Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej metodologii jest identyfikacja ładunków Kinesin-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pomaga nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie silników molekularnych, takie jak to, jakie ładunki są przenoszone przez kinezyny i miozyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że dominujące ujemne mutanty KIF5B mogą pomóc nam wizualnie zidentyfikować ten ładunek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Na początek, w przypadku obrazowania żywych komórek lub pośredniej fluorescencji przy 40X lub poniżej, podaj od 0,2 do 0,3 miliona komórek HeLa w jednym mililitrze kompletnego podłoża w każdym dołku płytki sześciodołkowej. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. W przypadku pośrednich badań immunofluorescencyjnych z powiększeniami powyżej 40X, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia, należy użyć alkoholu bezwzględnego do umycia okularów nakrywkowych i odstawienia ich w dołkach sześciodołkowej płytki do wyschnięcia na powietrzu.

Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, połóż je w dołkach i wysiew od 0,2 do 0,3 miliona komórek w jednym mililitrze kompletnego DMEM w każdym dołku płytki. Hoduj komórki przez noc. Następnego dnia, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj 0,1 mililitra pożywki do transfekcji, aby rozcieńczyć 0,6 mikrograma plazmidu o ekspresji dzikiego typu dzikiego lub bezsilnikowego tdTomato, z plazmidem lub bez plazmidu wyrażającego białko kandydujące do ładunku.

W innej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,6 mililitra dodaj 1,8 mikrolitra odczynnika do transfekcji do 0,1 mililitra pożywki do transfekcji. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 0,1 mililitra rozcieńczonego odczynnika do transfekcji do rozcieńczonych próbek DNA.

Odwróć probówki, aby wymieszać zawartość i odwiruj w dół przez pięć sekund. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 45 minut. W okresie inkubacji w celu wytworzenia kompleksu transfekcyjnego należy użyć PBS do trzykrotnego przemycia komórek.

Następnie dodaj 0,8 mililitra wstępnie podgrzanej pożywki do transfekcji do każdej studzienki i włóż płytki z powrotem do inkubatora. Po inkubacji rozcieńczonego odczynnika do transfekcji przez 45 minut, dodać kroplami 0,2 mililitra roztworu do każdej studzienki płytki. Delikatnie kołysz sześciodołkową płytką przez pięć sekund i umieść ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na sześć do ośmiu godzin.

Następnie użyj kompletnego DMEM, aby zastąpić pożywkę. Aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek po dodatkowych 16 godzinach inkubacji, dodaj barwnik interkalacyjny DNA Hoechst 33342 do pożywki do końcowego stężenia 1 mikromola i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie, używając obiektywu 40X, zbadaj komórki pod kątem ekspresji białek fluorescencyjnych.

Aby przeprowadzić immunofluorescencję pośrednią na komórkach, które były inkubowane z odczynnikiem do transfekcji: Po przygotowaniu paraformaldehydu zgodnie z protokołem tekstowym, użyj PBS w temperaturze pokojowej do umycia komórek, obracając sześciodołkową płytkę przez pięć sekund. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i PBS na studzienkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj PBS, aby raz umyć komórki, obracając płytkę i wyrzuć roztwór.

Następnie dodaj jeden mililitr 0,1% Triton-X 100 w PBS do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby przepuszczalność komórek. Następnie użyj PBS do czterokrotnego przemycia komórek, wyrzucając roztwór po każdym myciu. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez cztery godziny.

Po inkubacji należy użyć PBS do czterokrotnego przemycia komórek poprzez zawirowanie płytki. Następnie dodaj jeden mililitr przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez dwie godziny. Po czterokrotnym umyciu komórek PBS dodaj jeden mililitr DAPI i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

W przypadku używania szkieł nakrywkowych z próbkami, nałóż 10 mikrolitrów roztworu montażowego na środek szkiełka mikroskopowego i zamontuj szkło nakrywkowe na roztworze montażowym. Następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie i inkubuj w ciemności w dygestorium przez noc.

Aby przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną, użyj obiektywu 40X z zestawami filtrów dla DAPI, CFP, FITC i Cy3, jeśli ma to zastosowanie. Jak wykazano tutaj, egzogennie eksprymowany KIFB typu dzikiego pojawił się jednorodnie w cytoplazmie, podczas gdy c-MYC pojawił się głównie w jądrze. Bezsilnikowy mutant KIF5B utworzył jednak agregaty w cytoplazmie, co doprowadziło do agregacji c-MYC.

Ponadto bezsilnikowy KIF5B indukował również agregację endogennego c-MYC i czynnika transkrypcyjnego p53, co wskazuje, że c-MYC i p53 są ładunkami Kinezyny-1, a KIF5B reguluje subkomórkową lokalizację obu endogennych białek. Rysunek ten ilustruje, że ruch czynników transkrypcyjnych przez KIF5B wydaje się być specyficzny, ponieważ ekspresja bezsilnikowego mutanta KIF5B nie wpłynęła na subkomórkową lokalizację c-Fos ani nie spowodowała jego agregacji. Dane te pokazują, że metoda zademonstrowana na tym filmie pozwala na identyfikację ładunków Kinesin-1 o wysokiej specyficzności.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że kinezyny są najbardziej odpowiednie dla komórek, które mają dużą objętość cytoplazmy, dzięki czemu można łatwo zaobserwować agregację w cytoplazmie. Po tym odkryciu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się silnikami molekularnymi do konstruowania podobnych dominujących ujemnych mutantów innych kinezyn i miozyn w celu identyfikacji ich konkretnych ładunków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać dominującego ujemnego mutanta silnika molekularnego do identyfikacji tego ładunku za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Nie zapominaj, że praca z fenofilem, bromkiem etydyny i paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu skóry z nimi podczas wykonywania tej procedury. Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymencie.