Name: Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Odkryj metodę selektywnej eliminacji komórek z mieszanych hodowli 3D przy użyciu fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni. Technika ta minimalizuje uszkodzenia komórek otaczających w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Badań Wewnętrznych National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Uwaga: Poniższy protokół opisuje niezbędne kroki w celu wyeliminowania określonych komórek za pomocą NIR-PIT. Kontrole i inne szczegóły dotyczące NIR-PIT i żywotności komórek można znaleźć w innym miejscu18.
1. Koniugacja IR700 z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb)
<ol>
	<li>Przygotować interesujące nas mAb w dawce 2-5 mg/ml w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6).</li>
	<li>Zmieszać 6,8 nmol mAb z 30,8 nmol 10 mM IR700 w roztworze 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) w probówce mikrowirówkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przykryte folią aluminiową.</li>
	<li>Przemyć kolumnę PD-10 (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) dwukrotnie 15 ml PBS. Załaduj próbkę z kroku 1.2.</li>
	<li>Mieszaninę oczyścić za pomocą kolumny PD-10 przez elucję PBS zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: W tym przypadku elucja przebiegała wzdłuż koloru pasma IR700. W przypadku próbki o objętości 300 μl frakcja elucyjna PBS wynosi zwykle od 2,5 ml do 4,4 ml.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka za pomocą barwienia Coomassie, mierząc absorpcję przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru9. Oznaczyć stężenie IR700 z absorpcją przy 689 nm, aby potwierdzić liczbę cząsteczek fluoroforu sprzężonych z każdą cząsteczką mAb9, 
	Uwaga: Ważne jest, aby określić optymalną liczbę koniugacji cząsteczek IR700 w 1 mAb za pomocą spektrofotometru. Ogólnie rzecz biorąc, około 3 cząsteczki IR700 w 1 cząsteczce mAb są optymalne zarówno do pracy in vitro, jak i in vivo. Metody HPLC i SDS-PAGE mogą być stosowane w celu potwierdzenia, czy mAb i IR700 są związane, czy nie.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C po oznaczeniu stężenia białka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanej hodowli komórkowej 3D (Mieszana sferoida)
<ol>
	<li>Nanieś sterylną wodę (około 1 ml) do części zbiornika na płytki wiszących płytek.</li>
	<li>Przygotuj różne proporcje typów komórek będących przedmiotem zainteresowania - komórek A431-luc-GFP i komórek 3T3-RFP - przy czym każda próbka zawiera łącznie 5 000 komórek, zawieszonych w 50 μl pożywki hodowlanej. 
	Uwaga: Przygotuj proporcje 1:100, 10: 100, 25:100, 50:100 itd. typów komórek będących przedmiotem zainteresowania w pożywkach hodowlanych w zależności od typu komórki.</li>
	<li>Inkubować mieszankę przez 5-7 dni na 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni. Uwaga: Aby precyzyjnie wykonać sferoidę 3D, należy obchodzić się z płytką delikatnie, ponieważ krople zawierające komórki łatwo odpadają przed utworzeniem kształtów 3D.</li>
	<li>Obserwuj morfologię i rozmiar sferoid za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola przy powiększeniu 10X - 40X. Uwaga: Chociaż zależy to od typów komórek i wielkości wiszącej kropli, upewnij się, że średnica sferoidy wynosi około 400-600 μm po 7 dniach inkubacji w 96-dołkowej wiszącej płytce kroplowej.</li>
</ol>
3. In Vitro NIR-PIT dla mieszanej hodowli komórkowej 3D
<ol>
	<li>Zmienić pożywkę z wiszących płytek kroplowych na 10 μg/ml koniugat przeciwciało-fotoabsorber (APC) i inkubować przez 6 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Po 6 godzinach inkubacji przemyć sferoidę dwukrotnie świeżą pożywką hodowlaną (bez czerwieni fenolowej). Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia o średnicy 50 mm ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej, używając sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Umieść jedną sferoidę w każdym naczyniu.</li>
