DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną
27 stycznia 2016
Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.
Ogólnym celem tego protokołu jest wykrycie sekwencji genomowego DNA związanych z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania w komórkach zwierzęcych poprzez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad organizacją jądra i transkrypcją lub regulacją w komórkach ssaków, takie jak identyfikacja regionów genomu związanych z amyloidem jądrowym lub z określonymi czynnikami transkrypcyjnymi. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości zapewnia wyższą rozdzielczość niż oryginalny zasób DamID, przy użyciu mikromacierzy DNA, oraz że technika ta umożliwia analizę krzyżową z naszymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
.Procedurę zademonstruje Brennan Olson, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć, postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby sklonować interesujący nas gen do wektora DamID. Następnie wygeneruj stada lentiwirusa wykazujące ekspresję DamV5 POY i V5-Dam za pomocą systemu ekspresji lentiwirusa.
Kotransfekcja wektora DamID z plazmidami opakowaniowymi lentiwirusa zgodnie z procedurą transfekcji do przodu zgodnie z protokołem producenta. Pamiętaj, aby uwzględnić etap filtracji przy użyciu filtra PVDF o temperaturze zerowej cztery pięć mikronów. Teraz przygotuj się do zainfekowania komórek lentiwirusem.
Dzień wcześniej przełóż przylegające komórki na płytkach sześciodołkowych. Kontynuuj stosowanie antybiotyków. Celem jest uzyskanie 50% konfluencji następnego dnia dla infekcji.
Następnego dnia wyjmij zamrożone supernatanty lentiwirusowe DamV5 POY i V5-Dam z zamrażarki i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozmrożenia. Na płytkach hodowlanych usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją pół mililitrem świeżej pożywki wzrostowej bez antybiotyków. Następnie załaduj do studzienek mililitr rozmrożonego lentiwirusa.
Załaduj dwie studzienki V5-Dam, dwie studzienki DamV5 POY i dwie studzienki bez lentiwirusa jako kontrolę negatywną. Zamieszać roztwór na komórkach i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora. 24 godziny później zastąp zawiesiny wirusa na komórkach dwoma mililitrami pożywki wzrostowej bez antybiotyków.
Następnie kontynuuj inkubację przez kolejne 48 godzin. Dwa dni później zakończ ten proces, postępując zgodnie z protokołem tekstowym, aby wyizolować genomowe DNA, co powinno zająć około godziny. Następnie amplifikuj fragmenty metylowanego DNA z adeniny z genomowego DNA.
Proces ten trwa około dwóch do trzech dni, a szczegóły są omówione w protokole tekstowym. W tej procedurze najpierw należy fragmentować amplifikowane metylowane adeninowe DNA. Przed użyciem fragmentazy DNA ważne jest, aby najpierw zmierzyć jej siłę, aby określić odpowiedni czas trawienia.
Do tego testu diagnostycznego należy użyć wszelkich dostępnych oczyszczonych produktów metylowej PCR. Zacznij od ustawienia głównej mieszanki składającej się z sześciu mikrogramów DNA, 12 mikrolitrów buforu 10X Fragmentazy i napełnij ją wodą do 114 mikrolitrów. Następnie wiruj bulion Fragmentazy przez trzy sekundy i dodaj sześć mikrolitrów do mieszanki głównej, co daje łącznie 120 mikrolitrów.
Następnie wiruj mieszankę mistrzowską przez trzy sekundy. Teraz napełnij pięć probówek reakcyjnych 20 mikrolitrowymi porcjami mieszanki wzorcowej i inkubuj wszystkie sześć probówek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń jedną probówkę po pięciu minutach i dodaj pięć mikrolitrów EDTA, aby zatrzymać reakcję.
Rób to co 10 minut, aż wszystkie probówki reakcyjne zostaną zebrane. Teraz przeanalizuj 12 przecinków i pięć mikrolitrów z każdej probówki, co odpowiada około pół mikrograma DNA i taką samą ilość niestrawionego DNA na żelu agorozowym. Na podstawie żelu określ minimalny czas potrzebny do strawienia większości rozmazu do około punktu zerowego dwóch kilozasad.
Użyj tego jako maksymalnego czasu trawienia. Teraz ustaw rzeczywistą fragmentację, taką jak test wstępny, i zatrzymaj trawienie w sześciu równomiernie rozmieszczonych punktach czasowych, w tym pięciu minutach, i oblicz maksymalny czas. Po mineralizacji wyciągnij sześć składników trawienia i oczyść je za pomocą zestawu do oczyszczania PCR lub odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej.
Rozcieńczyć oczyszczone DNA w około 15 mikrolitrach buforu EB. Kolejne kroki to naprawa końców rozdrobnionego DNA, dodanie nawisów adeninowych, ligada na adapterach sekwencjonowania i przekształcenie adapterów w kształcie litery Y w dwuniciowe DNA. Wszystkie te kroki są szczegółowo opisane w protokole tekstowym i nie powinny zająć więcej niż dwa dni.
