Name: Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji i analizy cytometrycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka. Technika dostarcza ilościowych danych o liczbie i aktywacji komórek immunologicznych we wczesnym mikrośrodowisku nowotworowym mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NIH/NINDS) granty R01-NS074387, R01-NS057711 i R21-NS091555 dla M.G.C.; NIH/NINDS przyznaje PRL R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 i R21-NS084275; granty z Leah's Happy Hearts, University of Michigan Comprehensive Cancer Center przyznane M.G.C. i P.R.L.; Wydział Neurochirurgii Szkoły Medycznej Uniwersytetu Michigan; Michigan Institute for Clinical and Health Research, wspierany przez grant NIH 2UL1-TR000433; University of Michigan Cancer Biology Training Grant wspierany przez NIH/NCI (National Cancer Institute) grant T32-CA009676; Szkolenie Uniwersytetu Michigan w zakresie neuronauki klinicznej i podstawowej wspierane przez grant NIH/NINDS T32-NS007222; oraz University of Michigan Medical Scientist Training Program wspierany przez NIH/NIGMS (National Institute of General Medicine Sciences) grant T32-GM007863. Autorzy są wdzięczni za przywództwo naukowe i wsparcie otrzymane od dr Karin Muraszko i Kliniki Neurochirurgii; M. Dahlgrenowi, D. Tomfordowi i S. Napolitanowi za znakomite wsparcie administracyjne; M. Dzamanowi za wybitną pomoc techniczną; oraz Philowi F. Jenkinsowi za hojne wsparcie w zakupie skaningowego mikroskopu elektronowego 3D firmy Zeiss. Uznajemy również laboratorium Kuchroo w Harvard Medical School, z którego opracowano zmodyfikowaną wersję strategii izolacji komórek jednojądrzastych mózgu za pośrednictwem wirowania gęstości, w której pośredniczy.

<ol><li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li>
<li>Kennedy, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+glioma%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol.%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe?</a> J Oncol.. 2013, 486912(2013).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li>
<li>Kmiecik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD3%2B+and+CD8%2B+tumor-infiltrating+immune+cells+correlate+with+prolonged+survival+in+glioblastoma+patients+despite+integrated+immunosuppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment+and+at+the+systemic+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level.</a> J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+infiltrate+differences+in+pilocytic+astrocytoma+and+glioblastoma%3A+evidence+of+distinct+immunological+microenvironments+that+reflect+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology.</a> J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial%2Fmacrophage+expression+of+interleukin+10+in+human+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas.</a> Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).</li>
<li>El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increase+in+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+of+human+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme.</a> Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+regulation+of+human+monocytic%2Fmicroglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation.</a> J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+mediates+endogenous+TLR2+activation+and+brain+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression.</a> PLoS Med. 6, e10(2009).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+recruits+plasmacytoid+dendritic+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain.</a> J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).</li>
<li>Mineharu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+brain+tumor+microenvironment+enhances+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination%3A+implications+for+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design.</a> Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).</li>
<li>Larocque, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+overrides+brain+immune+privilege+and+facilitates+recognition+of+a+neo-antigen+without+causing+autoimmune+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).</li>
<li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+depletion+inhibits+efficacy+of+cancer+immunotherapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials.</a> PLoS One. 3, e1983(2008).</li>
<li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunostimulation+and+conditional+cytotoxic+gene+therapy+provide+long-term+survival+in+a+large+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model.</a> Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).</li>
<li>Dewey, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+brain+inflammation+and+persistent+herpes+simplex+virus+1+thymidine+kinase+expression+in+survivors+of+syngeneic+glioma+treated+by+adenovirus-mediated+gene+therapy%3A+implications+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials.</a> Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+eradicate+galectin-1-deficient+glioma+in+the+absence+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity.</a> Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).</li>
<li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+glioma+formation%3A+iterative+perivascular+glioma+growth+and+invasion+leads+to+tumor+progression%2C+VEGF-independent+vascularization%2C+and+resistance+to+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy.</a> Neoplasia. 16, 543-561 (2014).</li>
<li>Ormerod, M. G., Novo, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Flow+cytometry+%3A+a+basic+introduction%22">Flow cytometry : a basic introduction</a>. , (2008).</li>
<li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li>
<li>Hirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+phenotype+of+activated+microglia%2Fmacrophages+within+the+spinal+cord+of+the+hyperostotic+mouse+%28twy%2Ftwy%29+changes+in+response+to+chronic+progressive+spinal+cord+compression%3A+implications+for+human+cervical+compressive+myelopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy.</a> PLoS One. 8, e64528(2013).</li>
<li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+%28Gr-1%29+detects+members+of+the+Ly-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69, 431-439 (2009).</li>
<li>Holland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats%3A+the+effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li>
<li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li>
<li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li>
<li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje solidną i powtarzalną metodę izolacji i analizy cytometrii przepływowej PBMC, które przeniknęły do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu myszy. Zawiesiny komórek glejaka są generowane w stężeniu określonym przez eksperymentatora, które są stereotaktycznie wszczepiane do prążkowia mózgu myszy. Myszy są następnie poddawane eutanazji w określonych punktach czasowych określonych w projekcie eksperymentalnym, a ich mózgi są zbierane i przetwarzane w celu wyizolowania PBMC naciekających glejaka, które są zn...

