Name: Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi pod kontrolą przepływu do analizy pojedynczych komórek. Technika umożliwia jednoczesne wykrywanie białek sekretowanych i wewnątrzkomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować funduszowi startowemu z SUNY Albany oraz dostępowi do obiektów w Centrum Badań nad Rakiem Uniwersytetu w Albany.

Uwaga: Kilka substancji chemicznych używanych w tym protokole jest drażniących i jest niebezpiecznych w przypadku kontaktu ze skórą. Przed wykonaniem tego protokołu należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Roztwór piranii użyty w Kroku (1.1.1) jest silnie i powinien być przygotowany przez powolne dodawanie nadtlenku do kwasu z mieszaniem. Z tym roztworem należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością w dygestorium. Stosować odpowiednią ochronę oczu i rękawice kwasoodporne. trimetylochlorosilan (TMCS) jest, łatwopalną substancją chemiczną stosowaną w opcjonalnym kroku po (1.1.6). Z tą substancją chemiczną należy obchodzić się pod wyciągiem.
Uwaga: Wykonaj produkcję szkiełek z kodami kreskowymi i krytyczne procedury wzorcowania przepływu w czystym pomieszczeniu, aby zminimalizować zanieczyszczenie cząstkami stałymi. Cząsteczki kurzu mogą blokować porty i mikrokanały form PDMS i zakłócać wzorzec przepływu.
1. Budowa jednowymiarowego slajdu z kodem kreskowym DNA
<ol>
	<li>Przygotowanie wzorca SU-8 do wzorców przepływu kodów kreskowych 
	Uwaga: Rysunki dla schematów przepływu prostopadłego (rysunek 1A-B) są tworzone przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Te wzory są renderowane na chromowanej fotomasce. Przezroczyste obszary maski odpowiadają cechom mistrza SU-8.
	<ol>
		<li>Płytkę krzemową (o średnicy 100 mm) należy dokładnie oczyścić w mieszaninie 3H2SO4: 1 30% H2O2 (roztwór piranii) podgrzanej do temperatury 96 °C. Płytkę umyć wodą dejonizowaną i alkoholem izopropylowym, a następnie wysuszyć pistoletem do przedmuchiwania azotem.</li>
		<li>Na wafel wlać około 4 ml fotorezystu SU-8 2025. Użyj programowalnej powlekarki wirowej, aby równomiernie rozprowadzić fotorezystor na płytce przez 10 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 3,000 obr./min. W ten sposób powstaje warstwa fotorezystu o grubości ~25 μm. Stopniowo pozwól, aby wirowanie zwolniło przed zatrzymaniem — ma to na celu utrzymanie równomiernej powłoki na powierzchni wafla.</li>
		<li>Powlekany wafel pieczemy na płycie grzejnej przez 1 minutę w temperaturze 65 °C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Ten krok pozwala na zestalenie się powłoki. Schłodzić do RT przez 5 min.</li>
		<li>Umieść chromowaną maskę (Rysunek 1C) na powłoce fotorezystu. Wystaw maskę na działanie światła bliskiego UV (350-400 nm, energia ekspozycji 150-160 mJ/cm2) przez 20 sek. 
		Uwaga: Wzór na chromowanej masce zawiera 20 kanałów, z których każdy ma szerokość 20 μm i rozstaw 50 μm. Kanały wiją się od jednego końca wzoru do przeciwległego końca. W sumie 20 kanałów pokrywa prostokątny obszar o długości ~40 mm i szerokości ~20 mm. Każdy kanał jest otoczony dwoma okrągłymi elementami, które odpowiadają wlotowi i wylotowi. Wloty i wyloty są wymienne.</li>
		<li>Piecz odsłonięty wafel na płycie grzejnej przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Stopniowo schładzaj do temperatury RT.</li>
		<li>Zanurz wafel w wywoływaczu SU-8 z mieszaniem na 5 minut. Umyj wafel niewielką porcją świeżego wywoływacza SU-8, a następnie alkoholem izopropylowym. Wysuszyć wafel za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem. Piecz wafel na twardo na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C przez 30 minut i pozwól wafli stopniowo ostygnąć do RT. 
		Uwaga: Wywoływanie można prowadzić przez dłuższy czas, jeśli po umyciu na tym etapie zaobserwuje się biały nalot. 
		Opcjonalnie: Sylianizować wzorzec SU-8, wystawiając go na działanie oparów trimetylochlorosilanu na zamkniętej szalce Petriego przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie formy do kodów kreskowych PDMS
	<ol>
		<li>Połącz 40,0 g bazy z elastomeru silikonowego z 4,0 g utwardzacza. Mieszaninę prepolimerów energicznie mieszać przez 10 minut. Odgazowuje przez 20 minut pod próżnią. 
		Uwaga: Z reguły należy stosować stosunek masy 10:1 (baza: utwardzacz).</li>
		<li>Wlej prepolimer na szalkę Petriego zawierającą płytkę krzemową z wzorcem SU-8 wzoru kodu kreskowego. Wysokość mieszaniny PDMS powinna wynosić około 7,5 mm lub więcej. Odgazować mieszaninę na szalce Petriego po raz drugi, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki, a następnie piec mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 75 °C, aby umożliwić PDMS utwardzenie się. 
		Uwaga: Ważne jest, aby utrzymać wystarczającą grubość płyty PDMS na poziomie ~7.5 mm lub większym, aby uniknąć zbyt dużego naprężenia połączenia PDMS ze szkłem po włożeniu kołków/rurek przez otwory w formie PDMS w kroku (1.3.3.1)</li>
		<li>Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć obszar płyty PDMS, która zawiera elementy formy z kodem kreskowym, i oderwij płytę od płytki.</li>
		<li>Przytnij krawędzie płyty, aby uzyskać pożądany kształt formy kodów kreskowych PDMS. Przebij 20 otworów (o średnicy 1,0 mm) przez formę za pomocą stempla biopsyjnego z tłokiem. Upewnij się, że otwory są wyrównane z okrągłymi elementami wzoru kodu kreskowego. Otwory te służą jako wloty i wyloty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednowymiarowe wzorowanie poli-L-lizyny (PLL)
	<ol>
		<li>Usuń kurz z powierzchni szkiełka pokrytego poli-L-lizyną za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem. Przymocuj formę PDMS do czystego szkiełka podstawowego. Upewnij się, że krawędzie formy i suwaka są wyrównane.</li>
		<li>Piecz przez 1,5 godziny w temperaturze 75 °C, aby wzmocnić połączenie między formą PDMS a szkiełkiem pokrytym PLL. W międzyczasie przygotuj 20 sztuk elastycznych rurek polietylenowych (kawałki od 3 do 4 cali, o średnicy wewnętrznej 0,5 mm i średnicy zewnętrznej 1,5 mm). 
		Uwaga: Liczba kawałków rurki odpowiada liczbie wlotów w formie kodów kreskowych PDMS. Rurka służy do łączenia kanałów na formie kodów kreskowych PDMS ze zbiornikiem azotu wyposażonym w regulator ciśnienia.</li>
		<li>Do jednego końca każdego kawałka rurki przymocuj drążony kołek ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm). Zassać sterylnie przefiltrowany roztwór poli-L-lizyny przez szpilkę, aż co najmniej 1 cm rurki zostanie wypełnione roztworem.
		<ol>
			<li>Przymocuj kołki (podłączone do rurki wypełnionej roztworem) do wlotów formy kodów kreskowych PDMS (Rysunek 1E). Podłącz drugi koniec rurek do zbiornika azotu o regulowanym ciśnieniu. Pozwól, aby roztwór przepłynął przez formę w zakresie ciśnienia 0,5-1 psi przez co najmniej 6 godzin. 
			Uwaga: Patrz krok (1.3.3), aby zapoznać się ze wszystkimi procedurami dotyczącymi wzorca przepływu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednowymiarowe wzorcowanie ssDNA 14 
	Uwaga: Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowana w kolejnych etapach jest przygotowywana ze 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4. pH buforu wynosi 7,4.
	<ol>
		<li>Przygotować 2 mM roztwór suberanu bis(sulfosuccinimidylo)(BS3) w PBS. Przygotować 300 μM roztwory ssDNA A, B i C (modyfikowane 5'-aminami, 80 nukleotydów) w PBS lub wodzie ultraczystej. 
		Uwaga: Roztwór BS3 należy zużyć w ciągu około 30 minut po przygotowaniu, ponieważ ester N-hydroksysukcynimidu łatwo ulega hydrolizie.</li>
		<li>Połącz 2,5 μl 300 μM A, B lub C ssDNA z 2,5 μl 2 mM suberatu bis(sulfosuccinimidylo) w PBS dla każdego kanału. DNA A, B i C są oznaczone odpowiednio dla kanałów 1, 2 i 3. Kolejność ta jest również stosowana do pozostałych zestawów 3 kanałów (Rysunek 2A).</li>
		<li>Wykonaj krok (1.3.3). Tym razem zassaj 5-μl roztwory BS3/DNA przez kołki ze stali nierdzewnej i do rurki polietylenowej, a następnie połącz formę PDMS ze źródłem azotu. Pozwól, aby roztwór BS3/DNA przepływał przez formę kodów kreskowych przez około 40 minut lub do momentu, gdy kanały zostaną wypełnione.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ po wypełnieniu wszystkich kanałów, a następnie inkubuj roztwór BS3/DNA w kodzie kreskowym w RT przez 2 godziny. Nie dopuścić do wyschnięcia roztworu. Piecz formę PDMS z dołączonym szkiełkiem z kodami kreskowymi przez 1 godzinę w temperaturze 75 °C. 
