej czerwieni. Otwórz wtyczkę kalkulatora obrazów (image calculator), aby wykryć komórki kolokalizujące. Wyświetl na żółto nakładające się obszary ROI w kanale zielonym lub dalekiej czerwieni, korzystając z narzędzia Analyze Particles.Używając oprogramowania NIS-Elements, przeprowadź ewaluację danych 3D i wyświetl stos obrazów w 3D, korzystając z opcji Show Volume View. Następnie za pomocą interfejsu graficznego wybierz kanały zielony, czerwony i dalekiej czerwieni, dostosuj jasność oraz kontrast i przytnij stos 3D, aby wyróżnić obszar poddany fotokonwersji. Przedstawiony tutaj przykład dotyczy systemu fotokonwersji PSmOrange w zarodkach ryby danio pręgowanej z transgenem GFP w głowie FOXD3.W 26. godzinie po zapłodnieniu dwie grupy komórek w przedniej części szyszynki zostały poddane fotokonwersji, a następnie natychmiast obrazowane. Białko wykryto za pomocą dalekiego czerwonego lasera o długości fali 640 nanometrów, ale nie za pomocą lasera o długości fali 561 nanometrów. W komórkach tych ekspresja GFP była początkowo obniżona na skutek fotowyblakania.W 52. godzinie rozwoju (HPF) w komórkach wykazujących ekspresję fotokonwertowanego białka H2B PSmOrange wykryto GFP oraz H2B PSmOrange. Kilka z tych komórek utworzyło parapinealne w lewej części mózgu. Wynik ten jest zgodny z poprzednimi doniesieniami na temat pochodzenia komórek parapinealnych w przedniej części szyszynki i wykazuje przydatność techniki PSmOrange w żywym embrionie kręgowca transgenicznego GFP.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać analizę śledzenia komórek w embrionach poddanych manipulacjom genetycznym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące hierarchii molekularnych leżących u podstaw rozwoju komórek.

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Poznaj metodę śledzenia komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą systemu PSmOrange. Technika ta umożliwia badanie pochodzenia komórek podczas rozwoju embrionalnego i chorób.

Śledzenie komórek u danio pręgowanego transgenicznego GFP za pomocą fotokonwertowalnego systemu PSmOrange

Przeglądaj więcej filmów