Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Ogólnym celem tej metodologii jest wytworzenie macierzy przeciwciał do zastosowań w analizie pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie analizy pojedynczych komórek, takie jak to, w jaki sposób możemy jednocześnie wykrywać tajne białka i białka wewnątrzkomórkowe z tej samej pojedynczej komórki. I jak możemy wyprodukować platformę mikromacierzy, aby osiągnąć ten cel.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować. Poprzez różnicowanie strategii wzorców przepływu można tworzyć tablice o różnych wymiarach. Wcześniej wygeneruj wzorzec SU-8 dla wzorców przepływu kodów kreskowych.

Instrukcje znajdują się w protokole tekstowym. Wiąże się to z zaprojektowaniem i wykonaniem chromowanej fotomaski. Umieszczenie maski na warstwie fotorezystancyjnej i nałożenie UV zapewnia wzór.

Aby rozpocząć przygotowywanie formy do kodów kreskowych PDMS, połącz 40 gramów bazy z elastomeru silikonowego z czterema gramami utwardzacza, a następnie energicznie mieszaj przez 10 minut. Następnie odgazowuj roztwór prepolimeru przez 20 minut w próżni. Następnie załaduj roztwór na szalkę Petriego zawierającą płytkę krzemową z wzorcem SU-8 wzoru kodu kreskowego.

Wlej roztwór na głębokość 7,45 milimetra. Następnie odgazuj mieszaninę w naczyniu, aby usunąć wszelkie pozostałe bąbelki. Postępuj zgodnie z odgazowaniem, piecząc mieszaninę przez godzinę w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby utwardzić PDMS.

Następnie, tnąc skalpelem, ostrożnie wyjmij formę do kodów kreskowych. Następnie ostrożnie oderwij płytę od wafla. Następnie przytnij krawędzie płyty, aby uzyskać pożądany kształt formy.

Zakończ formę za pomocą stempla do biopsji z tłokiem, aby wybić półmilimetrowe otwory w okrągłych elementach wzoru, które reprezentują wloty i wyloty. Po zdmuchnięciu kurzu ze szkiełka szklanego pokrytego poli-L-lizyną za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem, przymocuj formę PDMS do szkiełka. Ostrożnie wyrównaj krawędzie formy ze szkiełkiem.

Teraz piecz zestaw przez 90 minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby wzmocnić połączenie między PDMS a szkiełkiem. W międzyczasie przygotuj 20 sztuk elastycznych rurek polietylenowych do wlotów i wylotów. Na każdym kawałku rurki przymocuj wydrążony kołek ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra.

Następnie za pomocą szpilek wypełnij odcinki centymetrem lub więcej poli-L-lizyny. Po przyklejeniu do szkła ostrożnie przymocuj kołki do wlotów formy. Jest to najtrudniejszy etap przygotowań.

Nie spiesz się z procesem. Podłącz drugi koniec rurek do zestawu zbiornika azotu o regulowanym ciśnieniu, który składa się z sieci 20 zaworów trójdrogowych i może obsługiwać dwie formy jednocześnie. Korzystając z konfiguracji, przedmuchuj roztwór przez formę przy 0,5 do jednego PSI przez co najmniej sześć godzin.

Zacznij od zasysania świeżo przygotowanych jednoniciowych roztworów DNA w BS-3 przez kołki ze stali nierdzewnej i do rurki polietylenowej. Następnie połącz formę PDMS ze źródłem azotu i przepływaj roztwór przez formę kodów kreskowych przez około 40 minut lub do momentu, gdy wszystkie kanały zostaną wypełnione. Następnie zatrzymaj przepływ i pozwól pleśni inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po kilku godzinach piecz formę do kodów kreskowych w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez godzinę. Po upieczeniu odłącz formę od szkiełka i delikatnie umyj szkiełko za pomocą 01%SDS. Następnie umyj szkiełko trzykrotnie ultraczystą wodą.

Postępuj zgodnie z praniem, susząc szkiełko z kodem kreskowym za pomocą wirówki do szkiełka. Po wyschnięciu przechowuj szkiełko z kodem kreskowym w czystej tubie o pojemności 50 mililitrów. Aby kontynuować, postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby zweryfikować jednowymiarowy wzorzec.

Aby przeprowadzić procedurę walidacji, zablokuj szkiełko, zhybrydyzuj z nim cyjaninę trzy komplementarne DNA i zmierz wyniki. Wzorzec SU-8 dla układu trzy na trzy ma wzór przepływu prostopadły do pierwszego projektu. Użyj wcześniej opisanej metody, aby wykonać nową formę PDMS tego wzoru.

Na początek wykonaj świeże stężenia robocze dziewięciu oligonukleotydów. Teraz wlej trzyprocentowy roztwór blokujący BSA do wszystkich 20 kanałów szkiełka matrycowego przez godzinę przy ciśnieniu od 0,5 do jednego PSI. Następnie załaduj roztwory DNA do odpowiednich kanałów.

Po przelaniu ich przez około 40 minut, inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić hybrydyzację DNA. Następnie przez godzinę wlewaj trzyprocentowy roztwór blokujący BSA do wszystkich 20 kanałów. Spowoduje to usunięcie niezhybrydyzowanego DNA.

Teraz oderwij szkiełko macierzy od PDMS i zanurz suwak w trzech procentach BSA raz. Następnie zanurz slajd w PBS dwukrotnie, a następnie raz zanurz w dwóch procentach PBS. Następnie, tak jak poprzednio, osusz szkiełko za pomocą wirnika do szkiełek mikroskopowych.

Aby kontynuować, wykonaj krok walidacji podobny do sprawdzania poprawności slajdów jednowymiarowych. Użyj oligonukleotydów od jednego do dziewięciu pierwszych, wszystkie sprzężone z cyjaniną trzecią. Zachowaj szkiełko trzy na trzy w 50-mililitrowej probówce wirówkowej do późniejszego użycia.

Protokół tekstowy wyjaśnia ponadto, w jaki sposób przekształcić macierz DNA w macierz przeciwciał. Po przygotowaniu i oczyszczeniu koniugatów przeciwciało-oligo, należy przygotować kolejną formę PDMS z mikrokomorami. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście.

Połącz tę formę ze szkiełkiem tablicy. Teraz zablokuj szkiełko jednym procentem BSA i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji należy przygotować 200 mikrolitrów koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd.

Po bloku dodaj koktajl przeciwciało-oligo do zestawu. Pozwól przeciwciałom inkubować na matrycy przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie wyczyść i wysusz szkiełko przed przystąpieniem do zanurzania szkiełka opisanego w protokole tekstowym. Po wykonaniu opisanego protokołu, przy użyciu macierzy trzy na trzy, otrzymany panel przeciwciał wykorzystano w detekcji multiplex, głównie za pomocą platformy ELISA typu sandwich.

Białka wykazywały mniej niż 10% odchylenie od jednego końca do drugiego końca szkiełka. Na matrycy trzy na trzy można wykryć do siedmiu białek wraz z odniesieniem znakowanym cyjaniną trzy i kontrolą ujemną. W eksperymencie jednokomórkowym przeprowadzonym na potrzeby badania nad nowotworem, wszystkie sześć białek wykryto jednocześnie.

W celu kalibracji rekombinowane białka zastosowano do macierzy o różnych stężeniach. Czułość wykrywania była dość podobna do konwencjonalnego testu ELISA typu kanapkowego. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby formy PDMS były wolne od cząstek stałych.

Kurz w kanałach może powodować powstawanie macierzy o niskiej jednorodności i niskiej czułości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do badania sygnalizacji komórka-komórka przy użyciu modeli mikrośrodowisk guza.