Name: Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych endodermy z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej. Technika ta umożliwia badanie transportu lipidów i wykorzystania składników odżywczych przez zarodek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie rozwoju obecnego protokołu jest szczególnie wspierane przez "Aim for the Top University Plan" Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego, Tajwan (grant ID-104R350144), a także Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (ID grantu: MOST 104-2313-B-002-039-MY3). Szczególnie dziękujemy Centrum Biotechnologii Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego za udostępnienie pomieszczenia dla zwierząt i przestrzeni laboratoryjnej na potrzeby obecnego badania.

UWAGA: Ta procedura jest modyfikacją protokołu hodowli modelu kurczaka opracowanego przez Bauera i in. 2013 oraz Nakazawa i in., 2011. 2,9
1. Przygotuj zdrowe embrionalne zarodki dnia 5 z przepiórki japońskiej
<ol>
	<li>Umieść 1 samca i 3 samice dojrzałej płciowo przepiórki japońskiej razem w tej samej klatce. Dostarczaj paszę i wodę ad libitum. Dostosuj światło w pomieszczeniu dla zwierząt na 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.</li>
	<li>Codziennie po południu zbieraj zapłodnione jaja do plastikowych torebek i przechowuj je w lodówce o temperaturze 16 °C, aby opóźnić tempo wzrostu zarodków.</li>
	<li>Po zebraniu wystarczającej liczby jaj w ciągu dwóch tygodni należy inkubować zapłodnione jaja w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dobrą wentylacją przez pięć dni.</li>
</ol>
2. Przygotuj podłoże podstawowe i roztwory do mycia
<ol>
	<li>Użyj pożywki DMEM/F-12 (dostosowanej do pH 7,2) jako pożywki wzrostowej i uzupełnij ją 10% surowicą nowonarodzonych cieląt (NBCS) i 1% Pen-Strep Ampho. Roztwór (PSA; Penicylina, 105 jednostek/L; Streptomycyna, 100 mg/l; Amfoterycyna B, 0,25 mg/l).</li>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) o stężeniu 10x do przechowywania; użyć 1x roztwór PBS (zawierający NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH2PO4, 1.471 mM; Na2HPO4-7H 2O, 8,06 mM; dostosować do pH 7,2), aby umyć i zwilżyć błonę woreczka żółtkowego, jednocześnie oddzielając endodermę od żółtka jaja kurzego i albuminy.</li>
	<li>Użyj pożywki DMEM (dostosowanej do pH 7,2), aby ponownie zawiesić granulki endodermy.</li>
</ol>
3. Zbiór pierwotnych EEC z japońskich przepiórek YSM
<ol>
	<li>Wysiaduj zebrane jaja przez 5 dni (krok 1.3). Zbadaj jaja za pomocą świecy do jaj, aby potwierdzić prawidłowy rozwój embrionalny. 
	UWAGA: W 5 dniu embrionalnym granica mezodermy YSM jest bardzo wyraźna, a 3 warstwy embrionalne są mniej ściśle ze sobą połączone, dzięki czemu łatwo jest uzyskać endodermę. Do kolekcji YSM należy używać wyłącznie jaj wykazujących prawidłowy rozwój krążenia kapilarnego.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść skorupkę jajka świeżą wodą i 75% etanolem. Otwórz skorupkę jajka z pozycji komórki powietrznej za pomocą nożyczek, delikatnie oderwij i zbierz cały YSM za pomocą kleszczy i umieść w 10 cm naczyniu hodowlanym wypełnionym 37°C 1x PBS.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek usuń zarodek, żółtko i białko jaja, a następnie delikatnie umyj YSM trzykrotnie 1x PBS i umieść YSM w roztworze PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć ektodermę z YSM. Użyj 2 kleszczyków, jeden do mocnego przytrzymania warstwy komórek endodermy, a drugi do przytrzymania mezodermy kapilarnej.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym rozerwij i oddziel endodermę od krawędzi mezodermy w kierunku zarodka. Zebrać jasnożółtą endodermę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml za pomocą zakraplacza i umieścić w 15 ml pożywki wzrostowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż wszystkie pobrania tkanek zostaną zakończone.</li>
