Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie leukocytów naciekających skórę za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji w gradiencie gęstości. Metoda ta może być stosowana do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych w wielu mysich modelach patologii skóry, w tym atopowego zapalenia skóry. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat biologii leukocytów naciekających skórę, można ją również zastosować do badania innych populacji komórek rezydentnych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy z zbieraniem skóry, które obejmuje całkowite usunięcie nadmiaru tkanki tłuszczowej i łącznej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ zbieranie skór i obsługa gradientu gęstości są trudne do nauczenia i wymagają precyzji oraz praktyki. W odpowiednim momencie po leczeniu użyj 10-centymetrowych nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie wyciąć obszar ogolonej skóry boku o wymiarach 25 na 25 milimetrów od dorosłej ośmio- lub dwunastotygodniowej samicy myszy szwajcarskiej-Webster ND4.

Użyj czystego, ostrego ostrza chirurgicznego, aby zeskrobać nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej ze skóry, a następnie przenieś skórę do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 10 mililitrów HBSS o temperaturze pokojowej uzupełnionej EDTA, HEPES i FBS i wstępnie trawić tkankę na obracającej się płytce przez 30 minut w suchym, niegazowanym, Inkubator 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji energicznie obracać probówkę przez dziesięć sekund i przefiltrować zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 70 mikronów. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść kawałki skóry boku z sitka do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej dziesięć mililitrów świeżych pożywek HBSS o temperaturze pokojowej, uzupełnionych EDTA, HEPES i FBS, a następnie użyj 12,5-centymetrowej pary chirurgicznych nożyczek preparacyjnych, aby zmielić każdy kawałek skóry boku, tak aby przeciętny kawałek tkanki miał rozmiar około 2,2 na 2,2 milimetra.

Gdy wszystkie kawałki zostaną zmielone, umieść probówkę z powrotem na obracającej się płytce na kolejne 30 minut inkubacji. Pod koniec inkubacji energicznie obracać probówkę przez 10 sekund i przefiltrować zawartość przez sitko o średnicy 70 mikronów. Zebrać pozostałe kawałki skóry bocznej w nowej 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów HBSS uzupełnionej 0,7 miligrama na mililitr kolagenazy D i umieścić probówkę z powrotem na obracającej się płytce na kolejne 30 minut inkubacji.

Po kolejnych 10 sekundach wirowania ponownie przefiltruj zawartość probówki, tym razem wyrzucając zanieczyszczenia na sitko, a następnie napełnij probówkę do 50 mililitrami HBSS, EDTA, HEPES, FBS, odwiruj komórki i zdekantuj supernatant. Dodaj trzy mililitry pożywki wirowej o temperaturze pokojowej i gradientacji gęstości 67 procent w PBS do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki i ponownie zawieś osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki wirowej o 44-procentowym gradionym gradiencie gęstości w temperaturze pokojowej w HBSS z czerwienią fenolową. Ustawiając pipetor na najniższą prędkość, umieść pipetę z boku probówki i delikatnie ułóż komórki na wierzchu pożywki wirówkowej o gradiacji gęstości 67 procent.

Podczas pracy z gradientami gęstości należy uważać, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza i zminimalizować wszelkie zakłócenia w interfejsie gradientu. Następnie oddziel komórki, używając pięciomililitrowej pipety transferowej, aby zebrać komórki na granicy faz pod koniec wirowania. Ponieważ delikatne nakładanie warstw gradientu i ostrożne wyodrębnianie granicy faz gradientów jest krytycznym krokiem, mądrze jest przećwiczyć wirowanie w gradiencie gęstości, nakładanie warstw pożywki i usuwanie granicy faz z zawieszeniem mysich splenocytów przed przystąpieniem do procedury z interesującymi komórkami eksperymentalnymi.

Na koniec umyj zebrane komórki w lodowatym PBS uzupełnionym FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego. Trawienie kolagenazy D nie ma wpływu na ekspresję powierzchniową CD4 i CD8-alfa, ponieważ ta sama liczba komórek CD4-dodatnich i CD8-alfa-dodatnich jest wykrywana z trawieniem enzymatycznym lub bez niego. Ponadto trawienie kolagenazy D nie ma wpływu na gęstość powierzchniową markerów aktywacji limfocytów T CD44 i CD62L na limfocytach T CD4-dodatnich.

Po separacji gradientowej około 250 żywotnych komórek odpornościowych na milimetr kwadratowy tkanki bocznej izoluje się od myszy Oxazolone lub myszy z prowokacją Ox, w porównaniu z tylko czterema żywotnymi komórkami odpornościowymi na milimetr kwadratowy tkanki u myszy z podłożem, wcześniej uwrażliwionych na Ox.95 procent pojedynczych komórek o niskim rozproszeniu do przodu i na bok u myszy z prowokacją Ox, a 71 procent tych komórek w grupie kontrolnej z napędem to żywe komórki CD45 dodatnie, odpowiada to około 67-krotnemu wzrostowi populacji naciekających komórek odpornościowych CD45 dodatnich w skórze boku po trzech codziennych wyzwaniach Ox. Rzeczywiście, prowokacja Ox powoduje wyraźną infiltrację limfocytów T i neutrofili do skóry bocznej, z 42 procentami pojedynczych, żywych komórek CD45 dodatnich u zwierząt leczonych wołem, pozornymi neutrofilami Gr-1 dodatnimi i około 84 procentami limfocytów T CD3 dodatnich eksprymujących CD8-alfa lub CD4, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi leczonymi etanolem. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w około trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z gradientem gęstości. Nie zapominaj, aby podczas wykonywania tej procedury zawsze używać pożywki wirowej o gradientowej gęstości w temperaturze pokojowej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza cytometrii przepływowej, sortowanie komórek, transfer komórek lub hodowla komórkowa in vitro w celu oceny fenotypu i funkcji leukocytów naciekających skórę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować leukocyty naciekające skórę za pomocą trawienia enzymatycznego i wirowania w gradiacji gęstości.