		Uwaga: Aby ułatwić wyrównanie w kolejnych krokach wzorca przepływu, krawędzie wzoru kanału na slajdzie z kodem kreskowym mogą być obrysowane. Odbywa się to poprzez staranne zarysowanie powierzchni szkła za pomocą rysika diamentowego w celu wygenerowania znaczników wyrównania na spodzie szkiełka. Wyrównanie w późniejszych etapach protokołu może być sprawdzane pod mikroskopem.</li>
		<li>Wyjmij formę PDMS ze szkiełka z kodami kreskowymi. Delikatnie umyj szkiełko 0,01% SDS raz i trzy razy ultraczystą wodą.
		<ol>
			<li>Wysuszyć szkiełko z kodem kreskowym za pomocą wirnika do szkiełek mikroskopowych. Przechowuj szkiełko z kodem kreskowym w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do późniejszego użycia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Walidacja jednowymiarowego wzoru na slajdzie z kodem kreskowym
Uwaga: Ten protokół walidacji może być również dostosowany do oceny jakości kolejnych etapów wzorca przepływu.
<ol>
	<li>Blokowanie zjeżdżalni
	<ol>
		<li>Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Przed użyciem przefiltrować ten roztwór przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. Za pomocą końcówki do nakładania żelu nanieś 50 μl 1% roztworu BSA na jedną krawędź szkiełka z kodami kreskowymi.</li>
		<li>Inkubować 1% roztwór BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja z komplementarnym DNA sprzężonym z cyjaniną 3 (Cy3)
	<ol>
		<li>Przygotuj koktajl oligonukleotydów A', B' i C' sprzężonych z Cy3 na jednym końcu. Sekwencje A', B' i C' są komplementarne do sekwencji odpowiednio A, B i C. Stężenie robocze Cy3-DNA wynosi 0,05 μM w 0,1% BSA.</li>
		<li>Usunąć roztwór BSA ze szkiełka za pomocą pipetowania, a następnie nanieść 30 μl roztworu koktajlu DNA na tę samą krawędź szkiełka. Inkubować koktajl Cy3-DNA na szkiełku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wykonaj ten etap inkubacji w ciemności, aby chronić ugrupowanie Cy3 przed fotowybielaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza intensywności fluorescencji
	<ol>
		<li>Odpipetować koktajl Cy3-DNA i umyć szkiełko w 1% BSA, PBS, a na koniec w rozcieńczonym PBS (1 część PBS z 50 częściami ultraczystej wody). Wysuszyć szkiełko za pomocą wirówki.</li>
		<li>Obserwuj fluorescencję (rysunek 2B) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera mikromatrycowego. W przypadku korzystania ze skanera mikromatrycowego należy ustawić długość fali emisji lasera na 532 nm, rozmiar piksela na 5 mikronów, wzmocnienie lampy fotopowielacza (PMT) na 450 i moc na 15%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja dwuwymiarowej (3x3) matrycy DNA14
<ol>
	<li>Przygotowanie formy do kodów kreskowych PDMS
	<ol>
		<li>Wykonaj procedurę (1.1) w celu skonstruowania kolejnego wzorca SU-8, ale tym razem użyj chromowanej maski ze wzorem przepływu prostopadłym do tego z pierwszego projektu. Wykonać procedurę (1.2) w celu skonstruowania nowej formy PDMS z prostopadłym wzorem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dwuwymiarowy wzorzec przepływu ssDNA
	<ol>
		<li>Dla macierzy 3 x 3 przygotuj 150 μM roztworów podstawowych A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'-viii i C'-ix DNA w 3% BSA/PBS. Te oligonukleotydy służą jako "sekwencje pomostowe" (ryc. 2A). Połączyć roztwory oligonukleotydów (roztwory 1-3) tak, aby stężenie robocze wynosiło 50 μM dla każdego oligonukleotydu. Skorzystaj z przewodnika zamieszczonego w Tabeli 1.</li>
		<li>Przepływ 3% roztworu blokującego BSA/PBS do wszystkich 20 kanałów przez 1 godzinę przy 0,5-1 psi.</li>
		<li>Przepływaj roztwory 1, 2 i 3 odpowiednio do kanałów 1, 2 i 3. Postępuj zgodnie z tą kolejnością dla kolejnych zestawów 3 kanałów. Przepływ jest zwykle zakończony w około 40 minut. Inkubuj roztwory DNA w RT przez 2 godziny, aby umożliwić hybrydyzację DNA.</li>
		<li>Przelej 3% roztwór blokujący BSA/PBS do wszystkich 20 kanałów przez 1 godzinę przy 0,5-1 psi, aby usunąć niezhybrydyzowane DNA. Oderwij płytę PDMS i umyj powstałe szkiełko z mikromacierzy DNA, zanurzając szklane szkiełko w 3% BSA/PBS raz i PBS dwukrotnie, a następnie rozcieńczony PBS (1 część PBS i 50 części ultraczystej wody). Wysuszyć szkiełko za pomocą wirówki mikroskopowej.</li>
		<li>Wykonaj drugi krok walidacji (rysunek 2C) podobny do opisanego w sekcji 2. Użyj oligonukleotydów od i' do ix', które są sprzężone z Cy3. Przechowuj szkiełko podstawowe 3 x 3 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do późniejszego użycia. 