Glejaki to klasa neuroepitelialnych nowotworów mózgu powstałych w wyniku transformacji gleju w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Spośród wszystkich glejaków, glejak IV stopnia Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) lub glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszy i śmiertelny1. GBM jest wysoce oporny na leczenie w stosunku do obecnego standardu leczenia, który składa się z resekcji guza w miarę możliwości, a następnie radioterapii oraz jednoczesnej i uzupełniającej chemioterapii temozolomidem2. Te śmiertelne nowotwory wiążą się z ponurą prognozą przeżycia wynoszącą zaledwie 15-18 miesięcy od momentu wstępnej diagnozy, przy czym tylko 5% pacjentów przeżywa chorobę po 5 latach3.
Obecność bariery krew-mózg (BBB), brak profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) oraz wcześniej niezidentyfikowane istnienie bona fide struktur limfatycznychw mózgu4 doprowadziły do uznania GBM za uprzywilejowany immunologicznie. Jednak liczne badania pokazują obecnie, że te nowotwory mózgu rzeczywiście powodują rekrutację obwodowych komórek odpornościowych, które są głównie pochodzenia szpikowego, w tym monocytów, makrofagów i komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC)5. GBM wpływa również na aktywność mikrogleju rezydującego w mózgu, stając się pronowotworowym6,7. Komórki limfoidalne, takiejak limfocyty T CD8 + 8 i komórki NK CD56 + 9 są również obecne w mikrośrodowisku guza, ale w znacznie mniejszej liczbie, co uważa się za spowodowane funkcją immunosupresyjną wywołaną przez czynniki pochodzące z glejaka na makrofagach związanych z nowotworem (TAM)10. Limfocyty T CD4 + są również obecne w GBM, ale duża część tej populacji wykazuje również ekspresję CD25 i FoxP3, twórców immunosupresyjnych komórek regulatorowych T (T reg)11. Ogólny stan immunosupresyjny GBM kończy się promowaniem ucieczki immunologicznej i progresji guza12.
Lepsze zrozumienie mechanizmów immunosupresji GBM jest kluczowe dla rozwoju skutecznych strategii immunoterapeutycznych mających na celu stymulację układu odpornościowego przeciwko nowotworowi. W ciągu ostatnich 15 lat nasze laboratorium pracowało nad przezwyciężeniem mechanizmów immunosupresynu guza mózgu w celu opracowania skutecznych nowych immunoterapeutyków anty-GBM13-19. Kulminacja tych prac doprowadziła do przeprowadzenia badania klinicznego mającego na celu ocenę skojarzonego leku cytotoksycznego i immunostymulującego u pacjentów z nowo zdiagnozowanym GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).
