Name: Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj mikroskopię poklatkową do śledzenia dynamiki EYFP-Parkiny podczas mitofagii w mysich fibroblastach zarodkowych. Ta metoda umożliwia badanie usuwania uszkodzonych mitochondriów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 do R.G.P.), Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), grant od Breast Cancer Research Foundation, hojne granty od Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) oraz grant od Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). Częściowo praca ta była wspierana przez stypendium podoktoranckie Amerykańsko-Włoską Fundację Raka (G.D.) oraz Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Departament w szczególności zrzeka się odpowiedzialności za analizę, interpretacje lub wnioski. Z tym manuskryptem nie ma żadnych konfliktów interesów.

1. Elektroporacja fibroblastów z oboma wektorami ekspresji EYFP-Parkin i pDsRed2-Mito
<ol>
	<li>Hoduj unieśmiertelnione komórki fibroblastów embrionalnych myszy na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej przy użyciu pożywki DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle's Dulbecco) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mmol/l L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Przy 80% zbiegu komórek wyrzuć całe podłoże DMEM przez sterylne odsysanie i dodaj 10 ml sterylnego 1x buforu fosforanowego (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 i 1 l destylowany H2O, PH: 7,4).</li>
		<li>Wyrzuć PBS przez sterylne odsysanie i dodaj 1 ml Trypsyny-EDTA 0,25%. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek (2-3 min). Dodać 4 ml kompletnej pożywki DMEM, ponownie zawiesić komórki i wyjąć 10 μl zawiesiny komórek do zliczania hemocytometru. 
		UWAGA: Hemocytometr jest zaprojektowany tak, aby liczba komórek w jednym zestawie 16 kwadratów narożnych była równa liczbie komórek x 104/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewaj 1 x 106 komórek na 10 cm szalkach do hodowli tkankowych na 24 godziny przed procesem elektroporacji.</li>
	<li>Wyrzucić całe podłoże DMEM przez sterylne odsysanie i dodać 10 ml sterylnego PBS. Wyrzuć PBS przez sterylne odsysanie i dodaj 1 ml Trypsyny-EDTA 0,25%. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek (2-3 min). Dodać 4 ml kompletnej pożywki DMEM i ponownie zawiesić komórki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 250 x g przez 5 minut za pomocą wirówki z chłodzeniem (4 °C). Odsysać supernatant przez sterylne odsysanie i ponownie zawiesić osad w 1 ml jałowego PBS. Wirować komórki w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez sterylne odsysanie i dodać 100 μl mieszaniny roztworów do elektroporacji (82 μl roztworu do elektroporacji V + 18 μl roztworu uzupełniającego 1) do osadu komórkowego i delikatnie zawiesić osad przez pipetowanie (więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika). Dodać 2 μg EYFP-Parkiny (wzbudzenie/emisja 514/527) i 1 μg pDsRed2-Mito (wzbudzenie/emisja 565/620) w zawiesinie komórki.</li>
	<li>Przenieś roztwór do sterylnej kuwety za pomocą jednorazowego pasteura (oba narzędzia są dostarczane z zestawem) i elektroporatuj za pomocą wstępnie ustawionego programu NIH/3T3 U-030 (pojedynczy impuls, napięcie 200 V, pojemność 960 μF, czas impulsu 20 milisekund, liczba impulsu: 1).</li>
	<li>Bezpośrednio po elektroporacji dodać 500 μl świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM i wysiać komórkę na 6 cm płytce do hodowli tkankowej o jakości obrazowania na żywo i inkubować je w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Mikroskopia filmów poklatkowych
<ol>
	<li>Przed użyciem ustaw temperaturę w komorze mikroskopu na 37 °C.</li>
	<li>W tym momencie należy przygotować określone podłoże do obrazowania na żywo, aby kontynuować postępowanie z protokołem eksperymentalnym. Przygotować nośnik do obrazowania na żywo w następujący sposób; Mieszanka DMEM bez fenolu uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mmol/l L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Podgrzej wstępnie żywy do obrazowania w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę z elektroporowanych komórek przez sterylne odsysanie i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do obrazowania na żywo, używając pipety P1000 i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W okresie inkubacji płytki napływ 5% CO2 do komory mikroskopu już w stabilnej temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść płytkę z elektroporowanymi ogniwami w komorze mikroskopu, unikając większych ruchów lub oscylacji.</li>
	<li>Korzystając z interfejsu oprogramowania, ustaw mikroskop w taki sposób, aby wykrywał zarówno sygnały fluorescencyjne z białek fuzyjnych kodowane przez wektory kotransfekowane, EYFP-Parkin (zakres wzbudzenia od 495 do 510 nm i zakres emisji od 520 do 550 nm, zielony), jak i pDsRed2-Mito (maksimum wzbudzenia 558 nm i maksimum emisji 583 nm, czerwony).
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do mikroskopii filmów poklatkowych. W górnym menu wybierz FITC dla EYFP-Parkin i Rhodamine dla pDsRed2-Mito. W górnym menu wybierz powiększenie (20X).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z interfejsu oprogramowania, poszukaj pojedynczej komórki wyrażającej oba wektory współtransfekowane i zarejestruj pozycję. Powtarzaj ten krok, aż zostanie pobranych co najmniej 10 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego (grupa eksperymentalna).
	<ol>
		<li>Wybierz menu "Aplikacje" i kliknij Multi Dimensional Acquisition. W oknach Akwizycja wielowymiarowa wybierz potrzebne parametry, takie jak liczba akwizycji, odstęp czasu między każdym akwizycją oraz pozycja zarejestrowanej komórki. Kliknij "Nabyj", aby rozpocząć proces przejęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij podstawową akwizycję sygnału fluorescencyjnego EYFP-Parkin i DsRed2-Mito, zbierając obrazy co 5 minut przez łączny interwał 15 minut.</li>
	<li>Przygotować wstępnie podgrzane podłoże do obrazowania na żywo o stężeniu FCCP dwukrotnie wyższym niż końcowe stężenie robocze (0,1 - 10 μM, w zależności od typu komórki).</li>
	<li>Przerwij proces akwizycji i delikatnie dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do obrazowania na żywo z FCCP do płytki wewnątrz komory mikroskopu za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Uruchom ponownie proces akwizycji zgodnie z wcześniejszym opisem, na łączny okres 3 godzin, korzystając z zarejestrowanej pozycji. Zapisz wszystkie uzyskane obrazy, aby je przeanalizować i stworzyć film przedstawiający proces mitofagiczny po zakończeniu akwizycji.</li>
</ol>
3. Analiza
<ol>