	<li>Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola, aby wykryć zmianę morfologii. Do obserwacji reporterów optycznych (np. GFP i RFP) należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z następującymi ustawieniami filtra: GFP — filtr wzbudzenia 469 nm i filtr emisyjny 525 nm; RFP — filtr wzbudzenia 559 nm i filtr emisyjny 630 nm.</li>
	<li>Umieść diodę elektroluminescencyjną (LED) nad naczyniem ze szklanym dnem w celu naświetlania. 
	Uwaga: Sferoidy mogą być wystawione na działanie światła NIR zarówno pod mikroskopem, jak i w osłonie laminarnej.
	<ol>
		<li>Zmierz gęstość mocy światła NIR za pomocą miernika mocy optycznej9. Zgodnie z tym pomiarem, naświetlaj światło NIR za pomocą diod elektroluminescencyjnych (LED), które emitują światło o długości fali od 670 do 710 nm przy 2 J/cm2, 
		Uwaga: Światło LED może wniknąć na maksymalną głębokość około 5 cali. Działanie cytotoksyczne NIR-PIT jest zależne tylko od danej energii, niezależnie od gęstości mocy i czasu ekspozycji23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po napromienieniu przenieść sferoidę na nową wiszącą płytkę kroplową z 50 μl świeżej pożywki hodowlanej i inkubować przez 1 dzień w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Delikatnie przenieść sferoidę do naczynia ze szklanym dnem ze 100 μl świeżej pożywki hodowlanej (bez czerwieni fenolowej) za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką. Obserwuj sferoidę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 1 dzień po NIR-PIT, używając ustawień filtra opisanych w kroku 3.3.
	<ol>
		<li>Wykryć martwe komórki, dodając jodek propidyny do pożywki w końcowym stężeniu 2 μg / ml lub przez utratę cytoplazmatycznej fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Figura 2B)14,18,22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.6, jeśli komórki docelowe nie zostaną całkowicie wyeliminowane.</li>
</ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Birchall, M. A., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%27s+green+shoots+of+disruptive+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation.</a> Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).</li>
<li>Ben-David, U., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenicity+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).</li>
<li>Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+cellular+reprogramming%3A+facts%2C+hypotheses%2C+unresolved+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues.</a> Cell. 143 (4), 508-525 (2010).</li>
<li>Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotent+stem+cell-derived+teratoma+formation+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Tang, C., Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+-+selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+in+vivo+target-specific+cancer+cell+death+after+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy.</a> BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+in+vivo+acute+necrotic+cancer+cell+death+induced+by+near+infrared+photoimmunotherapy+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging.</a> Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).</li>
<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Demonstrujemy metodę specyficznej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D bez uszkodzenia komórek niedocelowych za pomocą NIR-PIT. Jak dotąd nie ma praktycznej metody eliminacji komórek po ustaleniu tkanki lub po przeszczepie. Tak więc NIR-PIT jest obiecującą metodą osiągnięcia tego celu. Technika ta może być również stosowana in vivo18,22, ponieważ APC wykazują podobną farmakokinetykę jak sam mAb. Typ ogniwa docelowego można dostosować do różnych APC. Różne przeciwciała lub fragmen...