</ol>
4. Trawienie plastrów endodermy przez trawienie kolagenazą
<ol>
	<li>Świeżo rozpuścić 6,5 jednostki kolagenazy typu IV w 10 ml DMEM.</li>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 50 ml (3.4) o sile 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i umieścić całą endodermę w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm za pomocą pipety. Dodaj 1 ml roztworu kolagenazy do tego naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Pokrój endodermę zebraną z 2 zarodków przepiórczych za pomocą zakrzywionych nożyczek, aż rozmiar każdego plasterka wyniesie około 2 do 3 mm. Za pomocą zakraplacza zbierz wszystkie plastry do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wraz z 9 ml świeżego roztworu kolagenazy.</li>
	<li>Trawić tkankę kolagenazą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 175 obr./min. To częściowe trawienie kolagenazą służy do poprawy proliferacji komórek eksplantatu.</li>
	<li>Wirować przy 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć frakcję supernatantu za pomocą pipety. Przemyć osad przez zawiesinę w 20 ml DMEM i usunąć frakcję supernatantu po odwirowaniu 130 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki wzrostowej (DMEM/F12 z 10% NBCS i 1% PSA) i delikatnie i równomiernie wysiewać na 24-dołkową płytkę (każda studzienka zawiera 500 μl roztworu komórek).</li>
	<li>Inkubować eksplantaty tkanek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na powietrzu przez 2 dni, aby umożliwić komórkom namnażanie się z tkanek.</li>
	<li>Inkubować komórki przez kolejne 2 dni i scharakteryzować ich żywotność za pomocą protokołu oznaczania żywotności komórek. 15 
	UWAGA: Żywe komórki utrzymują środowisko redukujące w cytozolu. Rezazuryna, substancja czynna, jest nietoksycznym, przepuszczalnym dla komórek związkiem, który ma niebieski kolor i praktycznie nie fluorescencyjny. Po dodaniu do kultur komórkowych resazuryna jest redukowana do rezorufiny w cytozolu przez enzymy mitochondrialne. Rezorufina ma czerwony kolor i jest silnie fluorescencyjna. Żywe komórki w sposób ciągły przekształcają resazurynę w rezorufinę, zwiększając ogólną fluorescencję i kolor pożywki hodowlanej otaczającej komórki.</li>
	<li>Wykonaj izolację całkowitego RNA komórek nabłonka endodermy, odwrotną transkrypcję i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mRNA genu markerowego zgodnie z opisem. Pytania z dnia 16,17 na dzień
	<ol>
		<li>Użyj PCR z odwrotną transkryptazą, aby wykryć mRNA SOAT1 (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3'; antysens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; Produkt PCR = 168 pz) jako swoisty marker dla komórek EWG. Użyj mRNA β-aktyny (sens: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'; antysens: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; Produkt PCR = 151 pz) jako gen porządkowy i kontrola wewnętrzna.</li>
		<li>Użyj elektroforezy żelowej, aby wykryć rozmiar produktu RT-qPCR. Przygotuj 1% żel agarozowy i wymieszaj 10 μl produktu qPCR z 2 μl barwnika ładującego. Załaduj 10 μl mieszaniny do każdej studzienki w 1% żelu agarozowym i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

