Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Ogólnym celem tej procedury eksplantacji ex vivo jest usprawnienie procesu pozyskiwania i rozszerzenie zastosowania ptasich endodermalnych komórek nabłonkowych w celu zbadania funkcji enzymów i białek pośredniczących w wykorzystywaniu składników odżywczych przez embriony ptaków. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wykorzystania lipidów podczas embriogenezy ptaków, takie jak sposób pakowania i transportu lipidów z żółtka do embrionu w późniejszych etapach rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego pozyskania funkcjonalnych endodermalnych komórek nabłonkowych z błony żółtkowej przepiórki japońskiej, które mogą służyć jako model do badania rozwoju embrionalnego ptaków.

Zacznij od przygotowania 10x roztworu PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńcz ten roztwór zapasowy w stosunku jeden do dziesięciu, aby przygotować 1x PBS, który będzie służył do płukania błony pęcherzyka żółtkowego podczas preparowania endodermy. Aby przygotować pożywkę wzrostową dla komórek nabłonkowych endodermy (EECs), najpierw uzupełnij DMEM/F-12 o 10% serum z noworodków cieląt oraz 1% roztwór penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny.

Następnie należy włożyć sondę pH-metru do wcześniej przygotowanego DMEM. Do pożywki należy dodawać kroplami 3N HCl, aż pH zostanie dostosowane do wartości 7,2. Po zebraniu około dwóch tuzinów zapłodnionych jaj przepiórczych, należy umieścić je pionowo w pojemnikach na jaja tak, aby ich szerokie, niezaostrzone końce, w których znajdują się komory powietrzne, były skierowane do góry.

Następnie przenieś jaja do dobrze wentylowanego inkubatora ustawionego na 37 °C. Po pięciu dniach inkubacji obejrzyj jaja za pomocą świecokreskopu. Jeśli zarodki rozwijają się prawidłowo, powinna być widoczna kolista struktura naczyń kapilarnych pod komorą powietrzną.

Wybierz jajo wykazujące prawidłowy rozwój naczyń włosowatych i oczyść skorupkę świeżą wodą oraz 75% etanolem. Następnie otwórz skorupkę jaja w miejscu komory powietrznej za pomocą nożyczek. Używając pęsety, delikatnie pomóż wylać zawartość jaja do pustej szalki Petriego o średnicy 10 cm.

Następnie za pomocą nożyczek oddziel zarodek, żółtko oraz wszelkie albuminy od błony pęcherzyka żółtkowego, określanej skrótem YSM. Po wyizolowaniu przemyj YSM trzy razy w 1x PBS, a następnie przenieś ją do nowej szalki 10 cm zawierającej PBS. Następnie umieść szalkę pod stereomikroskopem.

Następnie za pomocą nożyczek usuń wszelkie pozostałości białka jaja przylegające do zewnętrznej warstwy ektodermy YSM. Kontynuuj, używając pęsety do uniesienia półprzezroczystej ektodermy i czerwonego naczyniowego mezodermy od krawędzi mezodermy na błonie worka żółtkowego. Następnie ostrożnie odwarstw ektodermę i mezodermę razem, aby wyizolować leżącą pod nimi warstwę komórek endodermy.

Następnie, za pomocą jednej pęsety, mocno chwyć żółtą warstwę endodermy błony. Drugą pęsetą uchwyć mezodermę naczyniową i zacznij oddzielać mezodermę od krawędzi połączenia mezodermy z endodermą. Za pomocą nożyczek odetnij pozostałą żółtą warstwę endodermy i przenieś ją do sześciocentymetrowej szalki hodowlanej wypełnionej pożywką wzrostową.

Za pomocą zakraplacza przenieś jasnożółtą endodermę z 6 cm szalki hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL po pobraniu YSM, a następnie dodaj do niej 15 mL wcześniej przygotowanej pożywki wzrostowej. Umieść probówkę stożkową w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C do momentu zakończenia pobierania wszystkich tkanek. Rozpocznij od rozpuszczenia 6,5 jednostek kolagenazy typu IV w 10 mL DMEM.

Następnie wiruj probówki zawierające endodermę z prędkością 130 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessaj pożywkę, a następnie za pomocą pipety transferowej przenieś wszystkie próbki endodermy do sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego. Następnie dodaj do naczynia jeden mililitr roztworu kolagenu.