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, i istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. Obecnie w dziedzinie medycyny regeneracyjnej obiecującym materiałem są hodowle tkankowe z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych (ES), pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) 1-3.
Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotycząca bezpieczeństwa rakotwórczości po przeszczepieniu4,5. Chociaż wiele badań koncentrowało się na tych kwestiach w celu wyeliminowania określonych komórek, zwłaszcza w medycynie regeneracyjnej 6-8, nie opracowano żadnej praktycznej metody.
Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to leczenie oparte na koniugacie przeciwciało-fotoabsorber (APC). APC składa się z swoistego dla komórki przeciwciała monoklonalnego (mAb) i fotoabsorbera IR700. IR700 jest hydrofilową pochodną krzemionki i ftalocyjaniny i sama w sobie nie wywołuje fototoksyczności9. IR700 jest kowalencyjnie sprzężony z przeciwciałem za pośrednictwem reszt amidowych w łańcuchu bocznym cząsteczek lizyny. APC wiąże cząsteczki docelowe na błonie komórkowej, a następnie indukuje niemal natychmiastową martwicę komórek po ekspozycji na światło NIR o długości fali 690 nm. Podczas ekspozycji na światło NIR błona komórkowa pęka, co prowadzi do śmierci komórki 9-14. Udowodniono, że NIR-PIT jest skuteczny w przypadku wielu przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, w tym anty-EGFR, anty-HER2, anty-PSMA, anty-CD25, anty-mezoteliny, anty-GPC3 i anty-CEA15-21. Dlatego NIR-PIT może być stosowany przeciwko szerokiej gamie cząsteczek docelowych. Co więcej, NIR-PIT jest dobrze kontrolowanym zabiegiem, który umożliwia selektywne leczenie określonych obszarów poprzez ograniczenie napromieniowania światłem NIR18,22.
Tutaj prezentujemy metodę specyficznej eliminacji komórek za pomocą NIR-PIT z mieszanych kultur 3D.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Farba na podczerwień</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>Kolumna S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Coomassie (Bradford) Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well Wiszące płyty upuszczane</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy optycznej</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, Stany Zjednoczone)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; mm szklane dno, rozmiar naczynia 35&nbsp; mm, rozmiar studni 10&nbsp; mm</td><td>Cellvis (Mountain View, CA, Stany Zjednoczone)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3d przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Najnowsze osiągnięcia w inżynierii tkankowej oferują innowacyjne rozwiązania dla wielu chorób. Na przykład inżynieria tkankowa z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) pojawiła się jako nowa metoda w medycynie regeneracyjnej. Chociaż ta regeneracja tkanek jest obiecująca, zanieczyszczenie niechcianymi komórkami podczas hodowli tkankowych jest poważnym problemem. Ponadto istnieje obawa dotycząca bezpieczeństwa dotyczącego rakotwórczości po przeszczepie. Dlatego istnieje pilna potrzeba eliminacji określonych komórek bez uszkadzania innych komórek, które muszą być chronione, zwłaszcza w ustalonej tkance. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórkowej 3D in vitro z fotoimmunoterapią w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) bez uszkadzania komórek niedocelowych. Technika ta umożliwia eliminację określonych komórek z mieszanych kultur komórkowych lub tkanek.

