Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa osadzania się macierzy zewnątrzkomórkowej i poprawa obecnych modeli skóry 2D i 3D przy użyciu stłoczenia makromolekularnego. Stłoczenie poprawia wytwarzanie matryc pochodzących z komórek i dojrzałych kultur organotypowych w skondensowanych ramach czasowych. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, ponieważ oferuje ulepszone sposoby generowania matryc zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek do bioinżynierii skóry i innych tkanek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że matryce komórkowe i organotypowe konstrukty skóry mogą być generowane w znacznie skondensowanych ramach czasowych przy zastosowaniu stłoczenia makromolekularnego do tych kultur. Technika mikroskopii interferencyjnej refleksyjnej pozwala na wizualizację całkowitego osadzania się macierzy zewnątrzkomórkowej bez konieczności barwienia przeciwciałami. Zastosowania tych technik będą obejmować zarówno badania nad odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej przez komórki skóry, jak i ulepszone terapie ran, zwłaszcza w zakresie generowania lepszych odpowiedników skóry i hodowli tkankowych do przeszczepu.

Na początek wysiewaj 50 000 pierwotnych fibroblastów, pierwotnych keratynocytów lub kokultury obu, w jednym mililitrze pożywki pro basen, do dołków 24-dołkowej płytki. Pozwól komórkom przylegać przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie wyrzuć starą pożywkę i zastąp ją jednym mililitrem świeżej pożywki zawierającej makromolekularne tłumiki i 100-mikromolowy kwas askorbinowy.

Inkubuj kultury przez sześć dni, zmieniając podłoże co dwa dni. Przeprowadź immunofluorescencję i Western blot zgodnie z protokołem tekstowym. Aby stworzyć i użyć matrycy pochodzącej z komórki, po wyhodowaniu komórek przez sześć dni za pomocą molekularnych spikerów i kwasu askorbinowego, jak właśnie pokazano, zdecelularyzuj warstwy komórek, aby uzyskać matrycę pochodzącą z komórki, najpierw używając 1X PBS do dwukrotnego przemycia warstw komórkowych.

Odessać PBS, a następnie dodać 250 mikrolitrów 0,5% deoksycholanu sodu i inkubować na lodzie przez 10 minut. Odessać lizat komórkowy, a następnie dodać dodatkowe 250 mikrolitrów 0,5% deoksycholanu sodu i powtórzyć 10-minutową inkubację i aspirację jeszcze dwa razy. Użyj wody destylowanej, aby dwukrotnie umyć matrycę pochodzącą z komórek.

Zassać wodę, a następnie dodać 1X PBS. Przechowuj matrycę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Aby przygotować wtórną zawiesinę komórek, należy odessać PBS z matrycy i zasiać 50 000 keratynocytów na przykład na wierzchu maty F.

Pozwól komórkom przylegać przez noc. Aby przeprowadzić mikroskopię interferencyjno-refleksyjną (RIM) na matrycy komórkowej, należy przeprowadzić akwizycję obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego zgodnie z protokołem tekstowym. Aby odlać żel kolagenowy z fibroblastami zamkniętymi we wkładce do hodowli komórkowej, podwielokrotność 10 mililitrów kolagenu typu pierwszego z ogona szczura należy umieścić w zimnej zlewce.

Dodaj jeden mililitr zimnego DMEM i 0,5 mililitra jednego molowego wodorotlenku sodu, aby zneutralizować kwaśny kolagen. Następnie dodaj 0,5 mililitra zawiesiny fibroblastów. Za pomocą zimnej pipety równomiernie podzielić 12 mililitrów roztworu na wkładki do hodowli komórkowych w sześciodołkowej płytce hodowlanej.

Inkubuj żel w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Gdy żel zastygnie, zanurz go w pożywce fibroblastowej lub FM. Następnie po inkubacji przez 24 godziny odessać FM. Użyj czterech mililitrów świeżej pożywki zawierającej tłumiki makromolekularne, aby zastąpić stary FM, dodając dwa mililitry do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej i dwa mililitry na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej. Po 24-godzinnej inkubacji użyj 0,125% środka oszukującego trypsynę, aby trysonizować keratynocyty.

