Metoda kwantyfikacji guza oparta na bioluminescencji do monitorowania progresji guza i efektów leczenia w modelach chłoniaka myszy

Ogólnym celem tej procedury obrazowania jest standaryzacja procedur akwizycji bioluminescencji oraz analiz obrazów w celu uzyskania danych ilościowych do porównania w obrębie jednego lub między różnymi eksperymentami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania bioluminescencyjnego, takie jak: w jaki sposób można w sposób powtarzalny ilościowo określić dane obrazowe? Głównymi zaletami tej techniki są łatwość wdrożenia w każdym animalarium dysponującym obrazownikiem bioluminescencyjnym oraz brak konieczności wykonywania złożonych obliczeń.

Włącz urządzenie do obrazowania i otwórz oprogramowanie do akwizycji. Kliknij Initialize, aby zainicjalizować kamerę, stoliki i obiektywy. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez brak reakcji na uszczypnięcie w łapę, umieść mysz na podgrzewaczu i zastosuj maść do oczu.

Następnie, używając igły o rozmiarze 25 G, wstrzyknij 100 µL świeżo przygotowanego roztworu soli potasowej D-lucyferyny do jamy otrzewnej. W tym przypadku komórki nowotworowe wykazują ekspresję lucyferazy świetlikowej. Białko to utlenia D-lucyferynę, wytwarzając światło, które może zostać wykryte przez obrazujący system obrazowania.

Po 10 minutach umieść mysz w pozycji brzusznej w urządzeniu obrazującym, tak aby grzbiet był skierowany w stronę kamery i znajdował się w pozycji jak najbardziej płaskiej. Wybierz funkcję automatycznej ekspozycji i kliknij Acquire, aby uzyskać obraz zwierzęcia od strony tylnej. Następnie ułóż mysz w pozycji grzbietowej, rozszerzając kończyny przednie tak, aby nie zasłaniały klatki piersiowej.

Upewnij się, że pole wyboru automatycznej ekspozycji (auto exposure) jest nadal zaznaczone i wykonaj obraz przedniej części ciała zwierzęcia. Następnie umieść mysz z powrotem na podgrzewaczu, aż do pełnego wybudzenia, po czym zwierzę można przenieść do klatki. Aby przeprowadzić kwantyfikację bioluminescencji, kliknij View w menu i wybierz Tool Palette, jeśli nie jest ono jeszcze wyświetlane.

Następnie kliknij kartę narzędzia obszaru zainteresowania, wybierz przycisk konturu i zaznacz opcję Free Draw. Używając narzędzia Free Draw, obrysuj krawędzie całej myszy lub konkretnego obszaru na obrazie widoku przedniego, aby zaznaczyć obszar zainteresowania, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zamknąć kontur. Jeśli nie jest to jeszcze zaznaczone, wybierz Radiance w rozwijanym menu jednostek w lewym górnym rogu obrazu.

Następnie odczytaj wartość w polu Total Flux photons per second, aby zmierzyć strumień fotonów. Potem kliknij menu View i wybierz region of interest measurements. Po powtórzeniu analizy dla obrazu z widoku tylnego, zsumuj wartości strumienia fotonów uzyskane dla obu widoków, aby otrzymać luminoscore.

W tym eksperymencie guz był wykrywalny już 10 minut po wstrzyknięciu. Same obrazy potwierdzają obecność komórek nowotworowych w odpowiedniej lokalizacji. Jednakże ilościowa ocena bioluminescencji wykazała wyraźną różnicę między zwierzętami, którym podano wstrzyknięcia, a tymi, które go nie otrzymały.

Co ciekawe, sygnał uzyskany w modelu podskórnym był 100 razy wyższy niż w pierwotnym modelu chłoniaka wewnątrzgałkowego, co było zgodne z liczbą wstrzykniętych komórek. Tutaj reprezentatywne obrazy wzrostu guza u myszy z pierwotnym chłoniakiem wewnątrzgałkowym w grupie kontrolnej i leczonej CpG pokazują, że po odpowiednim czasie w grupie kontrolnej zaczynają pojawiać się przerzuty. Choć guz pierwotny nie wydawał się wrażliwy na leczenie, w grupie leczonej CpG zaobserwowano mniej przerzutów.

Rzeczywiście, analiza ilościowa obciążenia nowotworowego w każdej grupie wykazuje, że CpG spowalnia rozwój guza, powodując statystycznie istotną różnicę w luminescencji nowotworu pomiędzy grupami leczonymi a kontrolnymi po 28 dniach. W tym modelu podskórnym po każdej stronie myszy wszczepiono dwa guzy, przy czym leczenie podano in situ po jednej stronie w dniu zerowym, a guz po stronie przeciwległej służył jako kontrola. Następnie dla każdej myszy wyznaczono dwa obszary zainteresowania i zmierzono stosunek wskaźnika luminescencji (luminoscore) po stronie leczonej i kontrolnej.

13 dni po podaniu leku zaobserwowano znaczny spadek stosunku luminoscore, co wskazuje na resorpcję leczonego guza, co dodatkowo potwierdzają odpowiadające mu obrazy bioluminescencyjne. Po podaniu preparatu analiza ta może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch minut na zwierzę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak jakościowe określenie lokalizacji guza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów homingu lub przerzutowania komórek nowotworowych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom i dziedzinie obrazowania bioluminescencyjnego do badania progresji nowotworów w przedklinicznych modelach małych zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić obrazowanie bioluminescencyjne w celu powtarzalnego ilościowego oznaczenia obciążenia nowotworowego. Proszę pamiętać, że praca z małymi zwierzętami i narzędziami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak prawidłowa sterylizacja narzędzi.