Nie ma konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów. Nie dostaliśmy żadnego dofinansowania od żadnej prywatnej firmy.

Ponieważ poprzedni system hodowli odniósł ograniczony sukces, potrzebny jest lepszy system hodowli. Endoderma YSM przepiórki japońskiej wymaga leczenia enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza, w celu rozluźnienia połączeń komórka-komórka, aby osiągnąć lepszą wydajność wzrostu w eksplantatach ex-vivo. Nasze dane pokazują, że liczba komórek po częściowym trawieniu była większa niż w przypadku niestrawionej kultury tkankowej po wysiewie przez 2 dni (ryc. 1). Dlatego częściowe trawienie proteolitycz...

Głównym źródłem odżywczym ptasiego zarodka jest żółtko, składające się z 33% lipidów, 17% białka i 1% popiołu. 1 Podczas rozwoju embrionalnego błona woreczka żółtkowego (YSM) wyrasta z wnętrza embrionalnej jamy brzusznej i stopniowo pokrywa powierzchnię żółtka. Począwszy od 2 dnia embrionalnego, ekspresja genów związana z metabolizmem lipidów i angiogenezą jest stopniowo zwiększana w YSM, a YSM powoli rozwija projekcje podobne do kosmków. 8,9 pkt.Projekcje te zwiększają wchłanianie składników odżywczych żółtka w celu wsparcia rozwoju embrionalnego. YSM to tkanka pozazarodkowa, która zawiera trzy listki zarodkowe: endodermę, mezodermę i ektodermę. 14 Ektoderma woreczka żółtkowego jest skierowana w stronę białka i łączy się z błoną żółtkową, delikatnie pokrywając woreczek żółtkowy. Komórki nabłonka endodermalnego są skierowane bezpośrednio w stronę żółtka jaja kurzego i służą jako portale wykorzystania składników odżywczych. 6 W miarę rozszerzania się YSM, komórki nabłonka endodermalnego (EEC) można podzielić ze względu na kształt i funkcjonalność na dwie grupy, obszar vitelline i obszar vasculosa. 7
Obszar witeliny składa się z komórek endodermalnych i jest oddalony od embrionu; obszar vasculosa składa się z komórek mezodermalnych i obejmuje zróżnicowane EEC z naczyniami krwionośnymi i tkankami łącznymi. Do 5 dnia embrionalnego żółtko jest całkowicie pokryte ektodermą i endodermą YSM, a obszar naczyniowy szybko się powiększa. YSM wchłania, rekomponuje i uwalnia lipidy (jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości pochodzące z żółtka) i białka do embrionalnego układu krążenia. 9, 2 W związku z tym stworzyliśmy podstawowy system hodowli embrionalnych komórek nabłonkowych przepiórek japońskich, aby zbadać mechanizmy wykorzystania lipidów w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.
Lipidy takie jak triacyloglicerol, lecytyna, fosfolipid i ester cholesterolu (CE) są głównymi źródłami energii dla ptasich zarodków. We wczesnych stadiach rozwoju lipidy żółtka składają się tylko z 1,3% CE i wzrastają do 10-15% w połowie rozwoju embrionalnego ptaków 3, 11. Ester cholesterolu jest syntetyzowany z cholesterolu przez sterolową O-acylotransferazę 1 (SOAT1) w ptasim zarodku YSM. 4
Formą przechowywania cholesterolu jest CE, CE jest przenoszony w lipoproteinach, a lipoproteiny są transportowane przez krążenie do tkanek. 13 Na tydzień przed wykluciem następuje szybki wzrost ptasich zarodków. Około 68% pozostałej zawartości lipidów w żółtku jest wchłanianych na tym etapie. 10 Mechanizm, za pomocą którego wykorzystuje się lipidy żółtka, może być wyjaśniony przez model badawczy EWG. Aby osiągnąć ten cel badawczy, opracowano protokół hodowli kurczaków EWG. 2, 9 Jednak ze względu na niski wskaźnik sukcesu eksplantatów tkankowych, potrzebna jest ulepszona procedura hodowli komórek EWG w celu zbadania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Do mycia granulek EEC</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Jako podłoże podstawowe w hodowli EEC</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Jako surowica zasilająca w hodowli EEC</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Roztwór</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Do łagodzenia ewentualnej infekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ IV</td><td>Gibco firmy Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp; Kolagenaza jest proteazą specyficzną dla wiązania między obojętnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-XGly-Pro. Jako proteaza do dysocjacji komórek od tkanki pierwotnej.</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047 Dla</td><td>EWG do zakładania i przedłużania</td></tr><tr><td>probówek wirówkowych PP o pojemności 50 ml</td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Do transportu błon i trawienia enzymatycznego</td></tr><tr><td>50 ml Probówka ze stożkowym dnem i nakrętką</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Do transportu błon i trawienia enzymatycznego</td></tr><tr><td>Wzajemna kąpiel wytrząsająca</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Dla lepszego trawienia enzymatycznego na błonach</td></tr></tbody></table>

pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Stworzyliśmy model hodowli komórek nabłonka endodermalnego (EEC) do badania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju. Zapłodnione jaja przepiórki japońskiej inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 dni, a następnie pobrano błony woreczka żółtkowego (YSM) w celu ustanowienia systemu hodowli EWG. Wyizolowaliśmy embrionalną warstwę endodermy z YSM i pokroiliśmy błonę na 2-3 mm kawałki i częściowo strawiliśmy kolagenazą przed wysiewem na 24-dołkowych płytkach hodowlanych. EWG namnażają się z tkanki i są gotowe do badań nad hodowlą komórkową. Stwierdziliśmy, że EEC mają typowe cechy YSM in vivo, na przykład akumulację kropelek lipidów, ekspresję O-acylotransferazy sterolowej i lipazy lipoproteinowej. Częściowe trawienie znacznie zwiększyło wskaźnik powodzenia hodowli EWG. Wykorzystując EEC, wykazaliśmy, że ekspresja SOAT1 była regulowana przez szlak związany z kinazą białkową A zależną od cAMP. Ten pierwotny system hodowli przepiórek japońskich EWG jest użytecznym narzędziem do badania embrionalnego transportu lipidów i wyjaśnienia roli genów zaangażowanych w pośredniczenie w wykorzystaniu składników odżywczych w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.

Aby osiągnąć cel polegający na stworzeniu spójnego i użytecznego modelu komórkowego, musimy wydłużyć i ustabilizować tempo proliferacji oraz wydajność ptasich EEC. Porównaliśmy bezpośrednią inkubację endodermy bez trawienia enzymatycznego z endodermą trawioną częściowo enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza lub kolagenaza z dodatkiem 0,6 U dispazy. Dispaza jest amino-endopeptydazą, która hydrolizuje wiązania peptydowe N-końcowe niepolarnych reszt aminokwasowych. Podczas gdy trak...

Aby zbadać mechanizm wykorzystania lipidów w błonach woreczków żółtkowych podczas późnych etapów rozwoju embrionalnego ptaków, stworzyliśmy podstawowy system hodowli komórek nabłonkowych encyklii encyklalnej przepiórek japońskich.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Ogólnym celem tej procedury eksplantacji ex vivo jest usprawnienie procesu pozyskiwania i rozszerzenie zastosowania ptasich endodermalnych komórek nabłonkowych w celu zbadania funkcji enzymów i białek pośredniczących w wykorzystywaniu składników odżywczych przez embriony ptaków. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wykorzystania lipidów podczas embriogenezy ptaków, takie jak sposób pakowania i transportu lipidów z żółtka do embrionu w późniejszych etapach rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego pozyskania funkcjonalnych endodermalnych komórek nabłonkowych z błony żółtkowej przepiórki japońskiej, które mogą służyć jako model do badania rozwoju embrionalnego ptaków.Zacznij od przygotowania 10x roztworu PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńcz ten roztwór zapasowy w stosunku jeden do dziesięciu, aby przygotować 1x PBS, który będzie służył do płukania błony pęcherzyka żółtkowego podczas preparowania endodermy. Aby przygotować pożywkę wzrostową dla komórek nabłonkowych endodermy (EECs), najpierw uzupełnij DMEM/F-12 o 10% serum z noworodków cieląt oraz 1% roztwór penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny.Następnie n

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych endodermy z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej. Technika ta umożliwia badanie transportu lipidów i wykorzystania składników odżywczych przez zarodek.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Przeglądaj więcej filmów