Name: Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj protokół wysokowydajnej tomografii krioelektronowej z użyciem Tomoauto. Ta metoda automatyzuje przetwarzanie dużych zbiorów danych z detektorów nowej generacji, umożliwiając badaczom skupienie się na analizie biologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Williamowi Margolinowi za komentarze. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie w SerialEM ze strony dr Davida Mastronarde i dr Chen Xu. D.M., B.H. i J.L. byli wspierani przez Grant R01AI087946 z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, granty R01GM110243 i R01GM107629 z National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) oraz Grant AU-1714 z Welch Foundation. Bezpośredni detektor elektronów został sfinansowany przez National Institutes of Health Award S10OD016279.

1. Przygotowanie minikomórki
<ol>
	<li>Aby wytworzyć minikomórki S. flexneri, przekształć 1 μl plazmidu pBS58, który konstytutywnie wyraża geny podziału komórek Escherichia coli ftsQ, ftsA i ftsZ z plazmidu opornego na spektynomycynę o niskiej kopii w 5 μl elektrokompetentnych komórek serotypu 5a opornego na streptomycynę (M90T-Sm) przez elektroporację przy 2,5 kV przez 5 ms w kuwetach 1 mm.</li>
	<li>Przechowuj próbki minikomórek w temperaturze -80 °C w 15% glicerolu w mikroprobówce kriogenicznej o pojemności 1,5 ml. Gdy jest gotowy do użycia, zeskrobać około 5 μl komórek z nierozmrożonej mikroprobówki za pomocą końcówki pipety i zawiesić komórki w 4 ml tryptycznego bulionu sojowego z dodatkiem spektynomycyny o stężeniu 100 μg/ml. Uprawiać O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 2 ml kultury z 1,2 do 200 ml tryptycznego bulionu sojowego z ponownie dodaną spektynomycyną do stężenia 100 μg/ml. Rośnie w temperaturze 37 °C do późnej fazy logarytmicznej.</li>
	<li>Aby wzbogacić minikomórki, odwirować 200 ml kultury z 1,3 przy 1 000 x g przez 5 minut. Ostrożnie wlać frakcję sklarowanej nad osadem do nowej probówki wirówkowej i wirować przy 20 000 x g przez 10 minut. Ostrożnie odlać i wyrzucić frakcję sklarowanej nad osadem, a następnie delikatnie wymieszać osad z pozostałą cieczą za pomocą końcówki pipety i przenieść około 100 μl mieszaniny osadów do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie siatki EM
<ol>
	<li>Umieść dziurawą folię węglową R2/2 o oczkach miedzianych o oczkach węglowych stroną z węgla do góry na szklanym szkiełku. 
	UWAGA: Siatka R2/2 o siatce 200 została wybrana, aby zmaksymalizować liczbę serii pochylenia, które można ustawić tak, aby uzyskać w jednym kwadracie siatki, jednocześnie podtrzymując próbkę i umieszczając krawędź folii węglowej w polu kamery pod żądanym powiększeniem. Do próbek obrazowanych w większym powiększeniu można stosować siatki o mniejszych oczkach i mniejsze, dziurawe folie węglowe, takie jak siatka R1.2/1.3 400; większe dziurawe folie węglowe, takie jak R3.5/1 200-mesh, mogą być używane do próbek obrazowanych w mniejszym powiększeniu lub jeśli mikrofotografia nie powinna zawierać krawędzi węglowej, a dziurawe folie węglowe o większych odstępach, takie jak R1/4 200-mesh, mogą być używane do pomocy w wyrównaniu stolika do obszaru zainteresowania i ochronie obszarów przed nadmierną ekspozycją podczas rutynowych ustawiania ostrości i śledzenia.</li>
	<li>Umieść szkiełko na platformie w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego. 
	UWAGA: Używamy własnego urządzenia, w którym anoda i platforma zostały obrobione w eksykator próżniowy i są zasilane przez generator wysokiej częstotliwości. Po wytworzeniu próżni podłącz sondę generatora wysokiej częstotliwości do anody i włącz sondę na 1 minutę, aby rozładować siatkę. Czas potrzebny do rozładowania żarzenia siatki może wynosić od kilku sekund do minuty. Zmiana czasu wyładowania jarzeniowego może być wykorzystana do zdiagnozowania problemów ze stężeniem próbki i siatkami, które wydają się suche bez szklistego lodu.</li>
	<li>Usuń siatkę za pomocą zestawu kleszczy i zablokuj kleszcze zamknięte elastyczną opaską.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu złota koloidalnego o długości fali 10 nm do probówki mikrowirówki z minikomórkami przygotowanymi w 1.4 i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę palcem. Za pomocą nowej pipety umieścić 4 μl mieszaniny na ruszcie przygotowanym w 2.2. 
	UWAGA: Złoto koloidalne jest dostępne w różnych rozmiarach i należy zadbać o to, aby rozmiar złota był większy niż 5 pikseli, biorąc pod uwagę rozmiar pikseli mikrofotografii, które mają być przetwarzane przy uzyskanym powiększeniu, a jednocześnie nie był zbyt duży, aby zasłaniać interesujące go cechy.</li>
	<li>Przygotować aparat do zamrażania wgłębnego; napełnić zewnętrzny pojemnik do zamrażania ciekłym azotem, a następnie napełnić komorę wewnętrzną ciekłym etanem. Przymocuj kleszczyki z siatką do tłoka i zablokuj tłok w pozycji podniesionej. 
	UWAGA: Patrz Iancu i wsp.20 dla protokołu opisującego użycie komercyjnego urządzenia do zamrażania wgłębnego.</li>
	<li>Osusz siatkę, ostrożnie dotykając kawałka bibuły filtracyjnej do kropli próbki, aż menisk między siatką a bibułą filtracyjną oddzieli się, a odprowadzanie wilgoci na bibule filtracyjnej ustanie, a następnie natychmiast zwolnij tłok, zamrażając siatkę. Ostrożnie wyjmij kleszcze z tłoka i umieść siatkę w uchwycie siatki.</li>
	<li>Przygotować stację transferową cryo-EM, napełniając obszar załadunku i zbiornik pompy absorpcyjnej ciekłym azotem. Gdy obszar załadunku osiągnie temperaturę ciekłego azotu, umieść w nim uchwyt siatki i wkład z próbką mikroskopu.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij pierścień blokujący, który jest albo małym gwintowanym pierścieniem blokującym we wcześniejszych mikroskopach Polara, albo pierścieniem zaciskowym typu C w nowszych modelach; umieść siatkę EM we wkładzie za pomocą kleszczyków, a następnie delikatnie przymocuj pierścień blokujący z powrotem do wkładu, zabezpieczając siatkę.</li>
	<li>Wyjmij uchwyt na wiele próbek z mikroskopu i przymocuj go do stacji transferowej. Umieść wkład z próbką w uchwycie za pomocą kleszczyków do wkładów i wycofaj uchwyt z obszaru załadunku, a następnie przenieś uchwyt na wiele próbek z powrotem do mikroskopu. 
	UWAGA: Patrz Chen i wsp.21 dla protokołu wizualnego szczegółowo opisanego w pkt 2.1–2.9.</li>
</ol>
3. Wysokowydajna zautomatyzowana kolekcja serii Tilt
<ol>
	<li>Kolekcja map w małym powiększeniu
	<ol>
		<li>Otwórz nowe okno Nawigatora, klikając 'Otwórz' w menu 'Nawigator' SerialEM10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)</li>
		<li>Znajdź kwadraty siatki, które zawierają akceptowalne warunki obrazowania (tj. cienki lód, brak zanieczyszczeń, przedmiot zainteresowania) za pomocą ekranu fluorescencyjnego przy małym powiększeniu (~2,300X dla próbki minikomórki). 
		UWAGA: [Opcjonalnie: Ten krok można zautomatyzować za pomocą SerialEM, montując całą siatkę, jednak szybsze może być po prostu ręczne wybranie kilku obszarów.]</li>
		<li>Dostosuj stolik do wysokości eucentrycznej, przechylając uchwyt próbki do 50°, a następnie wyreguluj wysokość z, aż przesunięcie stolika x-y między widokami pochylonymi i niepochylonymi będzie minimalne.</li>
		<li>Przejdź do środka kwadratu siatki i kliknij przycisk "Dodaj pozycje etapu" w oknie Nawigatora, aby zapisać aktualną pozycję etapu.</li>
		<li>Kontynuuj kroki 3.1.1-4 powyżej, aż wszystkie dopuszczalne pozycje etapu kwadratów siatki zostaną zapisane.</li>
		<li>Otwórz nowy plik montażowy MRC, klikając "Nowy montaż" w menu "Plik". W oknie dialogowym Ustawienia montażu, które się otworzy, wybierz liczbę elementów w X i Y, które zajmą cały kwadrat siatki (np. 10 x 10 dla standardowej siatki 200). Użyj wysokiego binowania, takiego jak 8, i wybierz przyciski radiowe "Przesuń scenę zamiast przesuwania obrazu" i "Pomiń korelacje używane do wyrównywania elementów".</li>
		<li>W oknie Nawigatora kliknij pozycję pierwszego etapu i ustaw ją do pobrania, zaznaczając pole wyboru 'Pobierz'. Powtórz tę czynność dla każdej pozycji etapu w oknie Nawigatora.</li>
		<li>Otwórz okno dialogowe Navigator Acquire, klikając "Acquire at Points" w menu "Navigator". Zaznacz pola wyboru "Pobierz obraz mapy" i "Przybliżona eucentryczność" i upewnij się, że wszystkie inne pola wyboru nie są zaznaczone. Kliknij "Kontynuuj", aby zebrać montaż w każdej pozycji etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja serii Tilt
	<ol>
		<li>W oknie Nawigatora wybierz jedną z pobranych map i kliknij przycisk "Załaduj mapę".</li>
		<li>W oknie Nawigatora kliknij przycisk 'Dodaj punkty' i wybierz punkty na mapie, w których chcesz uzyskać serię pochylenia. Następnie kliknij przycisk "Zatrzymaj dodawanie punktów". Powtórz te czynności dla każdej zebranej mapy.</li>
		<li>W menu Kamera wybierz "Parametry" i zdefiniuj parametry dla trybów Focus, Trial i Record. [Opcjonalnie: Dane frakcjonowane dawką można określić w parametrach dla trybu nagrywania.]</li>
		<li>Wybierz punkt w oknie Nawigatora i zaznacz pole wyboru 'Tilt-Series'. W oknie dialogowym Ustawienia serii pochylenia, które zostanie otwarte, wybierz żądane parametry dla kolekcji serii pochylania. Powtórz te czynności dla pozostałych zaznaczonych punktów w oknie Nawigatora, ale nie wybieraj map.</li>
		<li>W menu Nawigatora ponownie wybierz opcję "Zdobądź za punkty". W oknie dialogowym Navigator Acquire wybierz "Wyrównaj do elementu", "Autofokus" i "Szorstka eucentryczność" jako zadania wstępne, a następnie wybierz "Uzyskaj serię przechyłu" jako zadanie główne i wybierz "Zamknij zawory kolumny na końcu", aby zamknąć kolumnę, gdy wszystkie punkty zostaną zebrane. Po kontynuowaniu gry w każdym punkcie na każdej mapie zostanie zebrana seria tiltów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wysokowydajne zautomatyzowane przetwarzanie i rekonstrukcja serii przechyłów za pomocą Tomoauto
<ol>
	<li>Korekcja ruchu wywołanego wiązką w danych frakcjonowanych dawką [opcjonalnie] 
	UWAGA: Tomoauto używa MOTIONCORR22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) do usuwania ruchu wywołanego wiązką z mikrofotografii frakcjonowanych dawką. W systemie musi być zainstalowany NOTIONCORR16.