	<li>Zbierz wszystkie pozyskane obrazy w formacie ".tiff " na komputerze osobistym</li>
	<li>Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania graficznego i określ przedział czasowy, jaki nastąpił od indukowanej przez mitochondria depolaryzacji za pomocą FCCP do pierwszego obrazu pokazującego rekrutację Parkiny do błony mitochondrialnej (obrazy są pozyskiwane co 5 minut). Powtórz tę analizę dla każdej komórki w grupie eksperymentalnej.</li>
	<li>Oznacz pierwszą komórkę kolumny w arkuszu kalkulacyjnym nazwą grupy eksperymentalnej. Dla każdej grupy eksperymentalnej zmierz odstępy czasowe dla rekrutacji Parkiny do co najmniej 10 komórek. Uśrednić obliczone przedziały czasowe dla rekrutacji Parkiny i zdefiniować odchylenie standardowe dla każdej grupy eksperymentalnej (średnia ± S.D., N = 10).
	<ol>
		<li>Uporządkuj w kolumnach pojedyncze obliczone przedziały czasowe. Każda kolumna zawiera n = 10 pomiarów grupy eksperymentalnej.</li>
		<li>Wybierz funkcję "średnia" z menu Konstruktora formuł. Zaznacz dane w kolumnie. Wybierz funkcję "Odchylenie standardowe" z menu Konstruktora formuł. Zaznacz dane w kolumnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosując podejście statystyczne, porównaj grupy eksperymentalne, stosując odpowiednią statystykę w celu zdefiniowania istotnej różnicy w dynamice mitofagii między grupami eksperymentalnymi. (Na przykład dwie grupy = test t-Studenta, trzy lub więcej grup = ANOVA plus test post hoc)</li>
</ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
<li>Zhi, X., Zhong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Autophagy in cancer.</a> F1000Prime Rep. 7, 18(2015).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mitochondrial+autophagy%2C+or+mitophagy%2C+as+a+targeted+defense+against+oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging.</a> Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).</li>
<li>Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uth1p+is+involved+in+the+autophagic+degradation+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria.</a> J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
<li>Di Sante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+sirt1+promotes+prostatic+intraepithelial+neoplasia%2C+reduces+mitophagy%2C+and+delays+park2+translocation+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria.</a> Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).</li>
<li>Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin-mediated+selective+mitochondrial+autophagy%2C+mitophagy%3A+Parkin+purges+damaged+organelles+from+the+vital+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network.</a> FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).</li>
<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
<li>Trinh, J., Farrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417, 1-13 (2009).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wild+type+and+mutant+ELOVL4+in+cell+culture%3A+subcellular+localization+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability.</a> Mol Vis. 10, 248-253 (2004).</li>
<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
<li>Kerr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+macropinosome+maturation+by+the+recruitment+of+sorting+nexins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins.</a> J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).</li>
<li>Edin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+gel+culture+and+time-lapse+video+microscopy+of+the+human+vestibular+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve.</a> Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).</li>
<li>Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPI-2+type+III+secretion+system+restricts+motility+of+Salmonella-containing+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles.</a> Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).</li>
<li>Meseguer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+incubation+and+selection+in+a+time-lapse+monitoring+system+improves+pregnancy+outcome+compared+with+a+standard+incubator%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study.</a> Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).</li>
<li>Campbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+risk+classification+of+aneuploidy+in+human+embryos+using+non-invasive+morphokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics.</a> Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510, 370-375 (2014).</li>
<li>Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+sensitizes+toward+apoptosis+induced+by+mitochondrial+depolarization+through+promoting+degradation+of+Mcl-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1.</a> Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).</li>
<li>Batlevi, Y., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+autophagy+in+neural+function%2C+neurodegenerative+disease%2C+neuron+cell+death%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging.</a> Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).</li>
<li>Frank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+is+triggered+by+mild+oxidative+stress+in+a+mitochondrial+fission+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation.</a> Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+of+mitochondrial+autophagy%3A+Types+1+and+2+mitophagy+and+micromitophagy+%28Type+3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3).</a> Redox Biol. 2, 749-754 (2014).</li>
<li>Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+mitochondrial+electron+transport+and+energy+coupling+by+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light.</a> Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).</li>
<li>Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblast+alterations+induced+by+low+power+laser+irradiation+at+the+single+cell+level+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).</li>
<li>Kim, I., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+selectively+degrades+individual+damaged+mitochondria+after+photoirradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation.</a> Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroskopię poklatkową można zdefiniować jako technikę, która rozszerza obrazowanie żywych komórek od pojedynczej obserwacji w czasie do obserwacji dynamiki komórkowej w długich okresach czasu. Metodologia ta różni się od prostej mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii żywych komórek, ponieważ pozwala obserwatorowi zidentyfikować w czasie rzeczywistym pojedyncze białko znakowane fluorescencyjnie i śledzić jego dynamikę wewnątrz pojedynczej żywej komórki. W rzeczywistości mikroskopia konfokalna może łatwo zidentyfikować b...

