Name: Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych endodermy z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej. Technika ta umożliwia badanie transportu lipidów i wykorzystania składników odżywczych przez zarodek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie rozwoju obecnego protokołu jest szczególnie wspierane przez "Aim for the Top University Plan" Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego, Tajwan (grant ID-104R350144), a także Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (ID grantu: MOST 104-2313-B-002-039-MY3). Szczególnie dziękujemy Centrum Biotechnologii Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego za udostępnienie pomieszczenia dla zwierząt i przestrzeni laboratoryjnej na potrzeby obecnego badania.

UWAGA: Ta procedura jest modyfikacją protokołu hodowli modelu kurczaka opracowanego przez Bauera i in. 2013 oraz Nakazawa i in., 2011. 2,9
1. Przygotuj zdrowe embrionalne zarodki dnia 5 z przepiórki japońskiej
<ol>
	<li>Umieść 1 samca i 3 samice dojrzałej płciowo przepiórki japońskiej razem w tej samej klatce. Dostarczaj paszę i wodę ad libitum. Dostosuj światło w pomieszczeniu dla zwierząt na 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.</li>
	<li>Codziennie po południu zbieraj zapłodnione jaja do plastikowych torebek i przechowuj je w lodówce o temperaturze 16 °C, aby opóźnić tempo wzrostu zarodków.</li>
	<li>Po zebraniu wystarczającej liczby jaj w ciągu dwóch tygodni należy inkubować zapłodnione jaja w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dobrą wentylacją przez pięć dni.</li>
</ol>
2. Przygotuj podłoże podstawowe i roztwory do mycia
<ol>
	<li>Użyj pożywki DMEM/F-12 (dostosowanej do pH 7,2) jako pożywki wzrostowej i uzupełnij ją 10% surowicą nowonarodzonych cieląt (NBCS) i 1% Pen-Strep Ampho. Roztwór (PSA; Penicylina, 105 jednostek/L; Streptomycyna, 100 mg/l; Amfoterycyna B, 0,25 mg/l).</li>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) o stężeniu 10x do przechowywania; użyć 1x roztwór PBS (zawierający NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH2PO4, 1.471 mM; Na2HPO4-7H 2O, 8,06 mM; dostosować do pH 7,2), aby umyć i zwilżyć błonę woreczka żółtkowego, jednocześnie oddzielając endodermę od żółtka jaja kurzego i albuminy.</li>
	<li>Użyj pożywki DMEM (dostosowanej do pH 7,2), aby ponownie zawiesić granulki endodermy.</li>
</ol>
3. Zbiór pierwotnych EEC z japońskich przepiórek YSM
<ol>
	<li>Wysiaduj zebrane jaja przez 5 dni (krok 1.3). Zbadaj jaja za pomocą świecy do jaj, aby potwierdzić prawidłowy rozwój embrionalny. 