Aby optycznie monitorować efekt NIR-PIT, linię komórkową A431, która wykazuje nadekspresję EGFR, zmodyfikowano genetycznie tak, aby wyrażała również GFP i lucyferazę (A431-luc-GFP). Jako komórki niebędące celem NIR-PIT, linię komórkową Balb/3T3 zmodyfikowano optycznie w celu ekspresji RFP (3T3-RFP). Zsyntetyzowano APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700). Zgodnie z niniejszym protokołem przygotowano sferoidy mieszane, składające się z różnych proporcji komórek (A431-luc-GFP i 3T3-RFP) (...

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, jednak istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D z wykorzystaniem fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT).

Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zademonstrowanie eliminacji specyficznych komórek docelowych z mieszanej trójwymiarowej (3D) hodowli komórkowej przy użyciu bliskopodczerwonej fotoimmunoterapii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej dotyczące medycyny regeneracyjnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania przeciwko różnorodnym cząsteczkom docelowym oraz możliwość ograniczenia leczenia do konkretnych, wybranych zmian chorobowych.Pozwala to zminimalizować skutki uboczne. W celu sprzężenia IR700 z przeciwciałami monoklonalnymi, należy inkubować odpowiednie przeciwciała z IR700 w fosforanie dwusodowym w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, osłaniając probówkę folią aluminiową. Po zakończeniu inkubacji kolumnę PD10 należy przemyć dwukrotnie 15 mililitrami PBS.Następnie należy nanieść roztwór przeciwciał na kolumnę i oczyścić mieszaninę poprzez elucję buforem PBS zgodnie z instrukcjami producenta. Aby potwierdzić liczbę cząsteczek fluoro-4 sprzężonych z każdą cząsteczką przeciwciała monoklonalnego, należy użyć spektrofotometru w celu oznaczenia stężenia białka przeciwciał monoklonalnych. Następnie koniugat należy przechowywać w temperaturze 4°C.Aby przygotować mieszaną hodowlę komórkową 3D, należy dodać 1 mililitra wody sterylnej do sekcji zbiornika płytki w 96-dołkowej płytce do metody wiszącej kropli. Następnie należy wysiać różne proporcje wybranych typów komórek w odpowiednim medium hodowlanym w zagęszczeniu co najmniej 5 000 komórek na 50 mikrolitrów medium na dołek i inkubować przez pięć do siedmiu dni w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37-stopni Celsius i 5% carbon dioxide. Medium hodowlane należy wymieniać co dwa dni, a morfologię i wielkość sferoidów obserwować codziennie za pomocą odwróconego mikroskopu w jasnym polu przy powiększeniu od 10 do 40 razy.Gdy sferoidy osiągną średnicę od 400 do 600 mikronów, należy zastąpić medium w płytce do metody wiszącej kropli medium zawierającym koniugat przeciwciała z fotoabsorberem i zwrócić płytkę do inkubatora na sześć godzin. Po zakończeniu inkubacji sferoidy należy przemyć dwukrotnie świeżym medium hodowlanym bez czerwieni fenolowej. Następnie, używając końcówki do pipety 200-mikrolitrowej z odciętym końcem, należy przenosić pojedynczo sferoidy do oddzielnych szalek 50-milimetrowych z szklanym dnem, zawierających po 100 mikrolitrów świeżego medium hodowlanego bez czerwieni fenolowej w każdej szalce.Użyj mikroskopu odwróconego, aby zaobserwować zmiany w morfologii sferoidów. Aby naświetlić sferoidy, umieść diodę emitującą światło nie wyżej niż 5 cali nad szalkami z szklanym dnem. Następnie użyj optycznego miernika mocy, aby potwierdzić emisję fali o długości od 670 do 710 nanometrów z gęstością energii 2 joules per centimeter squared.Po fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR), przenieś sferoidy do nowej płytki do metody wiszącej kropli z 50 µL świeżej pożywki hodowlanej na dołek i inkubuj przez jeden dzień w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie, używając kolejnego końcówki do pipety 200-µl z odciętym końcem, delikatnie przenieś sferoidy do nowych naczyń z szklanym dnem zawierających 100 µL pożywki hodowlanej bez czerwieni fenolowej i oceń ekspresję reportera optycznego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na koniec wykryj martwe komórki poprzez dodanie jodku propidyny do pożywki.Lub poprzez utratę cytoplazmatycznej fluorescencji GFP. W tym reprezentatywnym eksperymencie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, przygotowano mieszane sferoidy składające się z różnych proporcji komórek A431-luc-GFP oraz 3T3-RFP. Następnie przeprowadzono wielokrotną fotoimmunoterapię w bliskiej podczerwieni (NIR) po inkubacji z panitumumab-IR700, zgodnie z przedstawionym schematem.Eliminację komórek docelowych monitorowano poprzez ocenę aktywności fluorescencyjnej i lucyferazy w kulturach w kroplach wiszących. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednej godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że energia światła maleje zgodnie z prawem odwrotnych kwadratów.

selective-cell-elimination-from-mixed-3d-culture-using-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Ten film demonstruje technikę fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc na zmodyfikowanym modelu myszy, w którym komórki nowotworowe wykazują ekspresję lucyferazy. Po wstrzyknięciu koniugatu przeciwciało-fotosensybilizator (APC), który wiąże się ze specyficznymi antygenami na komórkach nowotworowych, mysz jest wystawiona na promieniowanie bliskiej podczerwieni, wywołując zmiany fotochemiczne w APC i prowadząc do martwiczej śmierci związanych komórek nowotworowych.

Technika fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę selektywnego usuwania określonych komórek z mieszanej hodowli komórek 3D za pomocą fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni. W tej metodzie docelowe komórki są dokładnie identyfikowane za pomocą przeciwciała sprzężonego z fotoabsorberem NIR. Późniejsze naświetlanie światłem podczerwonym indukuje śmierć komórki, skutecznie eliminując docelowe komórki z hodowli 3D.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni do celowanej eliminacji komórek w mieszanych kulturach 3D

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to nowa strategia leczenia raka, która wykorzystuje koniugat przeciwciało-fotoabsorber (IR700Dye) i światło NIR do niszczenia komórek rakowych. W tym miejscu przedstawiono metodę oceny działania przeciwnowotworowego NIR-PIT w mysim modelu rozsianego raka płuc i złośliwego międzybłoniaka opłucnej z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Odkryj metodę selektywnej eliminacji komórek z mieszanych hodowli 3D przy użyciu fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni. Technika ta minimalizuje uszkodzenia komórek otaczających w inżynierii tkankowej.

Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów