Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest lepsze modelowanie opornej na ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL) in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w leczeniu opornych na leczenie ALL dotyczące tego, w jaki sposób mikrośrodowisko szpiku kostnego wpływa na oporność komórek ALL na chemioterapię. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona znacznie tańsza i mniej czasochłonna niż wykorzystanie tradycyjnych modeli zwierzęcych do badania skuteczności stosowania leku na opornych na leczenie komórkach ALL.

Zacznij od wysiewu od pięciu do 20 razy od 10 do szóstych komórek białaczkowych w 10 mililitrach pożywki hodowlanej specyficznej dla nowotworu na 100-milimetrowej płytce zawierającej 80 do 90% zlewających się komórek zrębu szpiku kostnego lub osteoblastów. Co czwarty dzień przechylać płytkę na bok i odsysać cały mililitr pożywki z wyjątkiem jednego, uważając, aby nie naruszyć przylegającej warstwy komórek. Następnie ostrożnie dodaj kroplami dziewięć mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórek białaczkowych w róg płytki wzdłuż boku, aby zapewnić minimalne zakłócenie przylegających komórek.

Po 12 dniu kohodowli delikatnie odpipetuj pożywkę hodowlaną w górę iw dół po płytce około pięć do 10 razy, aby zebrać pływające komórki białaczkowe. I przenieś komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie ponownie zasiaj komórki na nowej płytce składającej się w 80 do 90% zlewających się komórek zrębu szpiku kostnego lub osteoblastów, jak właśnie pokazano.

Do czwartego dnia uformują się trzy subpopulacje komórek białaczkowych, z zawieszonymi komórkami białaczkowymi swobodnie unoszącymi się w pożywce. Komórki białaczkowe Phase Bright przylegają do powierzchni przylegającej monowarstwy komórek, a komórki białaczkowe Phase Dim migrowały pod monowarstwą. Aby przygotować kolumny perełkowe G10, najpierw podgrzej 30 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych na kolumnę do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Następnie za pomocą pęsety wciągnij watę szklaną w cienkie, luźne pasma. I dodaj wiele warstw lekko upakowanych pasm do jednej 10-mililitrowej strzykawki na potrzebną kolumnę. Gdy strzykawka jest napełniona w 2/3, przymocuj jednokierunkowy kran w pozycji zamkniętej do końcówki i zaciśnij strzykawkę na stojaku pierścieniowym na tyle wysoko, aby pod kranem można było umieścić stożkową rurkę zbiorczą o pojemności 50 mililitrów.

Teraz umieść probówkę zbiorczą pod kolumną strzykawki. I użyj 10-mililitrowej pipety, aby dodać krople cząstek G10, zawieszonych w PBS, na wierzchu waty szklanej. Kontynuuj dodawanie cząstek G10, aż utworzy się dwumililitrowa osadka.

Następnie dodaj do kolumny dwie mililitrowe porcje wstępnie podgrzanego podłoża. I powoli otwórz zawór odcinający, aby medium wypływało z kolumny kroplowo. Gdy 10 mililitrów pożywki całkowicie spłynie przez kolumnę, zamknij kurek.

Wyrzuć przepływ i umieść nową probówkę zbiorczą pod kolumną. Aby zebrać zawieszoną subpopulację guza, należy odessać pożywkę z płytki do wspólnej hodowli komórek białaczkowych i użyć tej samej pożywki do delikatnego przepłukania płytki jeden raz. Następnie przenieś subpopulację komórek białaczkowych z pływającą zawiesiną do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Aby zebrać subpopulację guza Phase Bright, dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki z powrotem na płytkę do kohodowli. I spłucz około pięć razy wystarczająco energicznie, aby usunąć przylegające komórki białaczkowe bez usuwania przylegającej monowarstwy komórek. Następnie przenieś subpopulację Phase Bright do własnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Aby zebrać subpopulację guza Phase Dim, usuń pozostałą pożywkę za pomocą jednomililitrowego płukania PBS. I odłącz komórki trzema mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach delikatnie postukaj w boki płytki, aby usunąć przylegające komórki, a następnie dodaj jeden mililitr FBS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.

Następnie spłucz serum trzy do pięciu razy, aby rozbić wszelkie duże agregaty komórkowe. I przenieś nieoczyszczoną subpopulację Phase Dim do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Kiedy wszystkie subpopulacje zostaną zebrane, odwiruj komórki.

I ponownie zawiesić każdą z granulek w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego podłoża. Przy całkowicie zamkniętym kurku, dla każdej subpopulacji, użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby dodać całą jednomililitrową objętość komórek, kroplami, na wierzch jednej z przygotowanych kolumn G10, upewniając się, że komórki pozostają na wierzchu lub wewnątrz granulki G10. Pozostawić komórki do inkubacji na osadzie G10 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj od jednego do trzech mililitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do kolumny. I otwórz kran tak, aby medium powoli opuszczało kolumny, kroplami. Kontynuuj dodawanie wstępnie podgrzanego podłoża do kolumn, w krokach co jeden do dwóch mililitrów.

Po zebraniu łącznie od 15 do 20 mililitrów komórek białaczkowych zamknij kran i zakręć probówkę zbiorczą. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w odpowiednim buforze do analizy. Po trypsynizacji przylegającej warstwy komórkowej obserwuje się dwie odrębne populacje komórek za pomocą analizy rozproszenia do przodu i z boku.

Po oddzieleniu G10 odzyskuje się czystą populację komórek ALL. Szczególnie interesujące jest to, że wszystkie komórki fazy ciemnej odzyskane z komórek zrębu szpiku kostnego lub kokultur osteoblastów wykazują niewielką lub żadną śmierć po ekspozycji na chemioterapię cytotoksyczną. Próbując wykonać te procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby wykonać te kroki tak prawidłowo, jak to możliwe, aby zmniejszyć wszelkie zmiany fenotypowe, które mogą wystąpić w komórkach białaczkowych.

Technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się badaniami nad białaczką modelowanie białaczki opornej na chemioterapię w modelu in vitro, który bardziej przypomina mikrośrodowisko szpiku kostnego.