Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy w celu ich ilościowego określenia i charakterystyki fenotypowej za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Analiza stanu zapalnego po niedokrwieniu mózgu za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej zapewnia głębokie zrozumienie procesów immunologicznych związanych z progresją, naprawą i ogólnym wynikiem udaru. Główną zaletą tej procedury jest szybkie, jednoetapowe wirowanie w gradionym spadku gęstości, które pozwala na wyizolowanie dużej liczby żywotnych komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy.

Zastosowanie tej techniki ma na celu identyfikację i walidację nowych strategii leczenia immunomodulacyjnego, które można zastosować w szerszym oknie czasowym udaru. Zacznij od zanurzenia jednego końca rurki perfuzyjnej perfuzyjnej w lodowatym HBSS bez wapnia i magnezu. Przymocuj igłę o rozmiarze 23 do drugiego końca rurki.

I włącz pompę, aby całkowicie napełnić rurkę HBSS. Następnie umieść uśpioną mysz grzbietowo na desce preparacyjnej osadzonej w plastikowej tacce i przygnij przednią i tylną łapę, rozciągniętą tak szeroko, jak to możliwe, igłami o rozmiarze 20. Używając pary prostych kleszczy jeden na dwa zęby, aby chwycić skórę brzucha, wykonaj boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha ostrymi nożyczkami tęczówki, aby odsłonić wątrobę.

Następnie podnieś mostek i użyj ostrza nożyczek do ostrej tęczówki, aby naciąć przeponę. Kontynuuj przecinanie bocznej klatki piersiowej po obu stronach w kierunku ogoniastym, uważając, aby nie uszkodzić płuc, serca i tętnic piersiowych, i użyj kleszczy, aby dopasować płat skóry. Przypnij klapkę do deski preparacyjnej i ostrożnie oddziel serce od tkanki łącznej.

Trzymając serce kleszczami końcem, włóż końcówkę igły o rozmiarze 23 na końcu rurki perfuzyjnej do wierzchołka lewej komory, uważając, aby nie uszkodzić przegrody śródkomorowej. Używając ostrych nożyczek do irysa, naciąć prawy przedsionek i natychmiast uruchomić pompę, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków w pompowaniu. Kiedy wątroba stanie się jasna kawowego koloru, użyj prostych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć głowę myszy tuż za czaszką.

Następnie użyj nożyczek Iris, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Gdy czaszka jest widoczna, umieść jedną końcówkę ostrych nożyczek tęczówki w otworze wielkim i wykonaj boczne nacięcie w kości. Powtórz nacięcie po drugiej stronie.

Następnie użyj ostrych nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie wyciąć od tej samej wnęki w górę linii środkowej, w kierunku nosa. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie oderwij kości czaszki od każdej półkuli mózgu. Następnie podnieś mózg szpatułką i użyj ostrych nożyczek tęczówki, aby ostrożnie wypreparować włókna nerwowe czaszki, które mocują go do czaszki.

Umieszczenie mózgu w 15-mililitrowej probówce, zawierającej 10 mililitrów HBSS z wapniem i magnezem na lodzie. Aby zdysocjować tkankę mózgową na zawiesinę pojedynczej komórki, najpierw użyj czystej żyletki, aby ostrożnie usunąć pień mózgu i mózg. Następnie użyj kolejnej czystej żyletki, aby przeciąć mózg, przecinając każdą półkulę wzdłuż płaszczyzny koronalnej na trzy części o mniej więcej równej wielkości.

Używając końcówki tłoka pięciomililitrowej strzykawki, rozgnieć kawałki tkanki mózgowej przez 100-mikronowe sitko do komórek, ciągle płucząc sitko lodowatym HBSS z wapniem i magnezem. Następnie umieść homogenizowane tkanki na lodzie. Gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone, odwirować zawiesiny komórek i ostrożnie wyrzucić supernatanty.

Zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu wytrawiającego. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do dwumililitrowej probówki i inkubuj komórki pod powolną, ciągłą rotacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie przesiać zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikronów i dokładnie przepłukać filtr trzema mililitrami buforu płuczącego zawierającego DNazę.

Następnie umyj sitko 15 mililitrami buforu płuczącego bez DNaz, odwiruj komórki i wyrzuć supernatant. Aby usunąć resztki komórek i mielinę, ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach temperatury pokojowej, pożywce o gradiencie gęstości 25% i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Dokładnie wymieszać komórki w gradiacji, kilkakrotnie delikatnie pipetując.

Następnie odwiruj roztwór komórkowy. Pod koniec separacji ostrożnie odessać płaszcz mielinowy i supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach buforu płuczącego wolnego od DNaz. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i ponownie je odwiruj, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach buforu do mycia na zimno.

Następnie policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem barwienia immunologicznego inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut z anty-mysim odczynnikiem blokującym receptor Fc CD26/CD32, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie dodaj sprzężone z fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności.

Pod koniec inkubacji umyć komórki w dwóch mililitrach buforu cytometrii przepływowej. Obróć w dół. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach bufora cytometrii przepływowej i przechowywać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy cytometrii przepływowej.

Aby określić ilościowo bezwzględną liczbę naciekających komórek odpornościowych przez liczenie kulek, odwróć pipetę dokładnie 40 mikrolitrów cytometrii przepływowej i 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki liczącej zawierającej znaną liczbę kulek fluorescencyjnych. Następnie inkubować zawiesinę komórek i kulek z przeciwciałem CD45 znakowanym FITC w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w ciemności, a następnie odwrotnie napełnić probówkę liczącą 200 mikrolitrami buforu cytometrii przepływowej. Następnie natychmiast uruchom próbkę na cytometrze przepływowym, rejestrując kulkę i zdarzenia komórkowe CD45-dodatnie.

24 godziny po niedrożności tętnicy środkowej mózgu leukocyty naciekające mózg można zidentyfikować po ich wysokiej ekspresji CD45. W populacji o wysokiej zawartości CD45 neutrofile wielojądrzaste są identyfikowane na podstawie ich ekspresji LY-6G, podczas gdy limfocyty T wykazują fenotyp powierzchni komórek CD45 wysoki, CD3-dodatni. Pozostałe komórki o wysokiej wysokości CD45 można dodatkowo odróżnić na podstawie ekspresji CD19 i CD11b.

Podczas gdy frakcja CD11b-dodatnia może być podzielona na monocyty zapalne o wysokim poziomie Ly-6C i populację o niskiej zawartości Ly-6C, która obejmuje populacje monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych. W ostrej fazie udaru neutrofile Ly-6G-dodatnie dostają się do mózgu szybko po zamknięciu naczynia. Natomiast częstość występowania limfocytów T CD3-dodatnich w półkuli niedokrwiennej zmniejsza się w porównaniu z mózgami po operacji pozorowanej i półkulą przeciwległą

W populacji CD11b-dodatniej niedokrwienie mózgu przesuwa równowagę w kierunku silnej przewagi monocytów zapalnych o wysokim poziomie Ly-6C. Co więcej, całkowita liczba leukocytów w półkuli zawału jest znacznie zwiększona w porównaniu z półkulą przeciwległą i mózgami po operacji pozorowanej, 24 godziny po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki odpornościowe z niedokrwionego mózgu poprzez fragmentację mechaniczną, trawienie enzymatyczne i wirowanie w gradiacji gęstości oraz jak scharakteryzować te komórki za pomocą cytometrii przepływowej.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że całkowita wydajność komórek zależy od dokładnej dysocjacji tkanki mózgowej. Ponadto konieczna jest wystarczająca perfuzja przezsercowa, aby zapobiec zanieczyszczeniu leukocytów naciekających mózg niezapalnymi krążącymi komórkami odpornościowymi.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy ekspresji genów lub analiza profilu cytokin, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat funkcjonalnego znaczenia odrębnego ropnia immunologicznego w kontekście udaru niedokrwiennego.