Name: Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę stłoczenia makromolekularnego do tworzenia macierzy pochodzenia komórkowego dla inżynierii tkankowej skóry. Technika ta skraca czas hodowli organotypowych modeli 3D przy zachowaniu dojrzałości konstruktów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Badań Biomedycznych w Singapurze poprzez podstawowe wsparcie dla Instytutu Biologii Medycznej i grant SPF2013/005. M.R. był wspierany przez Grant Wydziału Badawczego NUS (Inżynieria w Medycynie) (M.R.) R-397-000-081-112 oraz Program Inżynierii Tkankowej NUS (NUSTEP). Autorzy pragną podziękować profesor Irene Leigh za dostarczenie przeciwciała kolagenu VII. Prace nad mikroskopią elektronową przeprowadzono w Zakładzie Mikroskopii Elektronowej Narodowego Uniwersytetu Singapuru.

<ol><li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes+in+skin%3A+unique+structures+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li>
<li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions%2Fadherens+junctions%3A+basic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li>
<li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+molecules%3A+potential+targets+in+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li>
<li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoglycans%3A+from+structural+compounds+to+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and%2For+exogenously+activated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng%22%5BJournal%5D)">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
<li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules%3A+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li>
<li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Biochem+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li>
<li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors%3A+when+less+might+be+more%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+USA+Sci%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119(2008).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA%2FDNA+and+DNA%2FRNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li>
<li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly%3A+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mat%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li>
<li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+C%22%5BJournal%5D)">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li>
<li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li>
<li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li>
<li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+skin+substitutes%3A+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263(2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production%3A+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li>
<li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904(2012).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729(2015).</li>
<li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li>
<li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tiss+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li>
<li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+More+Matrix%3A+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development%2C+using+macromolecular+crowding%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss+Eng+A%22%5BJournal%5D)">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Wzmocnioną macierz zewnątrzkomórkową uzyskuje się po wprowadzeniu makromolekularnych crowderów do hodowli komórkowej, dzięki wykluczeniu efektu objętościowego, który zwiększa rozszczepienie propeptydu przez proteinazy. Powoduje to, że macierz zewnątrzkomórkowa, w szczególności kolagen, jest szybciej przetwarzana i osadza się na powierzchni hodowli. Podczas gdy inne grupy uzyskały grube warstwy komórek fibroblastów, wymagało to czasu hodowli wynoszącego kilka tygodni20. W przeciwieństwie do tego, MMC opisany w ...

Skóra tworzy barierę ochronną, zapobiegając utracie wody i przedostawaniu się patogenów. Składa się z trzech głównych elementów; Skóra właściwa bogata w zręb1, warstwowy naskórek2,3,4 na nim i połączenie skórno-naskórkowe pomiędzy5,6. Skóra właściwa składa się głównie z włókien kolagenowych i elastycznych i jest słabo zaludniona fibroblastami7. Natomiast naskórek bogaty w komórki składa się z wielu warstw keratynocytów. Keratynocyty najbardziej wewnętrznej warstwy są proliferacyjne i dostarczają nowych komórek podstawnych, które odnawiają i zastępują końcowo różnicujące się keratynocyty, które stale przemieszczają się do najbardziej zewnętrznej warstwy skóry i utraciły swoje jądra i materiał cytoplazmatyczny, w wyniku czego powstaje zrogowaciała warstwa, która ulega złuszczaniu.
Połączenie skórno-naskórkowe, specyficzny rodzaj błony podstawnej, to złożona struktura złożona z łączących się cząsteczek macierzy, która wiąże naskórek ze skórą właściwą. Włókna kolagenu I skóry właściwej przeplatają się z włókienkami zakotwiczającymi kolagen VII, które są zakotwiczone w blaszce gęstej bogatej w kolagen IV. Włókna kotwiczące (laminina 5, kolagen XVII i integryny) z kolei łączą blaszkę gęstą z hemidesmosomami keratynocytów podstawnych. Keratynocyty podstawne (warstwa podstawna) mają zdolność proliferacji i odnawiania, a także różnicowania i rozwarstwiania w celu utworzenia warstw nadpodstawnych; warstwa kolczasta, warstwa ziarnista i wreszcie warstwa rogowa naskórka, która reprezentuje powierzchnię kontaktu skóry z otoczeniem. W drodze od warstwy podstawowej do warstwy rogowaciałej keratynocyty zmieniają wzorce ekspresji cytokeratyn i ostatecznie ulegają apoptozie i zamykają się w zrogowaciałych otoczkach, kadłubach określonych białek, które są kowalencyjnie usieciowane przez aktywność transglutaminazy.
Odtworzenie skóry i jej warstw in vitro, w tym złożonych struktur połączenia skórno-naskórkowego i skórnej macierzy zewnątrzkomórkowej, oraz naśladowanie procesu rogowacenia, od dawna intrygowało naukowców i bioinżynierów jako trudne zadanie. Poczyniono znaczne postępy w inżynierii tkanki skórnej, na przykład udało nam się wyodrębnić komórki skóry z biopsji pacjenta i wygenerować kultury organotypowe skóry przy użyciu komórek skóry pochodzących od pacjenta8. Pozostają jednak nierozwiązane problemy związane ze słabym wydzielaniem białek macierzy zewnątrzkomórkowej przez same komórki skóry, co skutkuje nieoptymalnymi modelami skóry. Co więcej, czas potrzebny do wygenerowania organotypowej współkultury skóry 3D przy użyciu obecnych protokołów waha się od czterech do ośmiu tygodni, a ramy czasowe mogą zostać potencjalnie skrócone dzięki włączeniu makromolekularnych tłumów. Skrócenie czasu hodowli pozwala zaoszczędzić koszty odczynników, zmniejsza częstość starzenia się komórek i skraca czas oczekiwania pacjenta w przypadku stosowania produktu w klinice.
Makromolekularne zatłoczenie (MMC) polega na wprowadzeniu określonych makrocząsteczek do pożywki hodowlanej w celu wygenerowania wykluczonych efektów objętościowych. Wpływają one na szybkość reakcji enzymatycznych, w tym na proteolityczne rozszczepienie prokolagenu, który jest spóźniony w standardowych warunkach hodowli wodnej9-13. W MMC reakcje enzymatyczne są przyspieszane bez zwiększania ilości odczynników14,15, co powoduje, w przypadku rozszczepienia prokolagenu, zwiększoną ilość cząsteczek kolagenu I w zatłoczonych kulturach w porównaniu z niezatłoczonymi kontrolami10. Ponieważ konwersja prokolagenu do kolagenu umożliwia tworzenie zespołów kolagenowych, fibroblasty hodowane za pomocą MMC przez 48 godzin dały znacznie więcej kolagenu I w porównaniu z niezatłoczonymi kulturami fibroblastów monitorowanymi przez okres do czterech tygodni11,16,17. Oprócz wpływu na aktywność enzymatyczną, która wpływa na tworzenie, stabilizację i przebudowę ECM, wykazano również, że MMC bezpośrednio wzmacnia i moduluje tworzenie włókien kolagenowych18,19.
Prezentujemy tutaj metodę zwiększania produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przez komórki skóry, w szczególności fibroblasty skóry i keratynocyty naskórka. Ponadto wykazaliśmy, że wzbogacony ECM wytwarzany pod MMC w hodowlach jednowarstwowych może być decelularyzowany i stosowany jako czysta matryca pochodzenia komórkowego (CDM).
Używamy niekonwencjonalnego podejścia do wizualizacji i pełnego docenienia ECM zdeponowanego przez komórki skóry hodowane za pomocą MMC. Mikroskopia interferencyjna odbiciowa jest zwykle stosowana do badania interakcji komórka-matryca lub punktów kontaktowych komórka-szkło. Technika ta została wykorzystana w naszym systemie do wyświetlenia całkowitej ilości matrycy osadzonej na powierzchni szkła. Interferencyjną mikroskopię refleksyjną połączono z fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym, aby uzyskać jak najwięcej informacji pod względem składu i wzoru macierzy zewnątrzkomórkowej, w obecności i bez MMC.
Organotypowe kokultury skóry to klasyczna metoda modelowania skóry in vitro w kontekście trójwymiarowym. Podczas gdy dwuwymiarowe współkultury mogą dostarczać istotnych informacji, jest to ograniczone w przypadku tłumaczenia tych danych i stosowania ich z powrotem w środowisku in vivo, które jest z natury trójwymiarową strukturą. W szczególności keratynocyty skóry są spolaryzowane i zawierają segmenty wierzchołkowe i podstawne, które są niezbędne do homeostazy i przylegania komórek. Ponadto ekspresja typowych białek nadpodstawnych w keratynocytach powyżej warstwy podstawnej, takich jak keratyna 1, keratyna 10 i filagryna występuje tylko w przebiegu stratyfikacji i końcowego różnicowania keratynocytów. Ponieważ różnicowanie końcowe jest prawie nieobecne w typowych kulturach jednowarstwowych, suprapodstawowa ekspresja białka zwykle nie jest osiągana w tym systemie hodowli. Dlatego kultury organotypowe zaczynają się zanurzać w pożywce hodowlanej, ale następnie są przenoszone do granicy faz powietrze-ciecz, aby napędzać różnicowanie keratynocytów. Powoduje to ekspresję markerów stratyfikacji, a nawet rogowacenie i ogólnie lepsze odzwierciedlenie fizjologii naskórka. Podczas gdy inne grupy wcześniej z powodzeniem generowały organotypowe kokultury skóry, ustanowienie funkcjonalnej strefy połączenia skórno-naskórkowego stanowiło problem. W tym miejscu przedstawiamy nową metodę hodowli organtypowych kokultur skóry ze wzmocnioną błoną podstawną, w skondensowanych ramach czasowych i bez uszczerbku dla dojrzałości tych konstruktów. Pozwoliłoby to na opracowanie mimetyki skóry do modelowania in vitro, badania biologii skóry oraz szeregu testów przesiewowych.