Po ligastacji adapterów sekwencjonowania do fragmentarycznego DNA i przekształceniu adapterów w kształcie litery Y na dwuniciowe DNA, wybierz fragmenty o pożądanym rozmiarze. Zacznij od przygotowania dwuprocentowego żelu agorozyjnego w TAE i, zachowując środki ostrożności, dodaj bromek etydyny do końcowego stężenia 500 nanogramów na mililitr. Zrób wystarczająco dużo pasów, aby wszystkie próbki i dwie drabiny były otoczone pustymi pasami.
Teraz dodaj osiem mikrolitrów barwnika ładującego do 10 mikrolitrów każdego eluatu DNA i przygotuj drabinę 1 Kb Plus z 6-krotnym barwnikiem ładującym i wodą w stosunku jeden do jednego do czterech. Następnie załaduj pasy żelu w następującej kolejności: drabinka DNA, eluacje DNA i kolejna drabinka DNA. Po załadowaniu uruchom żel pod napięciem 120 woltów na 60 minut.
Później załóż okulary ochronne i osłonę twarzy, aby przez chwilę zobaczyć żel ze światłem UV. Sprawdź drabinki DNA, aby zobaczyć, czy żel wyczerpał się wystarczająco daleko, aby można było wyciąć trzy plasterki żelu od 300 do 400 par zasad. Następnie wytnij pasma od 300 do 400 par zasad z każdej linii, zawsze używając nowego ostrza dla każdej linii.
Usuń jak najmniej żelu, aby każdy plasterek żelu miał idealnie mniej niż 100 mikrolitrów i przenieś go do własnej probówki do mikrofuge. Następnie wyekstrahuj DNA z plastrów żelu zgodnie z protokołem tekstowym. Kontynuuj postępowanie zgodnie z protokołem tekstowym, aby dowiedzieć się, jak wzbogacić zmodyfikowane fragmenty adaptera sekwencjonowania z wyekstrahowanego DNA.
Następnie uzyskaj wysokiej jakości analizę oczyszczonego DNA za pomocą bioanalizatora, a jeśli spełnia oczekiwania, prześlij je do sekwencjonowania. Lentiwirusy zostały zmodyfikowane w taki sposób, aby wyrażały białko fuzyjne B1 Dam-V5-laminy, które, jak potwierdzono, jest kolokalizowane z endogennym białkiem laminy B1 przez barwienie aminofluorescencyjne. Ten lentiwirus i kontrolny lentiwirus eksprymujący białko fuzyjne Dam-V5 zostały wykorzystane do zakażenia mysich mioblastów C2C12.
DNA pobrano i amplifikowano dla fragmentów metylowanych adeniny, zgodnie z opisem, a następnie zsekwencjonowano. Następnie skonstruowano mapy interakcji genomu NL dla chromosomu pierwszego. Jedna ścieżka pokazuje współczynniki log2 obr./km.
Druga ścieżka pokazuje domeny powiązane z blaszkami w kolorze czarnym. Są to obszary, które są znacznie bardziej związane z zaporą B1 niż z zaporą kontrolną. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać sekwencje DNA związane z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, sprzężonego z DamID. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny i lampami UV może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak czekanie, aż żel ostygnie przed dodaniem bromku etydyny oraz noszenie ochrony oczu i osłony twarzy, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorski test łączący identyfikację za pomocąy metylotransferazy adeniny w DNA (DamID) z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (DamID-seq). Udoskonalona metoda ta oferuje lepszą rozdzielczość oraz szerszy zakres dynamiczny analizy sekwencji genomowego DNA powiązanych z białkami w komórkach zwierzęcych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Biologia molekularna
- Biologia komórki
Wstęp
- Metoda DamID-seq pozwala na identyfikację regionów genomowych powiązanych z konkretnymi białkami.
- Technika ta przewyższa pierwotną metodę DamID, w której wykorzystywano mikromacierze DNA.
- Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe umożliwia analizę porównawczą z innymi typami danych sekwencyjnych.
- Zrozumienie organizacji jądra komórkowego oraz regulacji transkrypcji jest kluczowe w komórkach ssaków.
Cel badania
- Wykrywanie sekwencji genomowego DNA powiązanych z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.
- Zwiększenie rozdzielczości analiz genomowych w komórkach zwierzęcych.
- Umożliwienie integracji danych z DamID-seq z innymi zbiorami danych z sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
Zastosowane metody
- Klonowanie genu docelowego do wektora DamID.
- Generowanie zapasów lentiwirusowych eksprymujących DamV5 POY oraz V5-Dam.
- Wykorzystanie lentiwirusowego systemu ekspresyjnego do dostarczenia genu.
- Przeprowadzenie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w celu analizy danych.
Główne wyniki
- Metoda ta zapewnia wyższą rozdzielczość w porównaniu z poprzednimi technikami.
- Umożliwia ona identyfikację regionów genomowych związanych z białkami jądrowymi.
- Analiza porównawcza z innymi danymi z sekwencjonowania pogłębia zrozumienie czynników transkrypcyjnych.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez technika laboratoryjnego ilustruje jej praktyczne zastosowanie.
