Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej
30 stycznia 2016
Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest pomoc użytkownikom w ustanowieniu wysokowydajnego procesu zbierania i przetwarzania tomografii krioelektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie tomorografii krioelektronowej, takie jak: jak obchodzić się z danymi zebranymi za pomocą detektorów nowej generacji i przetwarzać ogromne ilości danych generowanych przez zautomatyzowane oprogramowanie do zbierania serii pochylenia? Główną zaletą tej techniki jest to, że użytkownik może skonfigurować wiele pakietów oprogramowania w ujednolicony sposób, aby znaleźć wydajny potok do automatycznego przetwarzania serii przechyłu, co pozwala poświęcić więcej czasu na analizę tomogramu.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w cryo-ET będą miały trudności, ponieważ do obsługi ogromnych danych generowanych z mikroskopu elektronowego wymaganych jest wiele żmudnych kroków. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego rozwiązania pięć lat temu, kiedy musieliśmy ręcznie przejść przez setki kroków, aby uzyskać rekonstrukcję 3D jednej bakterii. Wcześniej należy zapoznać się z protokołem tekstowym dotyczącym przygotowania minikomórek Shigella flexneri.
Następnie należy przygotować siatki mikroskopii elektronowej zgodnie z wyjaśnieniami zawartymi w istniejącej publikacji JoVE, a także udokumentowanymi w protokole tekstowym. Po załadowaniu stolika EM kolekcją minikomórek osadzonych w zeszklonym lodzie, zacznij zbierać mapy o małym powiększeniu dla serii pochylenia. Patrząc na ekran fluorescencyjny przy małym powiększeniu, około 2300x, znajdź kwadraty siatki, które są akceptowalne do obrazu.
To miejsce powinno zawierać cienki lód i przedmiot zainteresowania bez zanieczyszczeń. Następnie dostosuj widok do środka kwadratu siatki i kliknij przycisk Dodaj pozycję sceny, aby zapisać lokalizację. Następnie powtarzaj proces, aż wszystkie dopuszczalne kwadraty siatki zostaną zapisane swojej lokalizacji.
Kolejny krok rozpoczyna się od otwarcia nowego pliku montażowego. W oknie dialogowym konfiguracji ustaw X i Y tak, aby przechwycony został cały kwadrat siatki. W przypadku standardowej siatki z 200 siatkami utwórz przestrzeń 10 na 10 z wysoką wartością kategoryzacji, na przykład osiem.
Przełącz także opcję przesuwania sceny zamiast przesuwania obrazu i opcję pomijania korelacji używanych do wyrównywania elementów. Teraz w oknie Nawigatora wybierz pozycję pierwszego etapu, która ma zostać uzyskana za pomocą przełącznika Nabierz. Kontynuuj to dla każdej pozycji etapu.
Następnie, w menu Nawigator, kliknij Zdobądź w punktach. W oknie dialogowym, które zostanie otwarte, przełącz opcję Uzyskaj obraz mapy i przybliżoną eucentryczność. Odłącz wszystkie inne opcje.
Następnie kliknij kontynuuj, a dla każdej pozycji etapu zostanie wykonany montaż. Kontynuuj pracę z oprogramowaniem SerialEM. W Nawigatorze wybierz pobrane mapy i kliknij Załaduj mapę.
Następnie kliknij Dodaj punkty i wybierz punkty na mapie, w których chcesz uzyskać serię pochylenia. Po dokonaniu wyboru kliknij przycisk Zatrzymaj dodawanie punktów i powtórz ten proces dla każdej zebranej mapy. Następnie otwórz parametry w menu Aparat i ustaw tryby Ostrość, Próba i Nagrywanie.
Szczególnie interesująca może być opcja rejestrowania danych frakcjonowanych dawką, którą można określić w opcjach nagrywania. Aby kontynuować, wybierz jeden z punktów na aktualnie wyświetlanej mapie i przełącz opcję serii pochylenia w oknie Nawigatora. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz parametry serii pochylenia.
Następnie powtórz proces przełączania opcji serii pochylenia dla każdego z wybranych punktów na mapie. Następnie z poziomu Nawigatora uruchom opcję Zdobądź w punktach. W oknie dialogowym przełącz opcje Zadania wstępne, Wyrównaj do elementu, Autofokus i przybliżona eucentryczność.
Następnie ustaw zadanie podstawowe, aby uzyskać serię pochylenia i wybierz pozycję zamknij wartości kolumny na końcu, aby zamknąć kolumnę, gdy wszystkie punkty zostaną zebrane. Gdy proces zostanie wykonany, seria pochylenia zostanie zebrana w każdym punkcie przełączonym na zbieranie serii pochylenia na każdej mapie. Z oryginalną serią pochylenia, dziennikiem wyjściowym z SerialEM i pojedynczymi obrazami frakcjonowanymi dawką, wszystkie w bieżącym katalogu roboczym, w terminalu, wykonaj następujące polecenie, aby usunąć artefakt ruchu wywołany wiązką.
Przystąp do wyrównywania i rekonstrukcji serii pochyleń. Wpisz polecenie tomoauto w terminalu w następujący sposób. Do polecenia dołącz nazwę pliku serii tilt do przetworzenia, a następnie średnicę odniesienia w nanometrach.
Jeśli przetwarzanie CTF nie jest pożądane, po prostu pomiń tę opcję w poleceniu. To polecenie jest głównym zastosowaniem tomoauto, umożliwiając użytkownikom wykonywanie wszystkich procesów związanych z wyrównywaniem serii pochylenia, które pierwotnie wymagały ręcznej interwencji użytkownika, w jednym poleceniu, umożliwiając użytkownikom szybkie skryptowanie przetwarzania wsadowego. Teraz, korzystając z polecenia 3dmod, przejrzyj wyrównaną serię pochyleń pod kątem rażących błędów.
Tutaj nazwa pliku jest nazwą serii tilt bez sufiksu. Następnie sprawdź szacowany CTF za pomocą polecenia pokazanego tutaj. Ponownie, filename jest nazwą serii tilt-series bez sufiksu.
Ponadto w dzienniku wyjściowym utworzonym przez polecenie tomoauto sprawdź błąd resztkowy wyrównania. Jest to ilościowa miara ogólnej jakości osiowania. Jeśli wyrównanie jest akceptowalne, przystąp do obliczania rekonstrukcji.
To polecenie jest ustawione w celu poprawienia CTF i usunięcia znaczników odniesienia używanych do wyrównania z serii pochylenia. Aby pominąć oględziny i przejść bezpośrednio do rekonstrukcji, użyj tego polecenia. Tomoauto ma wiele dostępnych opcji.
Jedną z nich jest w szczególności możliwość dołączania lokalnych konfiguracji opisanych przez plik pomocniczy, zgodnie z dokumentacją tomoauto. Dołącz nazwę tego pliku w oknie dialogowym wiersza poleceń, korzystając z opcji konfiguracji lokalnej przed dołączeniem nazwy pliku serii tilt. Możliwość tworzenia lokalnych plików konfiguracyjnych jest najpotężniejszą funkcją tomoauto, pozwalającą użytkownikom w pełni skonfigurować każde użyte polecenie, dostrajając wykonanie do określonych lub trudnych zestawów danych przy zachowaniu automatycznego przetwarzania.
W protokole testowym znajdują się dodatkowe instrukcje dotyczące wykonywania uśredniania subtomogramu. Zgodnie z opisanymi protokołami, wykonano dwie wyrównane serie pochylenia z tomoauto. Dokładne wyrównanie jest obliczane na podstawie modelu, który idealnie definiuje współrzędne znacznika odniesienia.
Pod kątem 50 stopni jedna z serii nachyleń prawidłowo śledziła cząsteczki złota, wskazując akceptowalne wyrównanie. Natomiast w przypadku drugiej serii uchylnej kilka punktów modelu, zaznaczonych na czerwono, odbiegało od odpowiadającego im złotego znacznika, co ilustrowało model, co nie powodowało odpowiedniego wyrównania. Po zebraniu serii przechyłu, tomoauto z powodzeniem wyrównuje 80 do 90% zebranych serii przechyłu.
Po rekonstrukcji końcowym tomogramem jest objętość 3D próbki obrazu. Można to następnie wykorzystać do adnotacji komórkowej przez segmentację lub uśrednianie subtomogramu w celu uzyskania informacji o maszynerii molekularnej w próbce w wyższej rozdzielczości. Średnia z 2,7 nanometra subtomogramu dołączonego Shigella flexneri zdeponowanego w EMDB pokazuje dużą poprawę tej techniki w porównaniu z oglądaniem iniekcji na pojedynczym tomogramie.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać i przetwarzać dane z tomografii krioelektronowej za pomocą SerialEM i tomoauto w zautomatyzowany, wysokowydajny sposób. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do zebrania prawie 100 serii przechyłu w ciągu dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, i wyrównania serii przechyłu w ciągu 20 minut. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zawsze sprawdzać jakość wyrównania serii pochylenia.
Jeśli zestaw serii pochyleń nie jest dobrze wyrównany, spróbuj wyrównać ręcznie i przenieś parametry do konfiguracji lokalnej. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak uśrednianie subtomogramu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie struktury kompleksów makromolekularnych o wyższej rozdzielczości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się krio-elektromagnetycznym do badania struktur in situ o wysokiej rozdzielczości w bakteriach, wirusach i innych organizmach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę krioelektronowej tomografii służącą do wyznaczania wysokorozdzielczych struktur maszyn molekularnych in situ. Usprawnia ona przetwarzanie danych, minimalizuje wąskie gardła i skraca przestoje w wykorzystaniu zasobów, co pozwala badaczom skoncentrować się na istotnych zagadnieniach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krio-elektronowa tomografia
- Biologia molekularna
- Biologia strukturalna
Wstęp
- Wysokoprzepustowy potok zbierania i przetwarzania danych dla krio-tomografii elektronowej.
- Wyzwania związane z obsługą danych z detektorów nowej generacji.
- Potrzeba wydajnego przetwarzania dużych zbiorów danych pochodzących z zautomatyzowanego zbierania serii pochyleń.