	UWAGA: W 5 dniu embrionalnym granica mezodermy YSM jest bardzo wyraźna, a 3 warstwy embrionalne są mniej ściśle ze sobą połączone, dzięki czemu łatwo jest uzyskać endodermę. Do kolekcji YSM należy używać wyłącznie jaj wykazujących prawidłowy rozwój krążenia kapilarnego.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść skorupkę jajka świeżą wodą i 75% etanolem. Otwórz skorupkę jajka z pozycji komórki powietrznej za pomocą nożyczek, delikatnie oderwij i zbierz cały YSM za pomocą kleszczy i umieść w 10 cm naczyniu hodowlanym wypełnionym 37°C 1x PBS.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek usuń zarodek, żółtko i białko jaja, a następnie delikatnie umyj YSM trzykrotnie 1x PBS i umieść YSM w roztworze PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć ektodermę z YSM. Użyj 2 kleszczyków, jeden do mocnego przytrzymania warstwy komórek endodermy, a drugi do przytrzymania mezodermy kapilarnej.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym rozerwij i oddziel endodermę od krawędzi mezodermy w kierunku zarodka. Zebrać jasnożółtą endodermę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml za pomocą zakraplacza i umieścić w 15 ml pożywki wzrostowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż wszystkie pobrania tkanek zostaną zakończone.</li>
</ol>
4. Trawienie plastrów endodermy przez trawienie kolagenazą
<ol>
	<li>Świeżo rozpuścić 6,5 jednostki kolagenazy typu IV w 10 ml DMEM.</li>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 50 ml (3.4) o sile 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i umieścić całą endodermę w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm za pomocą pipety. Dodaj 1 ml roztworu kolagenazy do tego naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Pokrój endodermę zebraną z 2 zarodków przepiórczych za pomocą zakrzywionych nożyczek, aż rozmiar każdego plasterka wyniesie około 2 do 3 mm. Za pomocą zakraplacza zbierz wszystkie plastry do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wraz z 9 ml świeżego roztworu kolagenazy.</li>
	<li>Trawić tkankę kolagenazą przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 175 obr./min. To częściowe trawienie kolagenazą służy do poprawy proliferacji komórek eksplantatu.</li>
	<li>Wirować przy 130 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć frakcję supernatantu za pomocą pipety. Przemyć osad przez zawiesinę w 20 ml DMEM i usunąć frakcję supernatantu po odwirowaniu 130 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 12 ml pożywki wzrostowej (DMEM/F12 z 10% NBCS i 1% PSA) i delikatnie i równomiernie wysiewać na 24-dołkową płytkę (każda studzienka zawiera 500 μl roztworu komórek).</li>
	<li>Inkubować eksplantaty tkanek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na powietrzu przez 2 dni, aby umożliwić komórkom namnażanie się z tkanek.</li>
	<li>Inkubować komórki przez kolejne 2 dni i scharakteryzować ich żywotność za pomocą protokołu oznaczania żywotności komórek. 15 
	UWAGA: Żywe komórki utrzymują środowisko redukujące w cytozolu. Rezazuryna, substancja czynna, jest nietoksycznym, przepuszczalnym dla komórek związkiem, który ma niebieski kolor i praktycznie nie fluorescencyjny. Po dodaniu do kultur komórkowych resazuryna jest redukowana do rezorufiny w cytozolu przez enzymy mitochondrialne. Rezorufina ma czerwony kolor i jest silnie fluorescencyjna. Żywe komórki w sposób ciągły przekształcają resazurynę w rezorufinę, zwiększając ogólną fluorescencję i kolor pożywki hodowlanej otaczającej komórki.</li>
	<li>Wykonaj izolację całkowitego RNA komórek nabłonka endodermy, odwrotną transkrypcję i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mRNA genu markerowego zgodnie z opisem. Pytania z dnia 16,17 na dzień
	<ol>
		<li>Użyj PCR z odwrotną transkryptazą, aby wykryć mRNA SOAT1 (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3'; antysens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; Produkt PCR = 168 pz) jako swoisty marker dla komórek EWG. Użyj mRNA β-aktyny (sens: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'; antysens: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; Produkt PCR = 151 pz) jako gen porządkowy i kontrola wewnętrzna.</li>
		<li>Użyj elektroforezy żelowej, aby wykryć rozmiar produktu RT-qPCR. Przygotuj 1% żel agarozowy i wymieszaj 10 μl produktu qPCR z 2 μl barwnika ładującego. Załaduj 10 μl mieszaniny do każdej studzienki w 1% żelu agarozowym i uruchom żel pod napięciem 100 V przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

Nie ma konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów. Nie dostaliśmy żadnego dofinansowania od żadnej prywatnej firmy.

Ponieważ poprzedni system hodowli odniósł ograniczony sukces, potrzebny jest lepszy system hodowli. Endoderma YSM przepiórki japońskiej wymaga leczenia enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza, w celu rozluźnienia połączeń komórka-komórka, aby osiągnąć lepszą wydajność wzrostu w eksplantatach ex-vivo. Nasze dane pokazują, że liczba komórek po częściowym trawieniu była większa niż w przypadku niestrawionej kultury tkankowej po wysiewie przez 2 dni (ryc. 1). Dlatego częściowe trawienie proteolitycz...