Nasza najnowsza praca pokazuje, że mysie komórki GL26 i szczurzego OUN-1 GBM blokują przeciwnowotworowy nadzór immunologiczny komórek NK poprzez wytwarzanie dużych ilości wiążącej β-galaktozydy lektyny galektyny-1 (gal-1)20. Wykazano to poprzez hamowanie ekspresji gal-1 w komórkach glejaka za pomocą knockdownu genu za pośrednictwem shRNA. Eksperymenty in vitro wykazały, że komórki glejaka z niedoborem gal-1 proliferowały normalnie w hodowli, ale uległy szybkiemu odrzuceniu wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym syngenicznym myszom C57BL / 6J lub RAG1 / /, ustalając w ten sposób niezależność limfocytów T lub B od tej formy odrzucenia guza. Zubożenie odporności komórek NK za pomocą surowicy anty-asialo GM1 lub monoklonalnych przeciwciał NK1.1 doprowadziło do całkowitego przywrócenia wzrostu glejaka z niedoborem gal-1 wewnątrzczaszkowego, ustalając rolę komórek NK w odrzuceniu glejaka z niedoborem gal-1. Pokazujemy teraz, że zubożenie odporności komórek szpikowych Gr-1 + / CD11b + jest wystarczające, aby zapobiec odrzuceniu glejaka z niedoborem gal-1 pomimo obecności komórek NK, ujawniając w ten sposób nieodzowną rolę pomocniczą komórek szpikowych we wspomaganiu lizy guza z niedoborem gal-1 za pośrednictwem NK (dane niepublikowane). Ten nieoczekiwany wynik skłonił nas do opracowania kompleksowego protokołu izolacji i analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które infiltrują mikrośrodowisko guza mózgu wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym, abyśmy mogli lepiej scharakteryzować zdarzenia naciekania immunologicznego, które wskazują na odrzucenie glejaka z niedoborem gal-1.
Metoda jest tutaj demonstrowana przy użyciu mysich komórek glejaka GL26, które konstytutywnie wyrażają fluorescencyjne białko mCitrine, zwane GL26-Cit, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację komórek nowotworowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej21. Komórki te są stereotaktycznie wszczepiane do mózgu syngenicznych myszy C57BL / 6J i mogą rosnąć przez 24, 48 lub 72 godziny przed eutanazją myszy. PBMC naciekające glejaka są następnie izolowane i znakowane immunologicznie za pomocą przeciwciał powierzchniowych anty -CD45, -Gr-1, -CD11b i -NK1.1 wraz z wewnątrzkomórkowym znakowaniem immunologicznym dla granzymu B (GzmB). Ta specyficzna kombinacja przeciwciał pozwala na identyfikację naciekających nowotwór komórek szpikowych Gr-1 + / CD11b + i komórek NK1.1 +, NK, komórek NK, typów komórek, które są zaangażowane w odrzucenie guza z niedoborem gal-1. Profil infiltracji immunologicznej glejaka GL26-Cit z niedoborem gal-1, określanego tutaj jako GL26-Cit-gal1i, jest następnie porównywany z profilem glejaków wyrażających normalne poziomy gal-1 zwane GL26-Cit-NT, które zawierają kontrolną spinkę do włosów shRNA, która nie jest ukierunkowana. Protokół rozpoczyna się od opisu, jak hodować komórki glejaka GL26-Cit in vitro, po którym następuje wyjaśnienie, jak ortotopowo wszczepić te komórki do prążkowia syngenicznych myszy C57BL / 6J. Następnie przechodzi do wyliczenia etapów związanych z izolacją i znakowaniem immunologicznym PBMC naciekających glejaka do analizy cytometrii przepływowej. Protokół kończy się wyjaśnieniem standardowej analizy danych i reprezentacją graficzną.
Demonstracja pokazuje, że zarówno komórki szpikowe Gr-1+/CD11b+, jak i komórki NK NK1.1+ preferencyjnie akumulują się w mikrośrodowisku guza mózgu z niedoborem gal-1 w ciągu 48 godzin od implantacji guza, co pomaga wyjaśnić, dlaczego te guzy szybko przechodzą całkowitą lizę guza około 1 tygodnia po wszczepieniu guza20. Metodę tę można łatwo dostosować do wielu różnych projektów eksperymentalnych in vivo, w których wymagane są dane czasowe dotyczące infiltracji immunologicznej mózgu. Pojedynczy eksperymentator może wykonać protokół od pobrania mózgu do analizy cytometrycznej przepływowej PBMC naciekających glejaka w ciągu około 4-6 godzin, w zależności od liczby próbek do analizy. Metodę można również połączyć z eksperymentami mającymi na celu scharakteryzowanie profilu krążących PBMC u myszy z guzem w celu porównania z tymi, które infiltrują mózg, aby zidentyfikować fenotypy immunosupresji specyficznie indukowane przez mikrośrodowisko guza. Zastosowanie tej i podobnych metod powinno ułatwić lepsze zrozumienie czynników zaangażowanych w transport obwodowych komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza mózgu.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Modyfikacja Orłaków Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>z 4,5g/L D-glukozy, L-glutaminą, 25 mM HEPES i czerwienią fenolową.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10 000 j./ml penicyliny; 10 000 &mu; g/ml Streptomycyny&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 siarczan&nbsp;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek puromycyny&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>z Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase alternatywa dla trypsyny dla ssaków&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>w DPBS z EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometr z kontrastem fazowym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>głębokości 0,1 mm</td></tr><tr><td>Trypanowa niebieska plama</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 0,9% NaCl do wstrzykiwań, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>Fiolki 10 ml</td></tr><tr><td>0,6 ml stożkowe mikroprobówki polipropylenowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek atypamezolu do wstrzykiwań</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>Roztwór 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>100 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Chlorowodorek deksmedetomidyny do wstrzykiwań</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>0,5 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny do wstrzykiwań</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>100 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie karprofenu</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwań</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>0,3 mg/ml ampułki</td></tr><tr><td>1 ml strzykawki tuberkulinowe&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; Igły do strzykawek (0,45 mm x 13 mm)&nbsp;</td><td>Maszynki</td><td></td> do strzyżenia chirurgicznego BD 305111 <td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór prowidonu i jodu</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Sterylna wazelina maść okulistyczna&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki przygotowawcze z 70% alkoholem izopropylowym</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td> Włóknina <td>Covidien</td><td>8044</td>, <td>4" x 4", 4-warstwowa&nbsp;</td></tr><tr><td>1,7 ml stożkowe mikroprobówki polipropylenowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna myszy</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Lampa chirurgiczna</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Zmienny reflektor</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze preparacyjne</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Retraktory Colibri&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Akumulatorowa wiertarka precyzyjna</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td><td>Model rysika; 7,2 V litowo-jonowy ze stacją dokującą</td></tr><tr><td>Frez do grawerowania</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" lub 0,8 mm średnica bitu</td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Hamilton Strzykawki mikrolitrowe seria 700; 5 &mu; l objętość</td></tr><tr><td>Igły strzykawkowe mikrolitrowe</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, mała piasta RN NDL, 1,5 cala, styl punktowy 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 czarne monofilamentowe nylonowe nici&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>Średnica 7,9 mm x długość 50 mm (średnica 5/16" x długość 2")</td></tr> 1 <tr><td>L szklana butelka do przechowywania z nakrętką</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Typ 1, klasa A szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>1,000 U/ml roztwór</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II napęd konsoli</td></tr><tr><td>skompresowany karbogen (95% O2 / 5% CO2)</td><td>dostępny od lokalnego dostawcy</td><td>Nie</td> dotyczy <td>typu A, duża butla&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 & frac12; " Aluminiowe igły</td><td>piasty Kendall</td><td>8881202363</td><td>0,9 mm x 38,1 mm</td></tr><tr><td>Poliuretanowe wiadro na lód</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Pojemność: 0,152 uncji (4,5 l)</td></tr><tr><td>Kolagenaza (typ I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>z Clostridium histolyticum&nbsp;</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2 000 jednostek Kunitz na mg suchej masy</td></tr><tr><td>Antystatyczne sześciokątne naczynia wagowe z polistyrenu</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>górna średnica wewnętrzna 115 mm, średnica wewnętrzna podstawy 85 mm, objętość 203 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Żyletki jednosieczne ze stali nierdzewnej&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs kostne</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki preparacyjne</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki preparacyjne</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z końcem</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml szklany młynek do tkanek Kontes</td><td></td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wirowania gęstości Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>jednorazowego użytku; sterylne</td></tr><tr><td>70 &mu; M Sterylne sitka do komórek z siatki nylonowej&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-sprzężony szczur anty-mysi CD45 (klon: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz skoniugowany z APC NK1.1 (klon: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi Gr-1 (klon: RB6-8C5) sprzężony z PE</td> BD <td>Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-sprzężony szczur anty-mysi CD11b (klon: M1/70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-sprzężony szczur IgG2b, &kappa; (klon: RTK4530) Kontrola ISOTYPU&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>myszy sprzężonej z APC IgG2a, &kappa; (klon: eBM2a) kontrola izotypu&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>Szczur sprzężony z PE IgG2b, &kappa; (klon: eB149/10H5) kontrola izotypu&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b szczura sprzężonego z PerCP/Cy5.5 i kappa; (klon: RTK4530) kontrola izotypu</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue-sprzężony mysz anty-mysz granzyme B (klon: GB11)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 myszy sprzężonej z błękitem pacyficznym IgG1, &kappa; (Klon: MOPC-21) kontrola izotypu&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>stożkowe dno&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z polipropylenu 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>stożkowe dno</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm okrągłe probówki polipropylenowe FACS&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Badania na specjalne zamówienie Produkt Cytometr przepływowy/sortownik komórek</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy II</td><td>Firma Baker SG603</td><td></td><td>model: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Nasze laboratorium niedawno wykazało, że komórki NK są zdolne do wyeliminowania złośliwych glejaków złośliwych myszy GL26 i szczurzego CNS-1 wszczepionych ortotopowo wkrótce po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym, jeśli komórki rakowe mają niedobór ekspresji lektyny wiążącej β-galaktozyd, galektyny-1 (gal-1). Nowsze badania pokazują, że populacja komórek szpikowych Gr-1+/CD11b+ ma kluczowe znaczenie dla tego efektu. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy, za pomocą których NK i komórki szpikowe współpracują w celu odrzucenia guza z niedoborem gal-1, opracowaliśmy kompleksowy protokół izolacji i analizy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekających glejaka (PBMC). Metodę zademonstrowano tutaj, porównując naciekanie PBMC do mikrośrodowiska guza glejaków GL26 z ekspresją gal-1 z tymi, u których występuje niedobór gal-1 poprzez knockdown shRNA. Protokół rozpoczyna się od opisu, w jaki sposób hodować i przygotowywać komórki GL26 do inokulacji w syngenicznym mózgu myszy C57BL/6J. Następnie wyjaśniono etapy związane z izolacją i analizą cytometryczną przepływową PBMC naciekających glejaka z wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu. Metodę tę można dostosować do wielu projektów eksperymentalnych in vivo, w których wymagane są dane czasowe dotyczące infiltracji immunologicznej do mózgu. Metoda jest czuła i wysoce powtarzalna, ponieważ PBMC naciekające glejaka można wyizolować z guzów wewnątrzczaszkowych już po 24 godzinach od wszczepienia guza z podobną liczbą komórek obserwowaną na podstawie guzów dopasowanych do punktu czasowego w niezależnych eksperymentach. Pojedynczy eksperymentator może wykonać metodę od pobrania mózgu do analizy cytometrycznej przepływowej PBMC naciekających glejaka w ciągu około 4-6 godzin, w zależności od liczby próbek do analizy. Alternatywne modele glejaka i/lub przeciwciała wykrywające specyficzne dla komórki mogą być również stosowane według uznania eksperymentatorów do oceny infiltracji kilku innych typów komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania bez potrzeby wprowadzania zmian w całej procedurze.

W typowym eksperymencie stosuje się następującą strategię bramkowania: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. count → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. count. Bramki ustawione na komórki mieloidalne Gr-1+/CD11b+ oraz komórki NK NK1.1+ są następnie stratyfikowane na podstawie ekspresji GzmB (Rysunek 5A). Backgating komórek zidentyfikowanych w naszych eksperymentach jako komórki NK NK1.1+ i komórki mieloidalne Gr-1+/CD11b+ n...