- Kontekst historyczny ręcznego przetwarzania danych w krio-ET.
Cel badania
- Ustanowienie usprawnionego protokołu krio-tomografii elektronowej.
- Ułatwienie zautomatyzowanego przetwarzania danych z serii pochyleń.
- Zwiększenie wydajności analizy tomogramów.
Zastosowane metody
- Protokół wysokoprzepustowej krioelektronowej tomografii.
- Konfiguracja wielu pakietów oprogramowania do przetwarzania danych.
- Techniki zautomatyzowanego zbierania serii obrazów pod różnymi kątami nachylenia.
- Przygotowanie minikomórek Shigella flexneri do analizy.
Główne wyniki
- Ograniczenie liczby żmudnych kroków wymaganych do obsługi danych.
- Zwiększenie wydajności przetwarzania dużych zbiorów danych.
- Większe skupienie na pytaniach biologicznych dzięki usprawnionemu procesowi pracy.
- Skuteczne zastosowanie protokołu w generowaniu rekonstrukcji 3D.
Wnioski
- Protokół ten znacząco upraszcza proces krioelektronowej tomografii.
- Pozwala on badaczom poświęcić więcej czasu na analizę niż na przetwarzanie danych.
- Przyszłe zastosowania mogą jeszcze bardziej pogłębić naszą wiedzę na temat maszyn molekularnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa kriotomografia elektronowa eliminuje wąskie gardło w przetwarzaniu danych biologii strukturalnej, umożliwiając szybkie generowanie trójwymiarowych kompleksów makromolekularnych w natywnym kontekście komórkowym. Dzięki automatyzacji zbierania i dopasowywania serii obrazów pod różnymi kątami, metoda ta ogranicza konieczność ręcznej interwencji i przyspiesza procesy walidacji celów na wczesnym etapie odkrywania. Wspiera to pewność prognostyczną w zakresie mitygacji ryzyka mechanistycznego w programach ukierunkowanych na cele przeciwdrobnoustrojowe i czynniki wirulencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bi farmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia wizualizację nienaruszonych maszyn makromolekularnych, takich jak systemy sekrecji typu III, w stanach zbliżonych do naturalnych w celu funkcjonalnej analizy celów.
- Wartość operacyjna: Skraca czas poświęcany na ręczną obsługę danych, pozwalając naukowcom skupić się na testowaniu hipotez biologicznych zamiast na wąskich gardłach przetwarzania danych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie średnich z subtomogramów, co poprawia kontrast i rozdzielczość, umożliwiając wiarygodne fenotypowanie strukturalne celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje gromadzenie i przetwarzanie danych za pomocą tomoauto, co zapewnia powtarzalne wyniki dla dużych zbiorów danych w celu przygotowania do analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: dostarcza rekonstrukcji 3D o rozdzielczości ~2,7 nm, co wspiera mechanistyczne zrozumienie kompleksów wirulencji w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez generowanie mierzalnych danych strukturalnych służących do priorytetyzacji celów terapeutycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – dostarczając wysokorozdzielcze informacje strukturalne na temat kompleksów makromolekularnych in situ.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację kompleksów makromolekularnych w natywnych środowiskach komórkowych.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki zautomatyzowanemu przetwarzaniu serii przechyłów oraz ilościowym metrykom jakości dopasowania.
- Analityka: Dostarcza pomiary błędów resztkowych z logów wyjściowych programu tomoauto jako obiektywne wskaźniki jakości dopasowania, służące do podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy dane strukturalne z postępami w badaniach przedklinicznych poprzez rozstrzyganie struktury kompleksów w stanach zmutowanych lub warunkowanych na potrzeby projektowania sterowanego strukturą.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku, konfigurowalny rurociąg przetwarzania danych za pomocą lokalnych plików konfiguracyjnych w programie tomoauto, co zapewnia spójność zastosowań dla różnych celów i zbiorów danych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji punktów uchwytu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki obrazowaniu in situ o wysokiej rozdzielczości.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność, umożliwiając wykonanie prawie 100 serii pochyleń na dobę i wyrównanie w czasie ok. 20 minut na serię.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych danych strukturalnych na wczesnym etapie procesu odkrywania, co redukuje ryzyko biologiczne w późniejszych fazach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację punktów uchwytu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o rozdzielcze stany strukturalne i złożoną dynamikę.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie krio-mikroskopii elektronowej, obsługi oprogramowania SerialEM oraz przetwarzania wiersza poleceń tomoauto.
- Metoda jest zależna od dostępu do krio-TEM o napięciu 300kV z kamerą bezpośredniej detekcji oraz infrastruktury obliczeniowej do wyrównywania i rekonstrukcji serii pochyleń.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania siatek, nazewnictwa danych oraz lokalnych plików konfiguracyjnych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójności przetwarzania.
- Należy uwzględnić adaptacje do różnej grubości lodu, zanieczyszczeń próbek oraz znakowania markerów fiducjalnych w różnych systemach modelowych.
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak skuteczność wyrównywania na poziomie 80–90% dla zebranych serii pochyleń, co wymaga ręcznej korekty w przypadkach nieudanych.