Makroautofagia to proces wewnątrzkomórkowy, który obejmuje kataboliczną degradację zarówno uszkodzonych, jak i dysfunkcyjnych składników komórkowych, takich jak organelle i białka, w celu recyklingu lub produkcji energii. Aby zainicjować ten proces metaboliczny, komórka pochłania uszkodzone składniki komórkowe w strukturę podwójnej błony, znaną jako autofagosom, która łączy się z lizosomem, a jej zawartość jest degradowana i poddawana recyklingowi 1,2. Istnieją dwa główne typy autofagii, nieselektywny i selektywny. Nieselektywny proces autofagii zachodzi, gdy komórka znajduje się w warunkach niedoboru składników odżywczych i musi zbierać zarówno niezbędne składniki odżywcze, jak i energię. Jednak selektywna autofagia zachodzi, aby pośredniczyć w usuwaniu zarówno dysfunkcyjnych/uszkodzonych organelli, jak i białek, które w przeciwnym razie mogłyby być toksyczne. Jednym z najlepiej zbadanych selektywnych procesów autofagii jest usuwanie mitochondriów, określane mianem mitofagii 1,3-5.
Mitochondria są centralnymi organellami metabolizmu komórkowego i głównym źródłem trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną poprzez łańcuch transportu elektronów, utlenianie kwasów tłuszczowych i cykl kwasu trikarboksylowego (TCA). Ponadto mitochondria regulują produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i uwalniają białka, które uczestniczą w szlakach śmierci komórki 6-8.
Przypuszczalna kinaza 1 (PINK1) indukowana przez PTEN i ligaza ubikwityny Parkin RBR E3 (Parkin) są kluczowymi białkami zaangażowanymi w proces mitofagii. Parkina może chronić przed śmiercią komórki, utrzymując komórkę w zdrowiu poprzez mitochondrialną kontrolę jakości9. Po utracie potencjału błony mitochondrialnej, cytozolowa parkina jest rekrutowana do mitochondriów przez PINK1. Ta rekrutacja wyzwala sekwencyjne zdarzenia mitofagii 10. Istnieje szeroki zakres dowodów na to, że mitofagia jest podstawowym procesem kontroli jakości mitochondriów, a nieprawidłowości w tym procesie napędzają chorobę 7. Na przykład autosomalna recesywna choroba Parkinsona jest związana z mutacjami w genach kodujących Parkinę i PINK1 (odpowiednio PARK2 i PINK1) 11. Kontrola jakości zdrowia mitochondriów jest niezbędna do usunięcia mitochondriów, które przyczyniają się do akumulacji ROS12. Nadmierna obecność wewnątrzkomórkowych ROS może prowadzić do uszkodzenia zarówno jądrowego, jak i mitochondrialnego DNA (odpowiednio DNA i mt DNA).
Tutaj pokazujemy metodę poklatkowej mikroskopii wideo, aby śledzić agregację Parkiny po indukcji mitofagii za pośrednictwem Parkiny w unieśmiertelnionych fibroblastach embrionalnych myszy poprzez podanie in vitro 4-(trifluorometoksy)-fenylohydrazonu karbonylowego, środka rozprzęgającego. FCCP zakłóca syntezę ATP poprzez zwarcie protonów przez zewnętrzną błonę mitochondriów, a tym samym rozprzęganie fosforylacji oksydacyjnej od łańcucha transportu elektronów 13. Wywołanie depolaryzacji błony mitochondrialnej prowadzi do zakłócenia mitochondriów i selektywnego usuwania zależnego od Parkiny. W związku z tym, transfekcja komórek będących przedmiotem zainteresowania wektorem ekspresyjnym kodującym Parkinę połączoną z markerem fluorescencyjnym (wzmocnione żółte białko fluorescencyjne, EYFP) może być wykorzystana jako znacznik fluorescencyjny do śledzenia rekrutacji Parkiny podczas procesu mitofagicznego. Aby uwidocznić mitochondria, przeprowadziliśmy kotransfekcję pDsRed2-Mito, który koduje czerwone białko fluorescencyjne (DsRed2), które zawiera mitochondrialną sekwencję docelową podjednostki VIII oksydazy cytochromu c (Mito). pDsRed2-Mito jest przeznaczony do znakowania fluorescencyjnego mitochondriów14. Czas potrzebny do translokacji Parkiny do błony mitochondrialnej może być mierzony i daje pośrednią miarę zdrowia komórek. Na przykład możemy powiedzieć, że jeśli linia komórkowa znokautowana dla określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania wykazuje szybszą lub wolniejszą rekrutację parkiny po indukcji mitofagii przez FCCP, ten produkt genowy byłby kluczowym graczem w celu utrzymania tempa metabolizmu komórki w stanie fizjologicznym i zapobiegania rozwojowi chorób. W związku z tym poklatkowa mikroskopia wideo stanowi bardzo potężne narzędzie zarówno do zastosowań podstawowych, jak i klinicznych, w śledzeniu dynamiki znakowanych białek podczas ich procesów molekularnych i zrozumieniu, w jaki sposób procesy te wpływają na stan patologiczny.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>Wstępne rozgrzanie w 37 i #176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Bez fenolu DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>Wstępnie rozgrzany w 37 &#176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Wstępnie rozgrzana w 37 & # 176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Pre-warm w 37 &#176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>Wstępne rozgrzanie w 37 &#176; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Wektor ekspresyjny EYFP-PARKIN</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito wektor ekspresyjny</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B</td><td>urządzenie LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Nukleofektor do zestawu R NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony ZEISS AXIOVERT 200M</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)-fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Eksperymentalny konstruktor</td><td></td>urządzeń <td>molekularnych</td><td>MetaMorph</td></tr><tr><td>ImageJ</td> Narodowy <td>Instytut Zdrowia</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr></tbody></table>

wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji eyfp-parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Mikroskopia filmów poklatkowych może być zdefiniowana jako obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym. Ta technika opiera się na zbieraniu obrazów w różnych punktach czasowych. Przedziały czasowe można ustawić za pomocą interfejsu komputerowego, który steruje kamerą zintegrowaną z mikroskopem. Ten rodzaj mikroskopii wymaga zarówno zdolności do pozyskiwania bardzo szybkich zdarzeń, jak i sygnału generowanego przez obserwowaną strukturę komórkową podczas tych zdarzeń. Po zebraniu obrazów, montowany jest film z całego eksperymentu, aby pokazać dynamikę zdarzeń molekularnych będących przedmiotem zainteresowania. Wideomikroskopia poklatkowa ma szeroki zakres zastosowań w dziedzinie badań biomedycznych i jest potężnym i unikalnym narzędziem do śledzenia dynamiki zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym. Dzięki tej technice możemy ocenić zdarzenia komórkowe, takie jak migracja, podział, transdukcja sygnału, wzrost i śmierć. Co więcej, za pomocą fluorescencyjnych sond molekularnych jesteśmy w stanie oznaczyć konkretne cząsteczki, takie jak DNA, RNA czy białka i śledzić ich szlaki molekularne i funkcje. Mikroskopia wideo poklatkowego ma wiele zalet, z których główną jest możliwość zbierania danych na poziomie pojedynczej komórki, co czyni ją unikalną technologią do badań w dziedzinie biologii komórki. Jednak mikroskopia filmów poklatkowych ma ograniczenia, które mogą zakłócać pozyskiwanie obrazów o wysokiej jakości. Obrazy mogą być zagrożone przez oba czynniki zewnętrzne; wahania temperatury, wibracje, wilgotność i czynniki wewnętrzne; pH, ruchliwość komórek. W tym miejscu opisujemy protokół dynamicznego pozyskiwania określonego białka, Parkiny, połączonego ze wzmocnionym białkiem żółtej fluorescencji (EYFP) w celu śledzenia selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów przy użyciu metody poklatkowej mikroskopii wideo.