Głównym źródłem odżywczym ptasiego zarodka jest żółtko, składające się z 33% lipidów, 17% białka i 1% popiołu. 1 Podczas rozwoju embrionalnego błona woreczka żółtkowego (YSM) wyrasta z wnętrza embrionalnej jamy brzusznej i stopniowo pokrywa powierzchnię żółtka. Począwszy od 2 dnia embrionalnego, ekspresja genów związana z metabolizmem lipidów i angiogenezą jest stopniowo zwiększana w YSM, a YSM powoli rozwija projekcje podobne do kosmków. 8,9 pkt.Projekcje te zwiększają wchłanianie składników odżywczych żółtka w celu wsparcia rozwoju embrionalnego. YSM to tkanka pozazarodkowa, która zawiera trzy listki zarodkowe: endodermę, mezodermę i ektodermę. 14 Ektoderma woreczka żółtkowego jest skierowana w stronę białka i łączy się z błoną żółtkową, delikatnie pokrywając woreczek żółtkowy. Komórki nabłonka endodermalnego są skierowane bezpośrednio w stronę żółtka jaja kurzego i służą jako portale wykorzystania składników odżywczych. 6 W miarę rozszerzania się YSM, komórki nabłonka endodermalnego (EEC) można podzielić ze względu na kształt i funkcjonalność na dwie grupy, obszar vitelline i obszar vasculosa. 7
Obszar witeliny składa się z komórek endodermalnych i jest oddalony od embrionu; obszar vasculosa składa się z komórek mezodermalnych i obejmuje zróżnicowane EEC z naczyniami krwionośnymi i tkankami łącznymi. Do 5 dnia embrionalnego żółtko jest całkowicie pokryte ektodermą i endodermą YSM, a obszar naczyniowy szybko się powiększa. YSM wchłania, rekomponuje i uwalnia lipidy (jako lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości pochodzące z żółtka) i białka do embrionalnego układu krążenia. 9, 2 W związku z tym stworzyliśmy podstawowy system hodowli embrionalnych komórek nabłonkowych przepiórek japońskich, aby zbadać mechanizmy wykorzystania lipidów w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.
Lipidy takie jak triacyloglicerol, lecytyna, fosfolipid i ester cholesterolu (CE) są głównymi źródłami energii dla ptasich zarodków. We wczesnych stadiach rozwoju lipidy żółtka składają się tylko z 1,3% CE i wzrastają do 10-15% w połowie rozwoju embrionalnego ptaków 3, 11. Ester cholesterolu jest syntetyzowany z cholesterolu przez sterolową O-acylotransferazę 1 (SOAT1) w ptasim zarodku YSM. 4
Formą przechowywania cholesterolu jest CE, CE jest przenoszony w lipoproteinach, a lipoproteiny są transportowane przez krążenie do tkanek. 13 Na tydzień przed wykluciem następuje szybki wzrost ptasich zarodków. Około 68% pozostałej zawartości lipidów w żółtku jest wchłanianych na tym etapie. 10 Mechanizm, za pomocą którego wykorzystuje się lipidy żółtka, może być wyjaśniony przez model badawczy EWG. Aby osiągnąć ten cel badawczy, opracowano protokół hodowli kurczaków EWG. 2, 9 Jednak ze względu na niski wskaźnik sukcesu eksplantatów tkankowych, potrzebna jest ulepszona procedura hodowli komórek EWG w celu zbadania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Do mycia granulek EEC</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Jako podłoże podstawowe w hodowli EEC</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Jako surowica zasilająca w hodowli EEC</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Roztwór</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Do łagodzenia ewentualnej infekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ IV</td><td>Gibco firmy Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp; Kolagenaza jest proteazą specyficzną dla wiązania między obojętnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-XGly-Pro. Jako proteaza do dysocjacji komórek od tkanki pierwotnej.</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047 Dla</td><td>EWG do zakładania i przedłużania</td></tr><tr><td>probówek wirówkowych PP o pojemności 50 ml</td><td>Corning&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Do transportu błon i trawienia enzymatycznego</td></tr><tr><td>50 ml Probówka ze stożkowym dnem i nakrętką</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Do transportu błon i trawienia enzymatycznego</td></tr><tr><td>Wzajemna kąpiel wytrząsająca</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Dla lepszego trawienia enzymatycznego na błonach</td></tr></tbody></table>

pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Stworzyliśmy model hodowli komórek nabłonka endodermalnego (EEC) do badania funkcji niektórych enzymów i białek w pośredniczeniu w wykorzystaniu składników odżywczych przez zarodki ptaków podczas rozwoju. Zapłodnione jaja przepiórki japońskiej inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 dni, a następnie pobrano błony woreczka żółtkowego (YSM) w celu ustanowienia systemu hodowli EWG. Wyizolowaliśmy embrionalną warstwę endodermy z YSM i pokroiliśmy błonę na 2-3 mm kawałki i częściowo strawiliśmy kolagenazą przed wysiewem na 24-dołkowych płytkach hodowlanych. EWG namnażają się z tkanki i są gotowe do badań nad hodowlą komórkową. Stwierdziliśmy, że EEC mają typowe cechy YSM in vivo, na przykład akumulację kropelek lipidów, ekspresję O-acylotransferazy sterolowej i lipazy lipoproteinowej. Częściowe trawienie znacznie zwiększyło wskaźnik powodzenia hodowli EWG. Wykorzystując EEC, wykazaliśmy, że ekspresja SOAT1 była regulowana przez szlak związany z kinazą białkową A zależną od cAMP. Ten pierwotny system hodowli przepiórek japońskich EWG jest użytecznym narzędziem do badania embrionalnego transportu lipidów i wyjaśnienia roli genów zaangażowanych w pośredniczenie w wykorzystaniu składników odżywczych w YSM podczas rozwoju embrionalnego ptaków.

Aby osiągnąć cel polegający na stworzeniu spójnego i użytecznego modelu komórkowego, musimy wydłużyć i ustabilizować tempo proliferacji oraz wydajność ptasich EEC. Porównaliśmy bezpośrednią inkubację endodermy bez trawienia enzymatycznego z endodermą trawioną częściowo enzymami proteolitycznymi, takimi jak kolagenaza lub kolagenaza z dodatkiem 0,6 U dispazy. Dispaza jest amino-endopeptydazą, która hydrolizuje wiązania peptydowe N-końcowe niepolarnych reszt aminokwasowych. Podczas gdy trak...

Aby zbadać mechanizm wykorzystania lipidów w błonach woreczków żółtkowych podczas późnych etapów rozwoju embrionalnego ptaków, stworzyliśmy podstawowy system hodowli komórek nabłonkowych encyklii encyklalnej przepiórek japońskich.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Ogólnym celem tej procedury eksplantacji ex vivo jest usprawnienie procesu pozyskiwania i rozszerzenie zastosowania ptasich endodermalnych komórek nabłonkowych w celu zbadania funkcji enzymów i białek pośredniczących w wykorzystywaniu składników odżywczych przez embriony ptaków. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wykorzystania lipidów podczas embriogenezy ptaków, takie jak sposób pakowania i transportu lipidów z żółtka do embrionu w późniejszych etapach rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego pozyskania funkcjonalnych endodermalnych komórek nabłonkowych z błony żółtkowej przepiórki japońskiej, które mogą służyć jako model do badania rozwoju embrionalnego ptaków.Zacznij od przygotowania 10x roztworu PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozcieńcz ten roztwór zapasowy w stosunku jeden do dziesięciu, aby przygotować 1x PBS, który będzie służył do płukania błony pęcherzyka żółtkowego podczas preparowania endodermy. Aby przygotować pożywkę wzrostową dla komórek nabłonkowych endodermy (EECs), najpierw uzupełnij DMEM/F-12 o 10% serum z noworodków cieląt oraz 1% roztwór penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny.Następnie należy włożyć sondę pH-metru do wcześniej przygotowanego DMEM. Do pożywki należy dodawać kroplami 3N HCl, aż pH zostanie dostosowane do wartości 7,2. Po zebraniu około dwóch tuzinów zapłodnionych jaj przepiórczych, należy umieścić je pionowo w pojemnikach na jaja tak, aby ich szerokie, niezaostrzone końce, w których znajdują się komory powietrzne, były skierowane do góry.Następnie przenieś jaja do dobrze wentylowanego inkubatora ustawionego na 37 °C. Po pięciu dniach inkubacji obejrzyj jaja za pomocą świecokreskopu. Jeśli zarodki rozwijają się prawidłowo, powinna być widoczna kolista struktura naczyń kapilarnych pod komorą powietrzną.Wybierz jajo wykazujące prawidłowy rozwój naczyń włosowatych i oczyść skorupkę świeżą wodą oraz 75% etanolem. Następnie otwórz skorupkę jaja w miejscu komory powietrznej za pomocą nożyczek. Używając pęsety, delikatnie pomóż wylać zawartość jaja do pustej szalki Petriego o średnicy 10 cm.Następnie za pomocą nożyczek oddziel zarodek, żółtko oraz wszelkie albuminy od błony pęcherzyka żółtkowego, określanej skrótem YSM. Po wyizolowaniu przemyj YSM trzy razy w 1x PBS, a następnie przenieś ją do nowej szalki 10 cm zawierającej PBS. Następnie umieść szalkę pod stereomikroskopem.Następnie za pomocą nożyczek usuń wszelkie pozostałości białka jaja przylegające do zewnętrznej warstwy ektodermy YSM. Kontynuuj, używając pęsety do uniesienia półprzezroczystej ektodermy i czerwonego naczyniowego mezodermy od krawędzi mezodermy na błonie worka żółtkowego. Następnie ostrożnie odwarstw ektodermę i mezodermę razem, aby wyizolować leżącą pod nimi warstwę komórek endodermy.Następnie, za pomocą jednej pęsety, mocno chwyć żółtą warstwę endodermy błony. Drugą pęsetą uchwyć mezodermę naczyniową i zacznij oddzielać mezodermę od krawędzi połączenia mezodermy z endodermą. Za pomocą nożyczek odetnij pozostałą żółtą warstwę endodermy i przenieś ją do sześciocentymetrowej szalki hodowlanej wypełnionej pożywką wzrostową.Za pomocą zakraplacza przenieś jasnożółtą endodermę z 6 cm szalki hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL po pobraniu YSM, a następnie dodaj do niej 15 mL wcześniej przygotowanej pożywki wzrostowej. Umieść probówkę stożkową w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C do momentu zakończenia pobierania wszystkich tkanek. Rozpocznij od rozpuszczenia 6,5 jednostek kolagenazy typu IV w 10 mL DMEM.Następnie wiruj probówki zawierające endodermę z prędkością 130 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessaj pożywkę, a następnie za pomocą pipety transferowej przenieś wszystkie próbki endodermy do sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego. Następnie dodaj do naczynia jeden mililitr roztworu kolagenu.Za pomocą zakrzywionych nożyczek należy pociąć endodermę pobraną z czterech embrionów przepiórniczych na plasterki o wielkości około dwóch do trzech milimetrów. Następnie należy umieścić plasterki w probówce do wirowania o pojemności 50 mL, która zawiera dziewięć mililitrów świeżego roztworu kolagenazy. Aby usprawnić proliferację komórek na etapie eksplantacji, probówkę należy umieścić w wytrząsanej łaźni wodnej ustawionej na 37 °C.Następnie inkubuj probówkę stożkową przez 30 minut, aby częściowo strawić tkankę za pomocą kolagenazy. Częściowe trawienie proteolityczne jest najważniejszym krokiem w celu poprawy wydajności pozyskiwania komórek z endodermy błony żółtkowej. Nasze dane wskazują na znaczną poprawę wskaźnika sukcesu hodowli komórkowej oraz proliferacji komórek dzięki zastosowaniu procedury trawienia kolagenazą.Po trawieniu kolagenazą odwiruj tkankę