		Uwaga: Mikromacierz DNA może być przechowywana w temperaturze pokojowej w eksykatorze przez wiele miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konwersja macierzy DNA 3 x 3 na matrycę przeciwciał
<ol>
	<li>Otrzymywanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd (DEAL)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory 200 mM sukcynimidylo-4-formylobenzoesanu (S-4FB) i 40 mM sukcynimidylo-6-hydrazynonikotynamidu (S-HyNic) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (DMF).</li>
		<li>Przygotować do 7 oddzielnych roztworów przeciwciał wychwytujących (1 mg/ml) w PBS. 
		Uwaga: Jeśli roztwory podstawowe przeciwciał zawierają bakteriostat azydekowy sodu, należy przeprowadzić wymianę buforu z PBS za pomocą wirowych kolumn odsalających z odcięciem masy cząsteczkowej 7 kDa (MWCO).</li>
		<li>Przygotować oddzielne roztwory 400 μM DNA i', ii', iii', iv', v', vi' i vii'. Przypisz każde przeciwciało wychwytujące do jednej sekwencji oligonukleotydowej. Połącz 40 μl 400 μM DNA z 12,25 μl DMF w probówkach do mikrowirówek i odwiruj w dół, aby dokładnie wymieszać.
		<ol>
			<li>Do każdego roztworu DNA/DMF dodać 2,3 μl 200 mM S-4FB w DMF. Na każde 100 μg wychwytu przeciwciała dodać 2,25 μl 40 mM S-HyNic w DMF.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować roztwory przeciwciała/S-HyNic i DNA/S-4FB przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotowując się do reakcji sprzęgania przeciwciało-DNA, należy przygotować nowe kolumny odsalania wirowego (po jednej dla każdego roztworu DNA i jednej dla każdego przeciwciała), przemłukując je buforem cytrynianowym o pH 6.</li>
		<li>Po 4 godzinach inkubacji przeprowadzić wymianę buforu dla każdego roztworu przeciwciała/S-HyNic i DNA/S-4FB. Połączyć oligonukleotydy i', ii', iii', iv', v', vi' i vii' sprzężone z S-4FB z koniugatami przeciwciała S-HyNic. Inkubować mieszaniny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować reakcję O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd (DEAL) 
	Uwaga: Aby oczyścić koniugaty przeciwciało-oligonukleotyd, należy przeprowadzić szybką chromatografię cieczową białek (FPLC) na standardowym systemie FPLC wyposażonym w kolumnę Superose 6 10/300 GL.
	<ol>
		<li>Ustaw długość fali detektora UV systemu FPLC na 280 nm. Użyć izokratycznego przepływu PBS (pH 7,4) z prędkością 0,3 ml/min w celu oddzielenia koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd od nadmiaru S-4FB-DNA.</li>
		<li>Zebrać frakcje zawierające koniugat i zagęścić frakcje do objętości 150 μl za pomocą filtrów wirowych z MWCO 10 kDa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dwuwymiarowe wzorcowanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Przygotować kolejną formę PDMS z mikrokomorami lub mikrostudzienkami, stosując procedury produkcyjne opisane w kroku (1.2). Forma PDMS może zawierać studzienki o pojemności od mikrolitrów do nanolitrów do testów immunologicznych. 
		Uwaga: W celu ogólnego wykrywania biomarkerów w próbkach płynnych, forma PDMS z wieloma dołkami jest łączona ze szkiełkiem matrycowym. Cechy formy PDMS zależą od badanego systemu. Na przykład wykrywanie białek z eksperymentów na pojedynczych komórkach można przeprowadzić za pomocą formy PDMS zawierającej mikrokomory o objętości 0,15 NL.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Poddaj formę PDMS czyszczeniu plazmowemu (18 W) przez 1,5 minuty, aby jej wzorzysta powierzchnia stała się hydrofilowa. Przed czyszczeniem plazmowym należy użyć taśmy klejącej, aby zablokować wszystkie inne powierzchnie, które będą bezpośrednio połączone ze szkiełkiem 3 x 3. 