<table><tbody><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Wako</td><td>013-12061</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych Wkładki do hodowli komórkowych&nbsp; (format 6-dołkowy)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td>Kultury organotypowe</td></tr><tr><td>Roztwór cytrynianu</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td>DakoCytomation Docelowy roztwór do pobierania cytrynianu, pH 6 (x10</td></tr><tr><td>)Kolagen (ogon szczura)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Kultury organotypowe</td></tr><tr><td>CnT-57</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-57</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Podłoże DAB + zestaw chromogenów</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Płytka głębokodołkowa (format 6-dołkowy)</td><td>Corning</td><td>355467</td><td>Kultury organotypowe Odczynnik</td></tr><tr><td>do wykrywania ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2106</td><td>Odczynnik do wykrywania Western Blotting Amersham ECL</td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy (TEM)</td><td>&nbsp; JEOL&nbsp;</td><td>&nbsp; JEM-1010 (100kV)</td><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td></tr><tr><td>Pożywka fibroblastów (FM)</td><td></td><td></td><td>Wysoka glukoza-DMEM + 10% płodowa surowica bydlęca + 1% penicylina Streptomycyna</td></tr><tr><td>Ficoll PM70</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>17-0310-05</td><td>Tłumik makromolekularny</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17-0300-05</td><td>Makromolekularny crowder</td></tr><tr><td>Pożywki bez surowicy keratynocytów (KSFM)</td> <td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td>Bufor do lizy do ekstrakcji białek. Inhibitor proteazy (Roche, #11836170001) został dodany do tego buforu do lizy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Czerwone, zielone i niebieskie kanały do wizualizacji fluorescencyjnych barwień immunologicznych AF594, AF488 i DAPI (40X mag).</td></tr><tr><td>Nośnik montażowy (Hydromount)</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Barwienie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Media montażowe (Cytoseal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Histologia (HRP)</td></tr><tr><td>Związek OCT (Tissue Tek)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Osadzanie do kriotomii</td></tr><tr><td>Antybiotyki penicylinowo-streptomycynowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td>Dodatek do pożywek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Kolagenowe I</td><td>Abcam</td><td>#ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Kolagen typu IV</td><td>Novocastra</td><td>#NCL-COLL-IV</td><td></td></tr><tr><td>Antykolagen VII</td><td></td><td></td><td>LH7.2 (we własnym zakresie)&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fibronektynowe</td><td>Abcam</td><td>#ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Środek redukujący&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Bufor do próbek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0008</td><td>Western blot</td></tr><tr> <td colspan = "4"><silne> przeciwciała drugorzędowe (barwienie immunologiczne)</td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenyloindolu dichlorowodorek (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#D9542</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 kozio-anty-królik</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>#A-11037&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 koza przeciw myszom</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp;#A-11005</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 kurczak anty-królik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21441</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 koza anty-mysz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe (HRP)</td><td>Dako</td><td>Envision+ System - Polimerowy anty-królik i anty-myszy z oznaczeniem HRP</td><td>nierozcieńczony</td></tr><tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Prodotti Chimicie Alimentari</td><td></td><td>Decelularyzacja</td></tr><tr> <td colspan="4">Pożywka warstwowa</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's Medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>Szynka" s F12&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>10% płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>0,4 mg/ml hydrokortyzon</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>5 mg/ml insuliny</td><td></td><td></td><td>Stosowany na granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>1,8 i środkowa kropka; 10-4 M adenina&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>5 mg/ml transferyny</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>2&middot; 10- 11 M trójjodotyronina&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Stosowany podczas granicy faz powietrze-ciecz w kulturach organotypowych. Pożywkę tę dodaje się na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biopolis Udogodnienia Wspólne</td><td>0,125% Trypsyna/Versene&nbsp; &nbsp; pH 7,0 + 0,3&nbsp;</td><td>Służy do trypsynizacji komórek</td></tr></tbody></table>