	<ol>
		<li>W przypadku oryginalnej serii tilt, dziennika wyjściowego z SerialEM10 i poszczególnych obrazów frakcjonowanych dawkowo, wszystkie w bieżącym katalogu roboczym, w terminalu wykonaj polecenie: 
		dose_fractioned_to_stack <filename.st> 
		<filename.st> to nazwa serii przechyłów do obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównanie i rekonstrukcja serii Tilt 
	UWAGA: Tomoauto domyślnie używa IMOD13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) do obsługi automatycznego generowania modeli powierniczych serii pochyleń, wyrównania, określania funkcji transferu kontrastu (CTF), korekcji CTF23 i rekonstrukcji. Alternatywnie, użytkownicy mają w tomoauto możliwość użycia RAPTOR24 (zawartego w IMOD) do automatycznego generowania modeli powierniczych, CTFFIND425 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) do określenia CTF i tomo3d26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) do rekonstrukcji lub w dowolnej kombinacji pakietów oprogramowania według konfiguracji. Ta konfiguracja, jak również parametry dostępne w każdym pakiecie, są obsługiwane przez globalny plik konfiguracyjny Można je edytować w celu dopasowania do wartości najczęściej używanych w laboratorium, podczas gdy lokalne pliki konfiguracyjne mogą być również tworzone w celu wyszczególnienia parametrów używanych dla określonej próbki, zestawu kolekcji lub poszczególnych serii pochylenia. Wszystkie pakiety, które chcą być używane, muszą być zainstalowane w systemie.
	<ol>
		<li>Z serią tilt w bieżącym katalogu roboczym, w terminalu wykonaj polecenie 
		tomoauto --CTF --mode=wyrównaj <filename.st> <fid_diam> 
		<filename.st> to seria pochylenia do przetworzenia, a <fid_diam> to średnica znaczników odniesienia w nanometrach. To polecenie automatycznie wyrówna i oszacuje CTF serii pochylenia. Możliwe jest pominięcie przetwarzania CTF poprzez usunięcie opcji --CTF z polecenia.</li>
		<li>Sprawdź wizualnie wyrównaną serię pochylenia pod kątem rażących błędów w przetwarzaniu wyrównania i sprawdź szacowany CTF, wykonując polecenia: 
		3dmod <nazwa_pliku>.ali 
		submfg <nazwa_pliku>_ctfplotter.com 
		odpowiednio, gdzie <nazwa_pliku> jest nazwą serii tilt bez sufiksu. Sprawdź również dane wyjściowe polecenia tomoauto, aby zobaczyć średni błąd resztkowy generowany przez wyrównanie, który jest ilościową statystyką jakości wyrównania.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę akceptowalne wyrównanie, kontynuuj przetwarzanie, wykonując polecenie: 
		tomoauto --CTF --mode=zrekonstruować <filename.st> <fid_diam> 
		z takimi samymi podstawieniami użytkowników, jak w 4.2.1. To polecenie poprawi CTF, usunie znaczniki odniesienia z serii tilt i obliczy rekonstrukcję. Również w tym przypadku przetwarzanie CTF można pominąć, jak w 4.2.1.</li>
		<li>[opcjonalnie] Aby pominąć etap oględzin i w pełni zautomatyzować przetwarzanie i rekonstrukcję, wykonaj polecenie 
		tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam></li>
		<li>[opcjonalnie] Aby użyć określonej konfiguracji lokalnej, zapoznaj się z dokumentacją tomoauto, aby dowiedzieć się, jak wygenerować lokalny plik konfiguracyjny, a następnie wykonaj polecenie 
		tomoauto [opcje]-L <local_config> <filename.st> <fid_diam> 
		gdzie <local_config> jest nazwą lokalnego pliku konfiguracyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Uśrednianie sub-tomogramu
UWAGA: Używamy pakietui3 15 (http://www.electrontomography.org/) do przetwarzania eksperymentów uśredniania sub-tomogramu, jednak opisany protokół ma ogólne zastosowanie do większości dostępnych pakietów oprogramowania do uśredniania sub-tomogramu16 do przetwarzania eksperymentów uśredniania sub-tomogramu, jednak opisany protokół ma zastosowanie ogólnie do większości dostępnych pakietów oprogramowania do uśredniania sub-tomogramu16-18.
<ol>
	<li>Mając zrekonstruowany tomogram w bieżącym katalogu roboczym, otwórz tomogram do zbierania cząstek, wykonując polecenie: 
	tomopick <nazwa_pliku>.rec 
	gdzie <nazwa_pliku> jest jak w 4.2.2. W oknie, które zostanie otwarte, użyj lewego przycisku myszy, aby kliknąć najpierw na korpus podstawowy, a następnie na końcówkę igły, aby wybrać iniekcję i użyj strzałek w górę iw dół, aby przejść przez plasterki tomogramu. W ten sposób należy zaznaczyć wszystkie widoczne inieksomy. Przechowuje on współrzędne w pliku tekstowym definiującym długą oś konstrukcji, a także estymując dwa z trzech kątów Eulera opisujących orientację konstrukcji.</li>
	<li>Wyodrębnij obliczeniowo 400 3 sześcianów wokseli z tomogramu wyśrodkowanego w środku zdefiniowanej długiej osi, wykonując polecenie: 
	clip resize -cx <x> -cy <y> -cz <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400 \ 
	<nazwa_pliku>.rec <nazwa_pliku>_001.mrc 
	gdzie <x>, <y>, <z> są współrzędnymi punktu środkowego struktury, a <nazwa_pliku> jest jak w 4.2.2. Rozmiar wyodrębnionego sześcianu powinien różnić się w zależności od struktury i użytego powiększenia oraz powinien być wystarczająco duży, aby odpowiednio objąć interesującą strukturę, która dla tej próbki wynosi 4003 wokseli.</li>
	<li>Próbkowanie w dół (pojemnik) subtomogramu czterokrotnie, aby skrócić czas obliczeń dla początkowego wyrównania, wykonując polecenie: 
	binvol -b 4 <nazwa_pliku>_001.mrc <nazwa_pliku>_001.bin4.mrc 
	gdzie <nazwa_pliku> jest jak w 5.2.</li>
	<li>Zastosuj wyznaczone kąty Eulera do sub-tomogramów i oblicz średnią globalną, aby utworzyć początkowy szablon, wykonując polecenie. 
	I3totsum.sh</li>
	<li>Wyrównaj i sklasyfikuj podtomogramy podpróbkowane w dół za pomocą binarnej maski klasyfikacyjnej obszaru cytoplazmatycznego. Wykonaj uśrednianie subtomogramowe w przestrzeni Fouriera, aby zminimalizować brakujące artefakty klinowe charakterystyczne dla tomografii. Do kategoryzacji 4 danych należy użyć SAMPFACT="4 4 4". 
	i3mramsacls.sh</li>
	<li>Powtórzyć krok 5.5, używając podtomogramów z próbkowaniem dwukrotnie (SAMPFACT="2 2 2") i ponownie z oryginalnymi danymi (SAMPFACT="1 1 1"). 
	i3mramsacls.sh</li>
</ol>

<ol><li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+III+secretion+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The type III secretion injectisome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).</li>
<li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li>
<li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li>
<li>Schraidt, O., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Salmonella%27s+needle+complex+at+subnanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution.</a> Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).</li>
<li>Hodgkinson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+Shigella+T3SS+transmembrane+regions+reveals+12-fold+symmetry+and+novel+features+throughout%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).</li>
<li>Kudryashev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+the+Yersinia+enterocolitica+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome.</a> eLife. 2, e00792(2013).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+distinct+structural+features+of+Salmonella+injectisome+and+flagellar+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body.</a> Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).</li>
<li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ-the+potential+of+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+structure+at+8.5%C3%85+resolution+using+cryo-electron+tomography+and+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging.</a> J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+tomography%3A+an+integrated+software+suite+for+real-time+electron+microscopic+tomographic+data+collection%2C+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt-series+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).</li>
<li>Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+subvolume+alignment+and+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).</li>
<li>Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Architecture+of+Axonemes+Revealed+by+Cryoelectron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+type+III+secretion+sorting+platform+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).</li>
<li>Iancu, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Cryoelectrontomography+of+Bacterial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTF+determination+and+correction+for+low+dose+tomographic+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series.</a> J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).</li>
<li>Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).</li>
<li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomo3D+2.0+%E2%80%93+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+%28AVX%29+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li>
<li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li>
<li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li>
<li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%3A+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda wysokoprzepustowa umożliwiła nam przetworzenie 1917 serii krio-tiltów i wyprodukowanie ponad 4500 subtomogram nienaruszonego inieksomu S. flexneri 19. Zebrane dane pozwoliły na szczegółową charakterystykę iniekcji in situ , w tym cytoplazmatycznego kompleksu sortującego. Metodę wykorzystano również do wizualizacji kilku zmutowanych komórek ze specyficzną delecją przypuszczalnych składników białkowych, co pomogło wyjaśnić skład platformy sortującej wstrzykiwacza. ...

Systemy sekrecji typu III (T3SS) są istotnymi determinantami wirulencji dla wielu patogenów Gram-ujemnych. Iniekcjon, znany również jako kompleks igieł, jest centralną maszyną T3SS wymaganą do bezpośredniej translokacji białek efektorowych z bakterii do eukariotycznych komórek gospodarza1, 2. Iniekcjon składa się z igły zewnątrzkomórkowej, ciała podstawnego i kompleksu cytoplazmatycznego, znanego również jako kompleks sortujący3. Wcześniejsze badania wyjaśniły struktury 3D oczyszczonych iniekcji z Salmonelli i Shigelli, wraz ze strukturami atomowymi głównych białek ciała podstawnego4, 5. Niedawne struktury in situ iniekcji z Salmonelli, Shigelli i Yersinia zostały ujawnione przez cryo-ET6, 7. Jednak kompleks cytoplazmatyczny, niezbędny do selekcji efektorów i składania igieł, nie został uwidoczniony w tych strukturach.
Cryo-ET jest najbardziej odpowiednią techniką do obrazowania maszynerii molekularnej w rozdzielczości nanometrowej w jej natywnym kontekście komórkowym (in situ). Niemniej jednak rozdzielczość osiągalna przez cryo-ET jest ograniczona przez grubość próbki. Aby przezwyciężyć tę wadę, zobrazowaliśmy nienaruszone inisomy w zjadliwym szczepie Shigella flexneri, który został genetycznie zmodyfikowany w celu wytworzenia minikomórek wystarczająco cienkich dla cryo-ET. Kolejnym ograniczeniem cryo-ET jest wrażliwość próbki na promieniowanie indukowane przez wiązkę elektronów, która bardzo szybko niszczy informacje o wysokiej rozdzielczości w próbce. W związku z tym dla poszczególnych obrazów nachylenia stosuje się bardzo niskie dawki, dzięki czemu odpowiednia dawka może być rozprowadzona między pełnymi seriami pochylenia. To znacznie obniża stosunek sygnału do szumu (SNR) w końcowej rekonstrukcji, co utrudnia odróżnienie cech strukturalnych obiektu od dużej ilości szumu w tomogramie i ogranicza rozdzielczość, którą można osiągnąć za pomocą cryo-ET. Konwencjonalne przetwarzanie obrazu, takie jak filtry Fouriera i filtry w przestrzeni rzeczywistej, a także próbkowanie w dół, mogą być używane do zwiększania kontrastu, ale kosztem odfiltrowywania większości informacji o wysokiej rozdzielczości. Ostatnio uśrednianie subtomogramowe umożliwiło znaczne zwiększenie SNR, a następnie końcowej rozdzielczości w niektórych przypadkach do poziomów subnanometrowych8, 9. Bardziej szczegółowa analiza kompleksów jest możliwa dzięki obliczeniowemu wyodrębnieniu tysięcy podtomogramów zawierających obszary zainteresowania z oryginalnych tomogramów, a następnie wyrównaniu i uśrednieniu podtomogramów w celu określenia in situ złożonych struktur o wyższym SNR i wyższej rozdzielczości. Metody te można zintegrować z podejściami genetycznymi, aby zapewnić jeszcze lepszy wgląd w zespoły makromolekularne i ich dynamiczne konformacje w natywnym kontekście komórkowym.
Ogólnie rzecz biorąc, dziesiątki, a nawet setki tysięcy sub-tomogram muszą być uśrednione, aby określić struktury o wysokiej rozdzielczości in situ. Pozyskanie wystarczającej liczby serii tilt-ów potrzebnych do wyprodukowania tak dużej liczby sub-tomogramów szybko staje się wąskim gardłem. Powstałe w ten sposób serie pochylenia są często narażone na przesunięcie wywołane wiązką, luz stopnia, a także wady powiększenia, obrotu i skośności, które muszą zostać rozwiązane, aby wyrównać serie pochylenia przed rekonstrukcją. Seria przechyłu jest zwykle wyrównywana przez śledzenie złotych znaczników odniesienia, które są tradycyjnie wybierane ręcznie poprzez kontrolę serii przechyłu, co powoduje kolejne wąskie gardło. Opracowano wiele pakietów oprogramowania do automatycznej akwizycji serii nachylenia za pomocą sterowanych komputerowo mikroskopów elektronowych10, 11, 12, wyrównywania i rekonstrukcji serii pochylenia13, 14 oraz subtomogramu o średniej15-18. Ponieważ pakiety te obsługują dyskretne operacje w przepływie pracy cryo-ET, pożądane staje się wbudowanie wyższego poziomu abstrakcji w proces, aby systematycznie usprawniać cały schemat w jednym potoku. W związku z tym opracowaliśmy bibliotekę opakowań oprogramowania "tomoauto" zaprojektowaną w celu zorganizowania wielu z tych pakietów w jedną półautomatyczną jednostkę, co pozwala na prostą obsługę użytkownika przy jednoczesnym zachowaniu pełnej konfiguracji każdego komponentu w sposób scentralizowany. Biblioteka jest open-source, dobrze udokumentowana, stale rozwijana i swobodnie dostępna do użytku, dostosowanego do potrzeb rozwoju lub dalszej integracji za pomocą internetowego zdalnego repozytorium kodu źródłowego (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Ten wysokoprzepustowy potok cryo-ET został wykorzystany do wizualizacji nienaruszonych iniekcji w minikomórkach S. flexneri. Tą metodą wygenerowano łącznie 1917 tomogramów, ujawniając strukturę in situ nienaruszonej maszyny, w tym cytoplazmatyczną platformę sortowania, określoną przez subtomogram wynoszącyśrednio 19. Wraz z modelowaniem molekularnym maszyn typu dzikiego i zmutowanego, nasza wysokowydajna linia produkcyjna zapewnia nową drogę do zrozumienia struktury i funkcji nienaruszonego iniekcyjnego w natywnym kontekście komórkowym.

