Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Ogólnym celem tej mikroskopii wideo w trybie time-lapse jest śledzenie selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów zapśredniczonego przez Parkinę podczas procesu mitofagii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu molekularnego, takie jak wpływ mitofagii na utrwalone stany patologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona bardzo potężne narzędzie do śledzenia dynamiki znakowanych białek podczas ich procesów molekularnych.

Metoda ta może dostarczyć wglądu w cykl życiowy mitochondriów. Można ją również zastosować w innych układach, takich jak pierwotne hodowle komórkowe, badania embriologiczne oraz przewidywanie priorytetów. Unieśmiertelnione zarodkowe fibroblasty mysie użyte w niniejszym badaniu są hodowane w pełnej pożywce DMEM na dziesięciocentymetrowej płytce do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.

Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę za pomocą sterylnego ssaka i dodać 10 mL sterylnego PBS. Usunąć PBS i dodać 1 mL 0,25% Trypsyny EDTA. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech minut, aż komórki zostaną odklejone.

Dodaj cztery mililitry pełnej pożywki DMEM i ponownie zawieś komórki. Pobierz dziesięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej do policzenia za pomocą hemocytometru. Wysiej 1×10⁶ komórek na 10-centymetrową szalkę hodowlaną i inkubuj przez 24 godziny.

Następnego dnia wypłukać komórki raz przy użyciu PBS i odłączyć je poprzez trypsynizację, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Dodać 4 mL pełnej pożywki DMEM, resuspenderować komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mL. Wirować komórki z prędkością 250 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.

Odrzuć nadsącz i resuspenduj osad w 1 mL sterylnego PBS. Ponownie odwiruj komórki. Po drugim wirowaniu odrzuć nadsącz.

Do osadu komórkowego należy dodać 100 µL mieszaniny roztworów do elektroporacji, a następnie delikatnie resuspender osad za pomocą pipetowania. Do zawiesiny komórkowej dodaje się 2 µg plazmidu ekspresyjnego EYFP Parkin oraz 1 µg plazmidu ekspresyjnego DsRed2 Mito. Roztwór należy przenieść do sterylnej kuwety, używając jednorazowej pipety Pasteura.

Przeprowadź elektroporację komórek, korzystając z zaprogramowanego programu. Bezzwłocznie po elektroporacji dodaj do komórek 500 µL świeżej, uprzednio ogrzanej pełnej pożywki DMEM, a następnie wysiej komórki na płytkę hodowlaną o średnicy sześciu centymetrów przeznaczoną do obrazowania na żywo.

Inkubować komórki w atmosferze z dodatkiem 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 °C przez 24 h. Przed rozpoczęciem tej procedury ustawić temperaturę komory mikroskopu na 37 °C. Następnie przygotować specjalne medium do obrazowania żywych komórek, mieszając następujące składniki: DMEM bez fenolu uzupełniony o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 j/ml penicyliny oraz 100 mg/ml streptomycyny.

Podgrzej wcześniej pożywkę do 37 °C w kąpieli wodnej. Usuń pożywkę z elektroporowanych komórek za pomocą sterylnego ssaka i dodaj 1 ml uprzednio podgrzanej pożywki do obrazowania żywych komórek. Inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Po potwierdzeniu, że komora mikroskopu osiągnęła stabilną temperaturę 37 °C, należy wprowadzić do niej 5% dwutlenku węgla. Następnie, ostrożnie i bez gwałtownych ruchów czy wstrząsów, należy umieścić płytkę z elektroporowanymi komórkami w komorze mikroskopu.

Za pomocą interfejsu oprogramowania ustaw mikroskop tak, aby wykrywał sygnały fluorescencyjne białek fuzyjnych kodowanych przez wektory ekspresyjne EYFP Parkin i DsRed2 Mito. Otwórz oprogramowanie do wideomikroskopii poklatkowej. W górnym menu wybierz FITC dla EYFP Parkin oraz Rhodamine dla DsRed2 Mito.

Wybierz powiększenie 20X. Korzystając z interfejsu oprogramowania, odszukaj pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję obu kotransfekowanych wektorów i zarejestruj jej położenie. Powtórz tę czynność dla co najmniej 10 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego.

Wybierz z menu Apps opcję Multi Dimensional Acquisition. W oknie Multi Dimensional Acquisition wybierz wymagane parametry, takie jak liczba akwizycji, odstęp czasu między poszczególnymi akwizycjami oraz położenie rejestrowanej komórki. Kliknij Acquire, aby rozpocząć bazową akwizycję obu sygnałów fluorescencyjnych.

Należy pobierać obrazy co pięć minut przez łączny okres piętnastu minut. Podczas akwizycji obrazów należy przygotować podgrzane medium do obrazowania żywych komórek zawierające karbonylocyjanid 4-trifluorometoksyfenylohydrazonę (FCCP) w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe stężenie robocze. Należy przerwać proces akwizycji i delikatnie dodać 1 mL podgrzanego medium do obrazowania żywych komórek z FCCP do płytki znajdującej się w komorze mikroskopu.

Po dodaniu FCCP ważne jest ponowne ustawienie ostrości mikroskopu przed wznowieniem akwizycji obrazów. Wznów proces akwizycji zgodnie z wcześniejszym opisem i zbieraj obrazy przez łącznie trzy godziny, korzystając z zapisanej pozycji. Po zakończeniu akwizycji zapisz wszystkie pozyskane obrazy do późniejszej analizy.

Przedstawiono tutaj obrazy z lapse-time sygnałów fluorescencyjnych EYFP-Parkin i DsRED2-Mito w fibroblastach przed podaniem FCCP. Białe ramki reprezentują powiększone obszary odpowiadających im paneli po prawej stronie. W punktach czasowych podstawowych EYFP-Parkin, zwizualizowany na zielono, jest homogenicznie rozproszony w całej komórce.

Sieć mitochondriów, zwizualizowana na czerwono, wydaje się być dobrze połączona, co wskazują białe strzałki. Po podaniu FCCP w piątej minucie obserwuje się fragmentację mitochondriów wynikającą z depolaryzacji błony. Jednak EYFP-Parkin wciąż jest homogenicznie rozproszony w całej cytoplazmie.

W 55. minucie po podaniu FCCP białko EYFP-Parkin jest rekrutowane do uszkodzonych błon mitochondrialnych, aby zainicjować proces mitofagii. Przemieszczanie się EYFP-Parkin do błony mitochondrialnej po podaniu FCCP pokazano na tym reprezentatywnym filmie poklatkowym. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć dwie godziny.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autofagii do przeprowadzania eksperymentów nad recyklingiem mitochondriów. Umożliwiło to badanie procesu mitofagii jako mechanizmu kontroli jakości mitochondriów w komórkach.