z prędkością 130 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usuń frakcję nadosadu za pomocą pipety. Następnie wypłucz osad, resuspendując go w 20 mL DMEM. Odwiruj probówkę zgodnie z wcześniejszym opisem, po czym usuń nadosad i resuspenduj osad w 12 mL pożywki wzrostowej.Następnie ostrożnie dodaj 500 µL zawiesiny do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Inkubuj eksplanty endodermy przez dwa dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2. W tym czasie komórki powinny proliferować poza tkankę.Następnie inkubuj komórki przez kolejne dwa dni. Potem poddaj je testowi żywotności komórek i zwizualizuj wyniki za pomocą czytnika płytek. Następnie wykonaj RT-qPCR, aby ocenić poziom ekspresji interesujących markerów w EECs, i sprawdź wielkość produktu z RT-qPCR za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W porównaniu z niepoddanymi działaniu enzymów eksplantami, te częściowo trawione kolagenazą wykazywały znacznie większą proliferację komórek, co przedstawiono na tych wykresach i określono za pomocą sparowanego testu t, potwierdzając skuteczność systemu hodowlanego. Aby ocenić wpływ innych enzymów, przeprowadzono testy żywotności komórek dla tkanek traktowanych kolagenazą i dispazą lub samą kolagenazą. Przez pierwsze pięć dni inkubacji wzrost komórek był podobny w obu warunkach.Jednakże od szóstego do dziewiątego dnia stały wzrost wykazywały jedynie EEC traktowane kolagenazą, co sugeruje, że częściowe trawienie tym enzymem poprawia wzrost i powinno być preferowaną metodą. Po wizualizacji hodowlanych EEC wykazano one cechy charakterystyczne dla adipocytów w postaci dużych, okrągłych kropel lipidowych, jak pokazano tutaj. Komórki te dawały również pozytywny wynik barwienia Oil Red O, które jest zazwyczaj stosowane do identyfikacji adipocytów.Potwierdzając te dane morfologiczne, ilościowa PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że hodowane EEC wykazują wysokie poziomy SOAT1, białka syntetyzującego estry cholesterolu z cholesterolu. Sugeruje to ponadto, że hodowane EEC wykazują prawidłowe cechy fizjologiczne adipocytów. Co istotne, gdy EEC poddano działaniu IBMX oraz forskoliny – czynników zwiększających poziom cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP) – i hodowano przez 24 godziny, obie substancje stymulowały ekspresję SOAT1, co wskazuje na możliwe mechanizmy regulacji SOAT1 i utylizacji lipidów w YSM.Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około czterech godzin, w trakcie których można zebrać co najmniej trzy próbki. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić metody takie jak SOAT1 lub inne testy aktywności enzymatycznej, a także podobne potwierdzenia wizualne. Taki test może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób określone białka i makroskładniki odżywcze biorą udział w późniejszych etapach rozwoju embrionalnego.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny wykorzystania składników odżywczych w okresie embrionalnym do zbadania możliwego mechanizmu, za pomocą którego składniki odżywcze są wykorzystywane i transportowane w ptasim modelu embrionalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś nauczyć się, jak pobierać tkanki endodermy z embrionów ptaków, a także dowiedzieć się, jak hodować EEC w celu badania transportu i wykorzystania składników odżywczych w okresie embrionalnym z wykorzystaniem modelu ptasiego.

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych endodermy z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej. Technika ta umożliwia badanie transportu lipidów i wykorzystania składników odżywczych przez zarodek.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Przeglądaj więcej filmów