Wnioski
- Ta ulepszona metoda DamID-seq stanowi wartościowe narzędzie do analiz genomicznych.
- Przyczynia się ona do zrozumienia organizacji jądra komórkowego oraz regulacji genów.
- Integracja tej techniki z innymi zbiorami danych otwiera nowe możliwości badawcze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda DamID-seq zapewnia wysoką rozdzielczość w mapowaniu interakcji białko-DNA w całej skali genomu, umożliwiając precyzyjną charakterystykę organizacji jądra oraz regulacji transkrypcyjnej w komórkach ssaków. Dzięki integracji znakowania opartego na metylacji adeniny z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym, technika ta pokonuje ograniczenia metody DamID zależnej od mikromacierzy i umożliwia analizę porównawczą z innymi zbiorami danych genomiki funkcjonalnej, takimi jak ChIP-seq i RNA-seq. Możliwość ta usprawnia walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków, dostarczając ilościowych i powtarzalnych map interakcji, które stanowią podstawę do selekcji celów terapeutycznych w oparciu o sformułowane hipotezy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie interakcji białko-DNA w całej skali genomu z wysoką precyzją i czułością.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny test oparty na amplifikacji, który eliminuje zależność od przeciwciał i działa w różnych systemach komórek ssaków.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe profile interakcji, które wspierają ocenę pewności celu oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie danych o fragmentach genomu zmetylowanych adeniną w całej skali genomu, odpowiednich do normalizacji i porównywania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Wartość operacyjna: Generuje dane z sekwencjonowania krótkich odczytów, kompatybilne ze standardowymi potokami bioinformatycznymi do wyznaczania szczytów (peak calling) i analizy różnicowej.
- Skalowalność: Umożliwia multipleksowe przetwarzanie próbek oraz integrację z innymi analizami opartymi na sekwencjonowaniu w celu koordynacji przepływów pracy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia porównanie map oddziaływań białko-DNA z zestawami danych epigenetycznych i transkrypcyjnych w celu oceny istotności funkcjonalnej.
- Wartość operacyjna: Wspiera badania podłużne domen związanych z laminą jądrową (LADs) oraz ich dynamiki w modelach chorób.
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia walidację celów zgodną z biomarkerami poprzez powiązanie zdarzeń wiązania z ekspresją genów i stanami chromatyny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda DamID-seq wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację wiodących cząsteczek, dostarczając wglądu w mechanizmy, które pomagają w optymalizacji przesiewania związków i walidacji przedklinicznej. Metoda ta generuje dane o wiązaniu w całym genomie, które można zintegrować z wynikami przesiewania fenotypowego w celu priorytetyzacji punktów uchwytu o silnym uzasadnieniu mechanicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez identyfikację bezpośrednich celów genomicznych białek jądrowych, czynników transkrypcyjnych lub regulatorów chromatyny.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, znormalizowanych wyników (np. stosunków log2 RPKM), które umożliwiają porównanie warunków i walidację trafień w kampaniach przesiewowych.
- Analityka: Pozwala na tworzenie map oddziaływań o wysokiej rozdzielczości, odpowiednich do detekcji peaków, analizy wzbogacenia motywów oraz korelacji z danymi RNA-seq lub ATAC-seq.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie miejsc wiązania białek do wariantów genomicznych związanych z chorobami lub eQTL przy wsparciu danych uzupełniających.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do mapowania oddziaływań białek jądrowych w wielu celach i liniach komórkowych, co ogranicza redundantne opracowywanie testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do mechanizmów celowania poprzez dostarczenie bezpośrednich dowodów na oddziaływania białko-DNA w skali całego genomu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje mapowanie oddziaływań dzięki detekcji opartej na amplifikacji, co redukuje zmienność związaną z metodami opartymi na przeciwciałach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niepewności biologicznej w walidacji celów i analizie szlaków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o powtarzalne, ilościowe profile oddziaływań.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy z zakresu klonowania molekularnego w celu wygenerowania konstruktów fuzyjnych DamID oraz wektorów lentiwirusowych.
- Zależne od dostępu do produkcji lentiwirusów, sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz narzędzi bioinformatycznych do analizy fragmentów i wyznaczania pików (peak calling).
- Konieczna jest standaryzacja warunków infekcji, parametrów fragmentacji DNA oraz selekcji rozmiaru w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z optymalizacją czasu trawienia i selekcją rozmiaru fragmentów (np. 300–400 bp) w celu zapewnienia wydajnego przygotowania biblioteki.
- Ograniczone przez gęstość motywów GATC w genomie, co może wpływać na rozdzielczość w regionach bogatych w AT lub ekstremalnie bogatych w GC.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Generation and Expression of Fusion Proteins and Free Dam Proteins
3:12
Library Preparation: Fragmentation
5:29
Library Preparation: Size Selection
7:26
Results: Detecting Lamin B1 Binding Regions on the Mouse Chromosome One
8:20
Conclusion