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie i ilościowe określenie liczby komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, które przeniknęły do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii guzów mózgu poprzez identyfikację czynników ważnych dla transportu obwodowych komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona zależne od czasu dane ilościowe dotyczące liczby i statusu aktywacji leukocytów, które dostały się do tego OUN.Po umieszczeniu znieczulonej myszy w ramce stereotaktycznej, wykonaj dwucentymetrowe nacięcie linii środkowej nad czaszką od kości czołowej do kości potylicznej za pomocą ostrza skalpela. Następnie cofnij skórę w miejscu nacięcia za pomocą retraktorów Collibra. Następnie opuść strzykawkę o pojemności mikrolitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 33 bezpośrednio nad bma.Dostosuj położenie igły, aby dotrzeć do miejsca docelowego implantacji guza. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby zaznaczyć to miejsce, delikatnie ocierając się o okostną. Wywierć otwór w czaszce w miejscu docelowym wiertłem o średnicy 0,8 milimetra, aż dotrze do leżącej poniżej opony twardej podczas wiercenia.Stosuj przerywany nacisk, a następnie szybko zdejmij wiertło z powierzchni czaszki, aby uniknąć nadmiernego ciepła i siły. Następnie przepłucz strzykawkę z mikrolitrem 0,9% chlorku sodu w stożkowej mikroprobówce polipropylenowej o pojemności 1,7 mililitra, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana. Delikatnie przesuń kilkakrotnie stożkową mikrorurkę polipropylenową o pojemności 0,6 mililitra zawierającą komórki nowotworowe, aby dokładnie zawiesić komórki.Następnie pobrać dwa mikrolitry komórek do strzykawki mikrolitrowej i upewnić się, że do strzykawki nie zostały wprowadzone pęcherzyki powietrza. Dozuj jeden mikrolitr komórek na podkładkę do przygotowywania 70% alkoholu izopropylowego, pozostawiając dokładnie jeden mikrolitr komórek nowotworowych w strzykawce. Następnie przyłóż igłę w dół, aż dotknie opony twardej.Następnie opuść igłę na 3,5 milimetra do mózgu, a następnie cofnij igłę o 0,5 milimetra powoli i płynnie. Dostarczyć komórki, naciskając tłok strzykawki w ciągu jednej do dwóch minut. Aby wykonać perfuzję przezsercową na głęboko znieczulonej myszy.Wbić igłę do lewej komory serca. Użyj małej pary nożyczek do preparacji, aby przeciąć prawy przedsionek, aby umożliwić wykrwawienie perfuzji, układu krążenia myszy roztworem tyro przez kilka minut, aż wątroba i płuca całkowicie zbledną z powodu braku krwi. Upewnij się, że żadna duża ilość krwi nie wydostaje się z prawego przedsionka.Przed wyjęciem igły piasty z aluminium o rozmiarze 20 z lewej komory. Po wyjęciu igły odpiąć mysz od bloku z ekstrudowanej pianki polistyrenowej i obrócić mysz brzuszną stroną do dołu. Za pomocą dużej pary nożyczek preparacyjnych oddziel głowę od reszty ciała.Następnie przetnij skórę głowy na linii środkowej za pomocą małej pary nożyczek preparacyjnych pracujących od kości potylicznej do pyska, aby odsłonić czaszkę. Następnie cofnij skórę po obu stronach czaszki i mocno przytrzymaj czaszkę. Użyj pary kostnych URS, aby ostrożnie przebić się przez czaszkę, zaczynając od kości potylicznej i pracuj do przodu, aby całkowicie odsłonić grzbietową i boczną powierzchnię mózgu.Pobranie mózgu myszy z czaszki bez spowodowania jej uszkodzenia może początkowo okazać się trudne. Ci, którzy nie mają doświadczenia w tej technice, mogą chcieć spróbować kilka razy przed przeprowadzeniem odpowiednich eksperymentów. Po usunięciu kości czaszki odwróć głowę myszy brzuszną stroną do góry.Przetnij nerwy czaszkowe u podstawy mózgu, aby uwolnić je od czaszki. W tej procedurze za pomocą czystej, jednosiecznej żyletki należy wyizolować obszar mózgu zawierający guz, wykonując strzałkowe cięcie w środku mózgu. Aby wyciąć dwie półkule, odwróć półkulę ipsilateralną przyśrodkową w dół i wykonaj jedno