		Uwaga: Krok (4.3.2) jest opcjonalny, ale zwykle jest wykonywany, gdy forma PDMS jest przeznaczona do użytku w eksperymentach z pojedynczymi komórkami.</li>
		<li>Połącz formę PDMS ze szkiełkiem z matrycą 3 x 3, a następnie zablokuj szkiełko za pomocą 1% BSA w PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj koktajl (200 μl końcowej objętości) koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd. Stężenie robocze każdego koniugatu wynosi 10 μg/ml w 1% BSA/PBS.</li>
		<li>Dodać koktajl przeciwciało-oligonukleotyd, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ugrupowanie oligonukleotydowe koniugatów na hybrydyzację z określonymi plamkami na matrycach 3 x 3, przekształcając w ten sposób macierz DNA w matrycę przeciwciał.</li>
		<li>Powtórzyć krok (3.2.4), aby wyczyścić i osuszyć szkiełko. Najwyższą czułość można osiągnąć, jeśli matryca przeciwciał zostanie użyta natychmiast. Długotrwałe przechowywanie może spowodować utratę wrażliwości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie białek
	<ol>
		<li>Rozpuść rekombinowane białka lub przygotuj przefiltrowaną próbkę komórkową.</li>
		<li>Połącz mikromacierz ze specjalnie zaprojektowanym chipem i zablokuj powierzchnię za pomocą 3% BSA w PBS przez 1 godzinę. Następnie usunąć roztwór BSA, nałożyć próbki i inkubować przez 2 godziny.</li>
		<li>Próbki należy trzykrotnie zmyć za pomocą 3% BSA w PBS, a następnie dodać przeciwciała wykrywające w stężeniu podanym w karcie katalogowej produktu. Inkubować przez 2 godziny.</li>
		<li>Zmyć przeciwciała wykrywające trzykrotnie przez 3% BSA w PBS, a następnie dodać 5(Cy5)-streptawidynę cyjaniny w stężeniu 1 μg/ml, a następnie inkubować przez 1 godzinę.</li>
		<li>Powtórz krok (3.2.4), aby wyczyścić i osuszyć szkiełko do skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li>
<li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+barcode+chips+for+rapid%2C+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%28%2B%29+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-Uk%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li>
<li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li>
<li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+protein-protein+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Projektowanie wzorca przepływu jest pierwszym krytycznym krokiem w wytwarzaniu mikromacierzy 2D . Aby wygenerować dwa nakładające się na siebie wzory DNA na szklanym podłożu, cechy kanału pierwszego projektu powinny być prostopadłe do tych z drugiego (ryc. 1A-B). Projekty uwzględniają również dalsze zastosowania mikromacierzy. W przypadku analizy pojedynczych komórek, mikromacierz służy do wykrywania białek z pojedynczych komórek zamkniętych w mikrokomorach, dlatego wymiary kanałów są zgodne z m...

Mikromacierze przeciwciał są szeroko stosowane w badaniach proteomicznych od dziesięcioleci w celu zbadania obecności docelowych białek, w tym biomarkerów białkowych1-3. Chociaż dziedzina ta stoi obecnie przed dużymi wyzwaniami związanymi z innymi technologiami wysokoprzepustowymi, takimi jak spektrometria mas (MS), nadal istnieje wiele miejsca na użyteczność mikromacierzy przeciwciał, głównie dlatego, że urządzenia te zapewniają prostą interpretację danych i łatwy interfejs z innymi testami. W ostatnich latach integracja mikromacierzy z rusztowaniami mikroprocesorów zapewniła mikromacierz przeciwciał nową szansę na rozwój4-7. Na przykład mikromacierz kodów kreskowych zintegrowana z jednokomórkowym mikrochipem została wykorzystana w badaniach nad komunikacją komórkową8,9. Technologia ta ma wyraźną przewagę nad innymi dostępnymi technologiami mikromacierzy. Zawiera elementy matrycy o wielkości 10-100 μm, znacznie mniejsze niż typowy rozmiar 150 μm stosowany w konwencjonalnych elementach mikromacierzy. Budowa mniejszych elementów macierzy jest osiągana przy użyciu systematycznych podejść opartych na wzorcach przepływu, co prowadzi do powstania kompaktowych mikromacierzy, które mogą wykrywać białka wydzielane przez pojedyncze komórki i białka wewnątrzkomórkowe. Kolejną zaletą jest zastosowanie prostej, bezinstrumentalnej konfiguracji. Jest to szczególnie ważne, ponieważ większość laboratoriów i małych firm może nie mieć dostępu do podstawowych urządzeń do mikromacierzy. Takie mikromacierze przeciwciał z kodem kreskowym charakteryzują się zwiększoną przepustowością testu i mogą być wykorzystywane do wykonywania wysoce multipleksowanych testów na pojedynczych komórkach, osiągając jednocześnie wysoką czułość i swoistość porównywalną z konwencjonalnym testem immunoenzymatycznym typu kanapkowym (ELISA8). Technologia ta znalazła liczne zastosowania w wykrywaniu białek glejaka9-11, limfocytów T12 i krążących komórek nowotworowych13. Alternatywnie, same mikromacierze DNA z kodami kreskowymi zostały wykorzystane do precyzyjnego pozycjonowania neuronów i astrocytów w celu naśladowania składania in vivo tkanki mózgowej14.