<table><tbody><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Tyrptyczny bulion sojowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroporacji</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta 1 mm</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka kriogeniczna</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil (Mikroskopia elektronowa)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Urządzenie do wyładowywania jarzeniowego</td><td>Dostępna</td><td></td><td>własna komercyjna alternatywa</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&nbsp;</td><td>Używany w wewnętrznym urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego</td></tr><tr><td>Generator wysokiej częstotliwości</td><td>Produkty elektrotechniczne</td><td>BD-10A</td><td>stosowany w wewnętrznym urządzeniu do wyładowań jarzeniowych.&nbsp; UWAGA: To urządzenie generuje wysokie napięcia.</td></tr><tr><td>Kleszczyki wirówkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont (Nauki o Mikroskopii Elektronowej)</td><td>72705-D</td><td>Styl 5 Antymagnetyczna</td></tr><tr><td>koliodowa złota</td> Bibuła filtracyjna <td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Etan&nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Azot</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>Tłok</td><td>Dostępna</td><td></td><td>wewnętrzna alternatywa komercyjna Skrzynka</td></tr><tr><td>do przechowywania siatki kriogenicznej</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30 (300 KeV)</td></tr><tr><td>Urządzenie do bezpośredniego wykrywania Kamera</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatywy: UCSF Tomografia, Leginon, FEI Tomografia wsadowa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do korekcji ruchu wywołanej wiązką</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html wymaga >2 GB</td></tr><tr><td>oprogramowania</td> <td>do wyrównywania procesorów graficznych Nvidia z serii Tilt-Series</td><td></td><td>Alternatywy dla http://bio3d.colorado.edu/IMOD IMOD: XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>Automatyczne oprogramowanie do modelowania markerów referencyjnych</td><td>Alternatywy IMOD</td><td></td><td>: RAPTOR (zawarty w IMOD0 (do użytku w tomoauto)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do oznaczania CTF</td> Alternatywy <td>IMOD</td><td></td><td>: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Do użytku w tomoauto)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji serii Tilt</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatywy: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Protomo</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do automatycznego przetwarzania serii Tilt</td> Oprogramowanie do <td></td>zbierania cząstek <td>tomoauto</td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org Alternatywy: IMOD</td></tr><tr><td>Alternatywy dla oprogramowania do uśredniania objętości</td><td>i3</td><td></td><td>: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, http://.org</td></tr></tbody></table>

korzystanie z tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Krioelektronowa tomografia (Cryo-ET) to potężna trójwymiarowa (3-D) technika obrazowania do wizualizacji kompleksów makromolekularnych w ich naturalnym kontekście na poziomie molekularnym. Technika ta polega najpierw na zachowaniu próbki w jej naturalnym stanie poprzez szybkie zamrożenie próbki w szklistym lodzie, następnie zebranie serii mikrofotografii pod różnymi kątami przy dużym powiększeniu, a na koniec obliczeniową rekonstrukcję trójwymiarowej mapy gęstości. Zamrożona, uwodniona próbka jest niezwykle wrażliwa na wiązkę elektronów, dlatego mikrofotografie są zbierane przy bardzo niskich dawkach elektronów, aby ograniczyć uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. W rezultacie, surowy kriotomogram ma bardzo niski stosunek sygnału do szumu, charakteryzujący się z natury zaszumionym obrazem. Aby lepiej uwidocznić interesujące nas obiekty, stosuje się konwencjonalną analizę obrazową i uśrednianie subtomogramowe, w którym subtomogramy obiektu są ekstrahowane z początkowego tomogramu, a następnie wyrównywane i uśredniane, w celu poprawy zarówno kontrastu, jak i rozdzielczości. Duże zbiory danych szeregów nachylenia są niezbędne do zrozumienia i rozwiązania kompleksów w różnych stanach, warunkach lub mutacjach, a także do uzyskania wystarczająco dużej kolekcji podtomogramów do uśredniania i klasyfikacji. Gromadzenie i przetwarzanie tych danych może być poważną przeszkodą uniemożliwiającą dalszą analizę. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy protokół cryo-ET oparty na sterowanym komputerowo mikroskopie krioelektronowym 300 kV, kamerze urządzenia do bezpośredniej detekcji (DDD) oraz wysoce efektywnej, półautomatycznej bibliotece opakowań oprogramowania do przetwarzania obrazów tomoauto. Protokół ten został skutecznie wykorzystany do wizualizacji nienaruszonego systemu wydzielania typu III (T3SS) w minikomórkach Shigella flexneri. Może mieć zastosowanie do każdego projektu odpowiedniego dla cryo-ET.