Delikatnie postukaj w boki kolby, aby usunąć komórki i dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zneutralizować trypsynę. Po policzeniu komórek przygotuj zawiesinę keratynocytów. Następnie odessać pożywkę z wkładek do hodowli komórkowych i dodać keratynocyty do górnej części żelu.

Inkubuj żel przez godzinę. Po przyczepieniu się keratynocytów do powierzchni żelu, użyj dwóch mililitrów pożywki KSFM lub CTN-57 bez surowicy, aby zanurzyć komórkę wewnątrz żelowej wkładki hodowlanej i dodaj dwa mililitry FM na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej. Po 24-godzinnej inkubacji wyrzuć starą pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką zawierającą tłumy makromolekularne.

Po siedmiu dniach w zanurzonej kulturze, aby podnieść kulturę do granicy faz powietrze-ciecz, przenieś wkładkę do kultury na płytkę z głęboką studzienką. Dodaj 10 mililitrów pożywki stratyfikacyjnej na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej, utrzymując wnętrze wkładki w stanie suchym. Na koniec inkubuj kultury i zmieniaj podłoże co trzy dni przez 14 dni.

Zbierz je i przetwórz zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, stłoczenie makromolekularne pozwoliło fibroblastom na zdeponowanie większej ilości macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM w porównaniu z kulturami kontrolnymi. Po sekularyzacji stało się oczywiste, że fibroblasty były głównymi depozytorami kolagenu jeden, kolagenu czwartego i fibronektyny.

Liczba ta pokazuje, że to fibroblasty, a nie keratynocyty, były głównymi depozytorami kolagenu 7 i jest to pierwsze doniesienie o udanym depozycji kolagenu 7 in vitro. Za pomocą RIM udało się uchwycić pełny zakres macierzy pochodzącej z komórek. Nakładanie obrazu RIM z barwieniem przeciwciał pokazuje względną ilość tego składnika ECM w stosunku do całkowitej ilości ECM.

W modelu 3D skóry in vitro, stłoczenie makromolekularne lub MMC, skróciło czas hodowli z pięciu tygodni do trzech, aby uzyskać dojrzałą organotypową kokulturę skóry. Jak widać tutaj, przez barwienie H i E, po trzech tygodniach posiew z MMC składał się z naskórka rozwarstwionego opłucnej i skóry właściwej stromolowej grzbietowej. Ponadto wykryto intensywne i ciągłe barwienie immunologiczne kolagenu siedem na skrzyżowaniu dermiepidermalnym zatłoczonych kultur komórkowych w porównaniu ze słabym i nierównym barwieniem immunologicznym kolagenu siedem w kulturach kontrolnych.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała również obecność włókienek kotwiczących w kulturach organotypowych generowanych za pomocą MMC, wykazując funkcjonalny kolagen siedem. Matryce pochodzące z komórek mogą być wykorzystywane do wtórnego wysiewu komórek jako alternatywne rusztowanie, ponieważ złożoność macierzy zewnątrzkomórkowej jest utrzymywana i jest wytwarzana przez same komórki. Organotypowe kultury skóry, które są generowane w warunkach stłoczenia makromolekularnego, mogą być wykorzystane jako ulepszony model skóry 3D, ponieważ zawierają skórę właściwą zrębu grzbietowego, główne połączenie dermalepidermalne i naskórek z rozwarstwieniem opłucnej.

Hodowle organotypowe lub równoważne skórze wygenerowane za pomocą makromolekularnych tłumów mogą być również wykorzystywane do przeszczepu skóry, ponieważ mają lepiej rozwinięte połączenie dermalepidermalne, co prawdopodobnie poprawi powodzenie przeszczepu. Oprócz ulepszonego osadzania macierzy zewnątrzkomórkowej, stłoczenie makromolekularne można zastosować do innych systemów in vitro w celu wzmocnienia reakcji z ograniczoną szybkością, bez konieczności zwiększania ilości odczynników. Na przykład reakcje łańcuchowe polimerazy.