Dostarczanie za pośrednictwem fagów ukierunkowanych konstruktów sRNA w celu obniżenia ekspresji genów u E. coli

Ogólnym celem tej procedury jest zniszczenie genów będących przedmiotem zainteresowania w rosnącej populacji E. coli. Knockdowny genów są często wykorzystywane do badania podstawowych pytań dotyczących funkcji genów. Metody te mogą mieć również zastosowanie w biologii syntetycznej.

Na przykład w wyciszaniu niechcianych genów, takich jak czynniki wirulencji. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonywać w hodowlach okresowych E. coli bez wcześniejszej modyfikacji genetycznej, a wyniki można zaobserwować już po kilku godzinach. Aby rozpocząć, używając plazmidu zawierającego kasetę ekspresji sRNA zaprojektowaną zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na sekwencję, najpierw identyfikując sekwencję prowadzącą 24 par zasad w kasecie ekspresji.

Zaprojektuj i zsyntetyzuj startery do przodu i do tyłu z krótkimi obszarami homologii do istniejącej kasety sRNA, flankując nową sekwencję prowadzącą z 24 parami zasad. Przygotuj pięciomililitrową kulturę E. coli w LB i antybiotyków przenoszących matrycowy fagemid ekspresji sRNA. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem.

Po wyekstrahowaniu i oczyszczeniu matrycy fagimida sRNA z hodowli należy przygotować dwie reakcje PCR, używając od 10 do 50 razy więcej niż zalecana ilość matrycy DNA dla fagi sRNA i polimerazy o wysokiej wierności. Przygotuj jedną reakcję ze starterem do przodu, a drugą ze starterem wstecznym. Po użyciu standardowych warunków PCR do przeprowadzenia reakcji, połącz obie reakcje w probówce mikrowirówkowej.

Następnie wyżarzaj produkty poprzez podgrzanie do 98 stopni Celsjusza we wrzącej kąpieli wodnej. Natychmiast wyłącz źródło ciepła i pozwól kąpieli powoli powrócić do temperatury pokojowej w ciągu następnej godziny do dwóch. Aby wyeliminować niezmutowaną matrycę sRNA, dodaj jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego DpnI do mieszaniny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę lub przez czas zalecany przez producenta do całkowitego roztrawienia.

Następnie przekształć chemicznie kompetentne komórki E. coli za pomocą jednego do pięciu mikrolitrów wyżarzonego produktu PCR. Następnie wyizoluj pojedyncze kolonie przez selektywne posiew na płytkach LB z antybiotykami. Aby sprawdzić, czy prawidłowa sekwencja prowadząca jest włączona do PCR kolonii.

Użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zebrać niewielką ilość komórek z pojedynczej przekształconej kolonii. Dodaj zebrane komórki do 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrowirówek i wymieszaj przez pipetowanie. Następnie za pomocą termocyklera stacjonarnego lub wrzącej łaźni wodnej poddaj komórki lizie, podgrzewając je do 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Używając jednego mikrolitra zlizowanych komórek jako matrycy DNA, przeprowadź PCR zgodnie z przedstawionymi tutaj warunkami. Po zweryfikowaniu prawidłowej sekwencji prowadzącej, zaszczep pięciomililitrową kulturę odpowiednim klonem sRNA i hoduj komórki przez noc. Następnego dnia przygotuj bulion glicerolowy, łącząc 750 mikrolitrów nocnej kultury z 250 mikrolitrami 60% glicerolu w krioprobówce z zakrętką.

Aby przygotować zapasy fagów w opakowaniu M13, przygotuj pięciomililitrową nocną hodowlę E. coli, przenoszącą fagemid wyrażający sRNA. Przygotuj również pięciomililitrową nocną hodowlę E. coli, przenoszącą plazmid pomocniczy M13KO7. Następnego dnia, po oczyszczeniu DNA, należy przetransformować chemicznie kompetentną E. coli z jednym mikrolitrem każdego z fagów ekspresyjnych sRNA i plazmidu pomocniczego.

Płytka na LB-agarze z antybiotykami do wyboru dla obu konstruktów. Ekspresja fagimidu jest dużym obciążeniem dla komórek i może powodować obniżenie wydajności transformacji. Może być konieczne wprowadzenie plazmidu w dwóch sekwencyjnych etapach transformacji.

Po inkubacji przekształconych komórek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przygotuj 10-mililitrową kulturę z pojedynczej kolonii współprzekształconego szczepu. Następnego ranka odwirować kulturę o stężeniu 3300 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant i przefiltrować przez filtr 0,2 mikrona.

Przechowywać zapakowany filtrat fagowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu komórek docelowych F +, zgodnie z protokołem tekstowym, zaszczepij pojedynczą kolonię w pięciomililitrowej kulturze pożywki LB z antybiotykami i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Następnego dnia użyj pięciu mililitrów selektywnej pożywki LB, aby rozcieńczyć komórki docelowe F + od jednego do stu i kontynuuj inkubację.

Hoduj komórki przez około dwie godziny, aż do uzyskania OD600 0,3, co wskazuje na wzrost w fazie logarytmicznej. Komórki przeznaczone do wyciszenia powinny znajdować się w fazie wykładniczej, gdy ekspresja pilusa F milczy w celu skutecznego zakażenia fagenami. Dodaj stosunek fagów w upakowaniu M13 do stu do komórek docelowych, aby osiągnąć prawie 99% infekcję populacji docelowej.

Pozwól, aby infekcja postępowała w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 30 do 60 minut. Następnie oznacz fenotyp wyciszający sRNA zgodnie z potrzebami. Zgodnie z protokołem pokazanym w tym filmie, kaseta wyciszająca sRNA plazmidu pAB.

001 został zmieniony na cel na mKate2. Rysunek ten pokazuje, że szczep E. coli zakażony fagimidem anty-mKate2 nie wykazywał wykrywalnej fluorescencji mKate2 na tle. Szczep ten wykazywał jednak ekspresję GFP, co wskazuje na udane wchłanianie fagemidu.

W tym eksperymencie szczep E. coli z chromosomalnie zintegrowaną acetylotransferazą chloramfenikolu lub genem CAT został zakażony fagimidem ukierunkowanym na CAT i przetestowano wyciszanie sRNA oporności na chloramfenikol. Komórki, w których fagamid był ukierunkowany na CAT, wykazywały zmniejszoną przeżywalność przy niskich stężeniach chloramfenikolu i prawie 99% zabijanie przy wyższych stężeniach. Z drugiej strony, niezakażone komórki lub komórki zakażone sRNA, które wyciszyły mKate2, były odporne na chloramfenikol we wszystkich badanych stężeniach.

Jak wykazano tutaj, dodanie ampicyliny, używanej do selekcji tylko bakterii przenoszących fagimid, zmniejszyło przeżywalność chloramfenikolu do niewykrywalnych poziomów. Zmiana docelowego genu sRNA i wytworzenie zakażonego fagimidu może być wykonane w ciągu pięciu dni. Nie zapominaj, że praca z fagami może być niezwykle niebezpieczna dla innych eksperymentów w laboratorium, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dedykowanego sprzętu laboratoryjnego, aby uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować, klonować i produkować zakażone fagi, niosące sRNA, aby powalić dowolny gen zainteresowania w aktywnie rosnącej populacji E. coli.