Ten protokół skupia się tylko na etapach eksperymentalnych i blokach budowania dwuwymiarowej (2-D) mikromacierzy przeciwciał z kodem kreskowym, która ma potencjalne zastosowania w wykrywaniu biomarkerów w próbkach płynów i w pojedynczych komórkach. Technologia opiera się na adresowalnej, jednoniciowej, jednowymiarowej (1-D) mikromacierzy DNA zbudowanej przy użyciu ortogonalnych oligonukleotydów, które są wzorowane przestrzennie na podłożach szklanych. Wzór 1-D powstaje, gdy w kroku wzorca przepływu używane są równoległe kanały przepływu, a taki wzór pojawia się jako dyskretne pasma wizualnie podobne do kodów kreskowych 1-D Universal Product Code (UPC). Konstrukcja dwukierunkowej matrycy przeciwciał (n x m) – przypominająca kod matrycy 2-D Quick Response (QR) – wymaga bardziej złożonych strategii modelowania, ale pozwala na immobilizację przeciwciał przy większej gęstości8,15. Produkcja wymaga dwóch etapów modelowania DNA, z których pierwszy jest prostopadły do drugiego. Punkty przecięcia tych dwóch wzorców stanowią elementy n x m tablicy. Dzięki strategicznemu doborowi sekwencji jednoniciowego DNA (ssDNA) wykorzystywanego we wzorcu przepływu, każdemu elementowi w danej tablicy przypisuje się określony adres. To odniesienie przestrzenne jest niezbędne do rozróżnienia sygnałów fluorescencyjnych na szkiełku mikromatrycy. Macierz ssDNA jest przekształcana w macierz przeciwciał poprzez włączenie komplementarnych koniugatów DNA-przeciwciało, tworząc platformę zwaną biblioteką przeciwciał kodowanych przez DNA (DEAL16).
Ten protokół wideo opisuje kluczowe kroki w tworzeniu układów przeciwciał n x m, które obejmują przygotowanie form kodów kreskowych z polidimetylosiloksanu (PDMS), modelowanie przepływu ssDNA w dwóch orientacjach, przygotowanie koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd DEAL i przekształcenie matrycy DNA 3 x 3 w matrycę przeciwciał 3 x 3.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 baza z elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Wafle krzemowe&nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane powlekane poli-L-lizyną</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA<td>*Zamówione na zamówienie w Integrated DNA Technologies, patrz Tabela 2.</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy kleju poli-L-lizynowego</td><td>Dostawa dla nowicjuszy</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Poderat bis (sulfosukcynimidylu)&nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta Explorer 100 System szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Wychwytuj przeciwciała</td><td>różne</td><td>różne</td><td>*Wybór przeciwciał zależy od zastosowania</td></tr><tr><td>Sukcynimidylo-6-hydrazyno-nikotynamid (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Sukcynimidylo-4-formylobenzamid (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy, bezwodny</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtr wirowy 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji z tłokiem (średnica 1,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Rysik diamentowy (Styl 60)</td><td>SPI dostarcza</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Trimetylochlorosilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Mikromacierz przeciwciał jako dobrze rozwinięta technologia jest obecnie kwestionowana przez kilka innych uznanych lub powstających technologii o wysokiej przepustowości. W niniejszym raporcie odnawiamy technologię mikromacierzy przeciwciał, stosując nowatorskie podejście do produkcji i wprowadzając nowe funkcje. Wytwarzanie naszej mikromacierzy przeciwciał o dużej gęstości odbywa się poprzez prostopadłie zorientowany wzorzec przepływu jednoniciowych DNA, a następnie konwersję, w której pośredniczą koniugaty DNA-przeciwciało. Protokół ten określa krytyczne etapy wzorca przepływu DNA, produkcji i oczyszczania koniugatów DNA-przeciwciało oraz oceny jakości wytworzonej mikromacierzy. Jednorodność i czułość są porównywalne z konwencjonalnymi mikromacierzami, podczas gdy nasza produkcja mikromacierzy nie wymaga pomocy drukarki matrycowej i może być wykonywana w większości laboratoriów badawczych. Inną ważną zaletą jest to, że rozmiar naszych mikromacierzy jest 10 razy mniejszy niż w przypadku drukowanych tablic, co oferuje unikalną możliwość analizy funkcjonalnych białek z pojedynczych komórek podczas łączenia z ogólnymi projektami mikroprocesorów. Ta technologia kodów kreskowych może być szeroko stosowana w wykrywaniu biomarkerów, badaniach sygnalizacji komórkowej, inżynierii tkankowej i różnych zastosowaniach klinicznych.

Projekty form z PDMS (Rysunek 1A-1B) zostały przygotowane przy użyciu programu CAD (AutoCAD). Przedstawione dwa projekty zawierają kanały do wzorowania przepływu, jeden poziomy i jeden pionowy. Lewa i prawa część każdego projektu są symetryczne; każda z nich może pełnić funkcję wlotu lub wylotu. Każdy z 20 kanałów prowadzi kręto od jednego końca do drugiego. Każdy projekt został wydrukowany na chromowej fotomasece (Rysunek 1C). Wykonany wzorzec SU-8 na wa...

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

Ogólnym celem tej metodologii jest wytworzenie macierzy przeciwciał do zastosowań w analizie pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie analizy pojedynczych komórek, takie jak to, w jaki sposób możemy jednocześnie wykrywać tajne białka i białka wewnątrzkomórkowe z tej samej pojedynczej komórki. I jak możemy wyprodukować platformę mikromacierzy, aby osiągnąć ten cel.Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować. Poprzez różnicowanie strategii wzorców przepływu można tworzyć tablice o różnych wymiarach. Wcześniej wygeneruj wzorzec SU-8 dla wzorców przepływu kodów kreskowych.Instrukcje znajdują się w protokole tekstowym. Wiąże się to z zaprojektowaniem i wykonaniem chromowanej fotomaski. Umieszczenie maski na warstwie fotorezystancyjnej i nałożenie UV zapewnia wzór.Aby rozpocząć przygotowywanie formy do kodów kreskowych PDMS, połącz 40 gramów bazy z elastomeru silikonowego z czterema gramami utwardzacza, a następnie energicznie mieszaj przez 10 minut. Następnie odgazowuj roztwór prepolimeru przez 20 minut w próżni. Następnie załaduj roztwór na szalkę Petriego zawierającą płytkę krzemową z wzorcem SU-8 wzoru kodu kreskowego.Wlej roztwór na głębokość 7,45 milimetra. Następnie odgazuj mieszaninę w naczyniu, aby usunąć wszelkie pozostałe bąbelki. Postępuj zgodnie z odgazowaniem, piecząc mieszaninę przez godzinę w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby utwardzić PDMS.Następnie, tnąc skalpelem, ostrożnie wyjmij formę do kodów kreskowych. Następnie ostrożnie oderwij płytę od wafla. Następnie przytnij krawędzie płyty, aby uzyskać pożądany kształt formy.Zakończ formę za pomocą stempla do biopsji z tłokiem, aby wybić półmilimetrowe otwory w okrągłych elementach wzoru, które reprezentują wloty i wyloty. Po zdmuchnięciu kurzu ze szkiełka szklanego pokrytego poli-L-lizyną za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem, przymocuj formę PDMS do szkiełka. Ostrożnie wyrównaj krawędzie formy ze szkiełkiem.Teraz piecz zestaw przez 90 minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza, aby wzmocnić połączenie między PDMS a szkiełkiem. W międzyczasie przygotuj 20 sztuk elastycznych rurek polietylenowych do wlotów i wylotów. Na każdym kawałku rurki przymocuj wydrążony kołek ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra.Następnie za pomocą szpilek wypełnij odcinki centymetrem lub więcej poli-L-lizyny. Po przyklejeniu do szkła ostrożnie przymocuj kołki do wlotów formy. Jest to najtrudniejszy etap przygotowań.Nie spiesz się z procesem. Podłącz drugi koniec rurek do zestawu zbiornika azotu o regulowanym ciśnieniu, który składa się z sieci 20 zaworów trójdrogowych i może obsługiwać dwie formy jednocześnie. Korzystając z konfiguracji, przedmuchuj roztwór przez formę przy 0,5 do jednego PSI przez co najmniej sześć godzin.Zacznij od zasysania świeżo przygotowanych jednoniciowych roztworów DNA w BS-3 przez kołki ze stali nierdzewnej i do rurki polietylenowej. Następnie połącz formę PDMS ze źródłem azotu i przepływaj roztwór przez formę kodów kreskowych przez około 40 minut lub do momentu, gdy wszystkie kanały zostaną wypełnione. Następnie zatrzymaj przepływ i pozwól pleśni inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po kilku godzinach piecz formę do kodów kreskowych w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez godzinę. Po upieczeniu odłącz formę od szkiełka i delikatnie umyj szkiełko za pomocą 01%SDS. Następnie umyj szkiełko trzykrotnie ultraczystą wodą.Postępuj zgodnie z praniem, susząc szkiełko z kodem kreskowym za pomocą wirówki do szkiełka. Po wyschnięciu przechowuj szkiełko