ulepszanie modeli 2d i 3d skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Rodzina glikoprotein kolagenów reprezentuje główne białka strukturalne w ludzkim ciele i są kluczowymi składnikami biomateriałów stosowanych w nowoczesnej inżynierii tkankowej. Technicznym wąskim gardłem jest odkładanie się kolagenu in vitro, ponieważ jest ono notorycznie powolne, co skutkuje nieoptymalnym tworzeniem tkanki łącznej i późniejszą spójnością tkanek, szczególnie w modelach skóry. W tym miejscu opisujemy metodę, która polega na dodawaniu kopolimerów sacharozy o różnej wielkości do kultur skórnych w celu wytworzenia stłoczenia makromolekularnego (MMC), co skutkuje radykalnym zwiększeniem odkładania kolagenu. W szczególności fibroblasty skórne zdeponowały znaczną ilość kolagenu I/IV/VII i fibronektyny pod MMC w porównaniu z grupą kontrolną.
Protokół opisuje również metodę decelularizacji stłoczonych warstw komórek, odsłaniając znaczne ilości macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zostały zatrzymane na powierzchni hodowli, czego dowodem jest immunocytochemia. Całkowitą masę i rozkład matrycy badano za pomocą mikroskopii interferencyjnej i refleksyjnej. Co ciekawe, fibroblasty, keratynocyty i kokultury wytwarzały matryce pochodzenia komórkowego (CDM) o różnym składzie i morfologii. CDM może być wykorzystywane jako "bio-rusztowania" do wtórnego wysiewu komórek, gdzie można uniknąć obecnego stosowania powłok lub rusztowań, zazwyczaj pochodzących z ksenogennych źródeł zwierzęcych, przechodząc w ten sposób do bardziej istotnych klinicznie zastosowań.
Ponadto, ten protokół opisuje zastosowanie MMC podczas fazy zanurzonej modelu 3D-organotypowej kokultury skóry, co było wystarczające do zwiększenia odkładania się ECM w połączeniu skórno-naskórkowym (DEJ), w szczególności kolagenu VII, głównego składnika włókienek kotwiczących. Mikroskopia elektronowa potwierdziła obecność włókienek kotwiczących w kulturach opracowanych za pomocą MMC, w porównaniu z kontrolą. Jest to istotne, ponieważ zakotwiczenie włókienek wiąże skórę właściwą z naskórkiem, stąd posiadanie wstępnie uformowanego dojrzałego DEJ może przynieść korzyści biorcom przeszczepu skóry pod względem stabilności przeszczepu i ogólnego gojenia się ran. Co więcej, czas hodowli został skrócony z 5 tygodni do 3 tygodni, aby uzyskać dojrzały konstrukt, przy użyciu MMC, co zmniejszyło koszty.

Stresowanie makromolekularne pozwoliło zwiększyć depozycję ECM; w szczególności fibroblasty zdeponowały więcej kolagenu I, IV oraz fibronektyny w porównaniu z kulturami kontrolnymi (Rycina 1, Warstwa komórkowa; 1A, kolagen I; 1B, kolagen IV; 1C, fibronektyna). Po decelularyzacji stało się oczywiste, że fibroblasty były głównymi depozytorami kolagenu I, IV i fibronektyny w porównaniu z keratynocytami (Rycina 1</str...

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie depozycji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz udoskonalenie obecnych modeli skóry 2D i 3D poprzez zastosowanie zagęszczania makromolekularnego (macromolecular crowding). Zagęszczanie poprawia generowanie macierzy pochodzenia komórkowego oraz dojrzałych kultur organotypowych w skróconym czasie. Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, ponieważ oferuje ulepszone sposoby wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowych pochodzenia komórkowego do bioinżynierii skóry oraz innych tkanek.Główną zaletą tej techniki jest możliwość generowania macierzy pochodzenia komórkowego oraz organotypowych konstruktów skóry w znacznie krótszym czasie dzięki zastosowaniu zagęszczania makromolekularnego w tych kulturach. Technika mikroskopii odblaskowej pozwala na wizualizację całkowitego osadzania macierzy zewnątrzkomórkowej bez konieczności barwienia przeciwciałami. Zastosowania tych technik obejmą szeroki zakres – od badań nad odkładaniem macierzy zewnątrzkomórkowej przez komórki skóry, po ulepszone terapie ran, szczególnie w zakresie tworzenia lepszych ekwiwalentów skóry i kultur tkankowych do przeszczepów.Na początek

improving-2d-and-3d-skin-in-vitro-models-using-macromolecular-crowding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół opisuje użycie makromolekularnego stłoczenia do stworzenia in vitro modelu ludzkiej przerostowej tkanki bliznowatej, która przypomina warunki in vivo. Uprawiane w zatłoczonym środowisku makromolekularnym fibroblasty ludzkiej skóry wykazują fenotypy, biochemię, fizjologię i cechy funkcjonalne przypominające tkankę bliznowatą.

Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący...

Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Poznaj metodę stłoczenia makromolekularnego do tworzenia macierzy pochodzenia komórkowego dla inżynierii tkankowej skóry. Technika ta skraca czas hodowli organotypowych modeli 3D przy zachowaniu dojrzałości konstruktów.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Przeglądaj więcej filmów