W niniejszej pracy pokazujemy, że mikroskopia wideo time-lapse jest potężną techniką, którą można wykorzystać do śledzenia zdarzeń molekularnych białek znakowanych fluorescencyjnie w pojedynczej komórce. Reprezentatywne wyniki pokazują również, w jaki sposób technika ta umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej jakości. Po otrzymaniu obrazów procesu molekularnego mamy możliwość analizowania ich na różne sposoby. Tutaj analizujemy odstęp czasu między rozpoczęciem indukowanego procesu mitofagii,...

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Ogólnym celem tej mikroskopii wideo w trybie time-lapse jest śledzenie selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów zapśredniczonego przez Parkinę podczas procesu mitofagii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu molekularnego, takie jak wpływ mitofagii na utrwalone stany patologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona bardzo potężne narzędzie do śledzenia dynamiki znakowanych białek podczas ich procesów molekularnych.Metoda ta może dostarczyć wglądu w cykl życiowy mitochondriów. Można ją również zastosować w innych układach, takich jak pierwotne hodowle komórkowe, badania embriologiczne oraz przewidywanie priorytetów. Unieśmiertelnione zarodkowe fibroblasty mysie użyte w niniejszym badaniu są hodowane w pełnej pożywce DMEM na dziesięciocentymetrowej płytce do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę za pomocą sterylnego ssaka i dodać 10 mL sterylnego PBS. Usunąć PBS i dodać 1 mL 0,25% Trypsyny EDTA. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech minut, aż komórki zostaną odklejone.Dodaj cztery milil

time-lapse-video-microscopy-for-assessment-eyfp-parkin-aggregation-as

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Na podstawie eksperymentów in vitro, badanie to ujawniło mechanizm działania krocetyny w naprawie uszkodzeń kardiomiocytów spowodowanych stresem oksydacyjnym poprzez wpływ na mitofagię, w której ważną rolę odgrywa szlak sygnałowy PINK1/Parkin.

Ochrona komórek mięśnia sercowego H9c2 przed stresem oksydacyjnym przez krocetynę za pośrednictwem mitofagii, w której pośredniczy szlak PINK1 / Parkin

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Poznaj mikroskopię poklatkową do śledzenia dynamiki EYFP-Parkiny podczas mitofagii w mysich fibroblastach zarodkowych. Ta metoda umożliwia badanie usuwania uszkodzonych mitochondriów w czasie rzeczywistym.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Przeglądaj więcej filmów