Za pomocą zakrzywionych nożyczek należy pociąć endodermę pobraną z czterech embrionów przepiórniczych na plasterki o wielkości około dwóch do trzech milimetrów. Następnie należy umieścić plasterki w probówce do wirowania o pojemności 50 mL, która zawiera dziewięć mililitrów świeżego roztworu kolagenazy. Aby usprawnić proliferację komórek na etapie eksplantacji, probówkę należy umieścić w wytrząsanej łaźni wodnej ustawionej na 37 °C.

Następnie inkubuj probówkę stożkową przez 30 minut, aby częściowo strawić tkankę za pomocą kolagenazy. Częściowe trawienie proteolityczne jest najważniejszym krokiem w celu poprawy wydajności pozyskiwania komórek z endodermy błony żółtkowej. Nasze dane wskazują na znaczną poprawę wskaźnika sukcesu hodowli komórkowej oraz proliferacji komórek dzięki zastosowaniu procedury trawienia kolagenazą.

Po trawieniu kolagenazą odwiruj tkankę z prędkością 130 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usuń frakcję nadosadu za pomocą pipety. Następnie wypłucz osad, resuspendując go w 20 mL DMEM. Odwiruj probówkę zgodnie z wcześniejszym opisem, po czym usuń nadosad i resuspenduj osad w 12 mL pożywki wzrostowej.

Następnie ostrożnie dodaj 500 µL zawiesiny do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Inkubuj eksplanty endodermy przez dwa dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2. W tym czasie komórki powinny proliferować poza tkankę.

Następnie inkubuj komórki przez kolejne dwa dni. Potem poddaj je testowi żywotności komórek i zwizualizuj wyniki za pomocą czytnika płytek. Następnie wykonaj RT-qPCR, aby ocenić poziom ekspresji interesujących markerów w EECs, i sprawdź wielkość produktu z RT-qPCR za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W porównaniu z niepoddanymi działaniu enzymów eksplantami, te częściowo trawione kolagenazą wykazywały znacznie większą proliferację komórek, co przedstawiono na tych wykresach i określono za pomocą sparowanego testu t, potwierdzając skuteczność systemu hodowlanego. Aby ocenić wpływ innych enzymów, przeprowadzono testy żywotności komórek dla tkanek traktowanych kolagenazą i dispazą lub samą kolagenazą. Przez pierwsze pięć dni inkubacji wzrost komórek był podobny w obu warunkach.

Jednakże od szóstego do dziewiątego dnia stały wzrost wykazywały jedynie EEC traktowane kolagenazą, co sugeruje, że częściowe trawienie tym enzymem poprawia wzrost i powinno być preferowaną metodą. Po wizualizacji hodowlanych EEC wykazano one cechy charakterystyczne dla adipocytów w postaci dużych, okrągłych kropel lipidowych, jak pokazano tutaj. Komórki te dawały również pozytywny wynik barwienia Oil Red O, które jest zazwyczaj stosowane do identyfikacji adipocytów.

Potwierdzając te dane morfologiczne, ilościowa PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że hodowane EEC wykazują wysokie poziomy SOAT1, białka syntetyzującego estry cholesterolu z cholesterolu. Sugeruje to ponadto, że hodowane EEC wykazują prawidłowe cechy fizjologiczne adipocytów. Co istotne, gdy EEC poddano działaniu IBMX oraz forskoliny – czynników zwiększających poziom cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP) – i hodowano przez 24 godziny, obie substancje stymulowały ekspresję SOAT1, co wskazuje na możliwe mechanizmy regulacji SOAT1 i utylizacji lipidów w YSM.

Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około czterech godzin, w trakcie których można zebrać co najmniej trzy próbki. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić metody takie jak SOAT1 lub inne testy aktywności enzymatycznej, a także podobne potwierdzenia wizualne. Taki test może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób określone białka i makroskładniki odżywcze biorą udział w późniejszych etapach rozwoju embrionalnego.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny wykorzystania składników odżywczych w okresie embrionalnym do zbadania możliwego mechanizmu, za pomocą którego składniki odżywcze są wykorzystywane i transportowane w ptasim modelu embrionalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś nauczyć się, jak pobierać tkanki endodermy z embrionów ptaków, a także dowiedzieć się, jak hodować EEC w celu badania transportu i wykorzystania składników odżywczych w okresie embrionalnym z wykorzystaniem modelu ptasiego.