Próbki minikomórek S. flexneri zostały pobrane i przetworzone zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1 przy użyciu programu tomoauto, zgodnie z procedurą szczegółowo opisaną na Rysunku 2. Serie pochyleń zebrano za pomocą oprogramowania SerialEM10, które umożliwia wysokoprzepustowe pozyskiwanie serii pochyleń w punktach wyznaczonych przez użytkownika na mapach montażowych o niskim powiększeniu (Rysunek 3...

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomoc użytkownikom w ustanowieniu wysokoprzepustowego potoku pozyskiwania i przetwarzania danych w krio-tomografii elektronowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie krio-tomografii elektronowej, takie jak: w jaki sposób obsługiwać dane zebrane za pomocą detektorów nowej generacji oraz jak przetwarzać ogromną ilość danych generowanych przez oprogramowanie do automatycznego zbierania serii przechyłów? Główną zaletą tej techniki jest możliwość ujednoliconej konfiguracji wielu pakietów oprogramowania w celu znalezienia wydajnego potoku automatycznego przetwarzania serii przechyłów, co pozwala poświęcić więcej czasu na analizę tomogramów.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z krio-ET napotykają trudności, ponieważ przetwarzanie ogromnych ilości danych generowanych przez mikroskop elektronowy wymaga wielu żmudnych czynności. Pomysł na opracowanie tej metody pojawił się u nas pięć lat temu, gdy musieliśmy ręcznie przejść przez setki etapów, aby uzyskać rekonstrukcję 3D jednej bakterii. Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznać się z protokołem tekstowym dotyczącym przygotowania minikomórek Shigella flexneri.Następnie należy przygotować siatki do mikroskopii elektronowej zgodnie z opisem w istniejącej publikacji JoVE oraz w protokole tekstowym. Po załadowaniu do uchwytu EM zestawu minikomórek zatopionych w witryfikowanym lodzie, należy rozpocząć zbieranie map o niskim powiększeniu dla serii pochyleń. Podczas obserwacji ekranu fluorescencyjnego przy niskim powiększeniu, wynoszącym około 2300x, należy zlokalizować pola siatki odpowiednie do obrazowania.W tym miejscu powinien znajdować się cienki lód oraz interesujący obiekt, bez zanieczyszczeń. Następnie wyśrodkuj widok w obrębie kwadratu siatki i kliknij przycisk Add Stage Position, aby zapisać tę lokalizację. Powtórz ten proces, aż zostaną zapisane lokalizacje wszystkich odpowiednich kwadratów siatki.Kolejny krok rozpoczyna się od otwarcia nowego pliku montażu. W oknie ustawień określ wartości X i Y w taki sposób, aby uchwycić cały kwadrat siatki. Dla standardowej siatki o oczkach 200 mesh utwórz obszar o wymiarach 10 na 10 z wysoką wartością Binningu, na przykład osiem.Włącz również opcję przesunięcia stolika zamiast przesunięcia obrazu oraz opcję pomijania korelacji używanych do dopasowania fragmentów. Następnie w oknie Nawigatora zaznacz pierwszą pozycję stolika do zarejestrowania za pomocą przełącznika Akwizycja. Powtarzaj tę czynność dla każdej kolejnej pozycji stolika.Następnie w menu Navigator kliknij Acquire at Points. W otwartym oknie dialogowym zaznacz opcje acquire map image oraz rough eucentricity. Odznacz wszystkie pozostałe opcje.Następnie kliknij przycisk proceed, aby dla każdej pozycji stopnia utworzyć montaż. Kontynuuj pracę w oprogramowaniu SerialEM. W oknie Navigator zaznacz pozyskane mapy i kliknij Load Map.Następnie kliknij Add Points i zaznacz na mapie punkty, w których należy zebrać serie przechyłów. Po dokonaniu wyboru kliknij Stop Adding Points i powtórz ten proces dla każdej zebranej mapy. Następnie otwórz parametry w menu Camera i ustaw tryby Focus, Trial oraz Record.Opcja rejestrowania danych z frakcjonowaniem dawki może być szczególnie istotna i można ją określić w opcjach rejestrowania (Record options). Aby kontynuować, należy wybrać jeden z punktów na aktualnie wyświetlanej mapie, a następnie aktywować opcję serii nachyleń (tilt-series) w oknie Nawigatora (Navigator). W otwartym oknie dialogowym należy wybrać parametry dla serii nachyleń.Następnie powtórz proces przełączania opcji tilt-series dla każdego z wybranych punktów na mapie. Następnie w oknie Navigator uruchom opcję Acquire at Points. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz opcje Preliminary Tasks, Realign to, Autofocus oraz rough eucentricity.Następnie ustaw Zadanie Główne (Primary Task) na pozyskiwanie serii pochyleń (acquire tilt-series) i wybierz opcję zamknięcia kolumny na końcu (close column vals at end), aby kolumna została zamknięta po zebraniu wszystkich punktów. Po uruchomieniu procesu w każdym punkcie zaznaczonym do pozyskiwania serii pochyleń na każdej mapie zostanie zebrana seria pochyleń. Mając oryginalną serię pochyleń, dziennik wyjściowy z programu SerialEM oraz poszczególne obrazy z frakcjonowaniem dawki w bieżącym katalogu roboczym, wykonaj w terminalu następującą komendę, aby usunąć artefakty ruchu wywołanego wiązką.Przejdź do wyrównania i rekonstrukcji serii pochyleń. Wpisz w terminalu polecenie tomoauto w następujący sposób. Do polecenia dołącz nazwę pliku serii pochyleń do przetworzenia, a następnie średnicę markerów w nanometrach.Jeśli przetwarzanie CTF nie jest wymagane, należy po prostu pominąć tę opcję w poleceniu. To polecenie stanowi główne zastosowanie programu tomoauto, umożliwiając użytkownikom wykonanie wszystkich procesów związanych z dopasowaniem serii pochyleń w jednej komendzie — co pierwotnie wymagało ręcznej interwencji użytkownika — co pozwala na szybkie tworzenie skryptów do przetwarzania wsadowego. Teraz, używając polecenia 3dmod, należy przejrzeć dopasowaną serię pochyleń pod kątem ewidentnych błędów.W tym miejscu filename to nazwa serii pochyleń bez rozszerzenia. Następnie należy sprawdzić oszacowaną funkcję przenoszenia kontrastu (CTF) za pomocą polecenia pokazanego tutaj. Ponownie, filename to nazwa serii pochyleń bez rozszerzenia.Należy również sprawdzić błąd resztkowy wyrównania w logu wyjściowym generowanym przez polecenie tomoauto. Jest to ilościowa miara ogólnej jakości wyrównania. Jeśli wyrównanie jest dopuszczalne, można przystąpić do obliczeń rekonstrukcji.Ta komenda służy do korekcji CTF oraz usunięcia markerów fiducjalnych użytych do wyrównania z serii pochyleń. Aby pominąć inspekcję wizualną i przejść bezpośrednio do rekonstrukcji, należy użyć tej komendy. Program Tomoauto oferuje wiele dostępnych opcji.Jedną z kluczowych możliwości jest uwzględnienie lokalnych konfiguracji opisanych w pliku pomocniczym, zgodnie z dokumentacją tomoauto. Należy wpisać nazwę tego pliku w oknie dialogowym wiersza poleceń, korzystając z opcji lokalnej konfiguracji przed dodaniem nazwy pliku serii pochyleń. Możliwość tworzenia lokalnych plików konfiguracyjnych jest najpotężniejszą funkcją programu tomoauto, która pozwala użytkownikom na pełną konfigurację każdego używanego polecenia, co umożliwia dostrojenie procesu wykonywania do specyficznych lub trudnych zestawów danych przy jednoczesnym zachowaniu zautomatyzowanego przetwarzania.W protokole testowym znajdują się dodatkowe instrukcje dotyczące przeprowadzania uśredniania subtomogramów. Zgodnie z opisanymi protokołami, za pomocą programu tomoauto wykonano dwie wyrównane serie przechyłów. Precyzyjne wyrównanie jest obliczane na podstawie modelu, który w sposób optymalny definiuje współrzędne markerów fiducjalnych.Przy 50 stopniach jedna seria pochyleń śledziła cząsteczki złota poprawnie, co wskazuje na dopuszczalne wyrównanie. Natomiast w przypadku drugiej serii pochyleń kilka punktów modelu, zaznaczonych na czerwono, odbiegało od odpowiadających im markerów złota, co pokazuje, że model nie zapewnił odpowiedniego wyrównania. Podczas gromadzenia serii pochyleń program tomoauto pomyślnie wyrównuje od 80 do 90% zebranych serii.Po rekonstrukcji końcowy tomogram stanowi trójwymiarową objętość obrazu próbki. Może ona zostać następnie wykorzystana do adnotacji komórkowych poprzez segmentację lub uśrednianie subtomogramów w celu uzyskania informacji o wyższej rozdzielczości na temat aparatury molekularnej wewnątrz próbki. Uśredniony subtomogram o rozdzielczości 2,7 nanometrów przyczepionej bakterii Shigella flexneri, zdeponowany w EMDB, wykazuje znaczną przewagę tej techniki nad obrazowaniem injectisomu w pojedynczym tomogramie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zbierać i przetwarzać dane z krioelektronowej tomografii za pomocą programów SerialEM i tomoauto w sposób zautomatyzowany i wysokoprzepustowy. Po opanowaniu ta technika pozwala na zebranie prawie 100 serii przechyłów w ciągu jednego dnia, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo, oraz wyrównanie serii przechyłów w 20 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze sprawdzać jakość wyrównania serii przechyłów.Jeśli zestaw serii pochyleń nie wyrównuje się prawidłowo, należy spróbować wyrównania ręcznego i przenieść parametry do konfiguracji lokalnej. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak uśrednianie subtomogramów, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. wyznaczenia struktury kompleksów makromolekularnych o wyższej rozdzielczości. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) do eksploracji wysokorozdzielczych struktur in situ w bakteriach, wirusach i innych organizmach.

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Poznaj protokół wysokowydajnej tomografii krioelektronowej z użyciem Tomoauto. Ta metoda automatyzuje przetwarzanie dużych zbiorów danych z detektorów nowej generacji, umożliwiając badaczom skupienie się na analizie biologicznej.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Przeglądaj więcej filmów