z kodem kreskowym w czystej tubie o pojemności 50 mililitrów. Aby kontynuować, postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby zweryfikować jednowymiarowy wzorzec.Aby przeprowadzić procedurę walidacji, zablokuj szkiełko, zhybrydyzuj z nim cyjaninę trzy komplementarne DNA i zmierz wyniki. Wzorzec SU-8 dla układu trzy na trzy ma wzór przepływu prostopadły do pierwszego projektu. Użyj wcześniej opisanej metody, aby wykonać nową formę PDMS tego wzoru.Na początek wykonaj świeże stężenia robocze dziewięciu oligonukleotydów. Teraz wlej trzyprocentowy roztwór blokujący BSA do wszystkich 20 kanałów szkiełka matrycowego przez godzinę przy ciśnieniu od 0,5 do jednego PSI. Następnie załaduj roztwory DNA do odpowiednich kanałów.Po przelaniu ich przez około 40 minut, inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić hybrydyzację DNA. Następnie przez godzinę wlewaj trzyprocentowy roztwór blokujący BSA do wszystkich 20 kanałów. Spowoduje to usunięcie niezhybrydyzowanego DNA.Teraz oderwij szkiełko macierzy od PDMS i zanurz suwak w trzech procentach BSA raz. Następnie zanurz slajd w PBS dwukrotnie, a następnie raz zanurz w dwóch procentach PBS. Następnie, tak jak poprzednio, osusz szkiełko za pomocą wirnika do szkiełek mikroskopowych.Aby kontynuować, wykonaj krok walidacji podobny do sprawdzania poprawności slajdów jednowymiarowych. Użyj oligonukleotydów od jednego do dziewięciu pierwszych, wszystkie sprzężone z cyjaniną trzecią. Zachowaj szkiełko trzy na trzy w 50-mililitrowej probówce wirówkowej do późniejszego użycia.Protokół tekstowy wyjaśnia ponadto, w jaki sposób przekształcić macierz DNA w macierz przeciwciał. Po przygotowaniu i oczyszczeniu koniugatów przeciwciało-oligo, należy przygotować kolejną formę PDMS z mikrokomorami. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście.Połącz tę formę ze szkiełkiem tablicy. Teraz zablokuj szkiełko jednym procentem BSA i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji należy przygotować 200 mikrolitrów koniugatów przeciwciało-oligonukleotyd.Po bloku dodaj koktajl przeciwciało-oligo do zestawu. Pozwól przeciwciałom inkubować na matrycy przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie wyczyść i wysusz szkiełko przed przystąpieniem do zanurzania szkiełka opisanego w protokole tekstowym. Po wykonaniu opisanego protokołu, przy użyciu macierzy trzy na trzy, otrzymany panel przeciwciał wykorzystano w detekcji multiplex, głównie za pomocą platformy ELISA typu sandwich.Białka wykazywały mniej niż 10% odchylenie od jednego końca do drugiego końca szkiełka. Na matrycy trzy na trzy można wykryć do siedmiu białek wraz z odniesieniem znakowanym cyjaniną trzy i kontrolą ujemną. W eksperymencie jednokomórkowym przeprowadzonym na potrzeby badania nad nowotworem, wszystkie sześć białek wykryto jednocześnie.W celu kalibracji rekombinowane białka zastosowano do macierzy o różnych stężeniach. Czułość wykrywania była dość podobna do konwencjonalnego testu ELISA typu kanapkowego. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby formy PDMS były wolne od cząstek stałych.Kurz w kanałach może powodować powstawanie macierzy o niskiej jednorodności i niskiej czułości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do badania sygnalizacji komórka-komórka przy użyciu modeli mikrośrodowisk guza.

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Ten film demonstruje metodę wykrywania szczepów cyjanobakterii w próbce środowiskowej za pomocą mikromatrycy przeciwciał. Próbki zawierające różne bakterie wchodzą w interakcje z wydrukowanymi przeciwciałami, a barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-cyjanobakterii znakowanymi fluoroforem ujawnia obecność specyficznych szczepów cyjanobakterii poprzez fluorescencję w różnych miejscach.

Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Poznaj metodę wytwarzania mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi pod kontrolą przepływu do analizy pojedynczych komórek. Technika umożliwia jednoczesne wykrywanie białek sekretowanych i wewnątrzkomórkowych.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Przeglądaj więcej filmów