nacięcie koronalne w móżdżku, a drugie nacięcie w opuszce węchowej, aby wyizolować tkankę docelową zawierającą implant nowotworowy.Następnie umieść docelową tkankę w oznakowanym młynku do tkanek ze szkła zawierającym jeden mililitr DPBS. Wcisnąć tłok do końca w dół i przekręcić go siedem razy, aby przerwać działanie tkanki. Następnie podnieś tłok, aby płyn opadł z powrotem na dno młynka do tkanek.Powtórz ten krok trzy razy. Jednak przekręć tłok tylko cztery razy podczas następnych dwóch powtórzeń i trzy razy podczas ostatniego powtórzenia. Aby uniknąć nadmiernego obciążania tkanki mózgowej.Następnie nałóż trzy jednomililitrowe objętości lodowatego DPBS na boki tłoka, aby wypłukać resztki materii mózgowej do młynka do tkanek. Następnie zawieszamy materię mózgową TRID poprzez pipetowanie w górę iw dół i umieszczamy w oznakowanej 15-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Opłucz boki młynka do tkanek dodatkowym mililitrem lodowatego DPBS i dodaj do tej samej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Trzymaj wszystkie probówki zawierające TRID materię mózgową na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone. Następnie odwiruj materię mózgową TRID w 15-mililitrowych probówkach wirówkowych o temperaturze 740 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić granulowaną materię mózgową w jednym mililitrze wcześniej przygotowanej mieszaniny kolagenazy i enzymów trawiennych DNA.Umieść 15-mililitrowe probówki wirówkowe w stojaku na probówki i umieść stojak w łaźni wodnej CS o temperaturze 37 stopni na 15 minut. Następnie delikatnie mieszaj próbki dwukrotnie w okresie inkubacji, przesuwając probówki, aby ułatwić dezagregację tkanek. Następnie dodaj sześć mililitrów zimnego DPBS do każdej probówki, aby rozcieńczyć enzymy trawienne.Ruruj to w górę iw dół, aby ponownie zawiesić i przefiltrować całkowitą objętość przez sterylne filtry z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów do nowych, oznaczonych 15-mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie. Następnie obracaj zawiesinę komórek mózgowych w dół z prędkością 740 razy G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać osad z pojedynczą komórką. Wyjmij 15-mililitrowe probówki z wirówki i umieść je na lodzie.Następnie zwiększ ustawienie temperatury w wirówce do około 21 stopni Celsjusza, przygotowując się do następnego kroku. Następnie całkowicie usuń naciek komórek i wstępnie ponownie zawieś granulki komórek w jednym mililitrze pożywki wirowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P 1000. Następnie dodaj cztery dodatkowe mililitry pożywki wirówkowej o gęstości 70% do każdej probówki.Załóż bezpiecznie nakrętki i homogenizuj zawiesinę komórek, delikatnie odwracając probówkę kilka razy, a następnie przenieś 15-mililitrowe probówki wirówkowe zawierające komórki mózgowe zawieszone w gęstości 70%. Odwirowywanie pożywki z lodu do stojaka na probówki w temperaturze pokojowej pojedynczo. Ostrożnie nałóż dwa mililitry roztworu pożywki wirówkowej o gęstości 37% na pięć mililitrów pożywki wirowej o gęstości 70%, aby utworzyć czysty interfejs między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o gęstości.Następnie zaznacz położenie granicy faz między dwiema warstwami markerem z cienką końcówką, aby można ją było łatwo zidentyfikować po odwirowaniu, gdy różnica staje się mniej widoczna. Wirować 15-mililitrowe probówki wirówkowe z prędkością 740 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Aby uniknąć późniejszego zakłócenia granicy faz między warstwami pożywki do wirowania gęstości, należy zebrać pbmc, które zgromadziły się na granicy faz między dwiema warstwami pożywki do wirowania gęstości, wprowadzając do probówki mikropipetę P 200.Ostrożnie omijając warstwę lipidową raz na poziomie pasma PBMC, powoli wyekstrahuj 200 mikrolitrów z powierzchni warstwy pożywki wirującej o gęstości 70% i przenieś do odpowiednio oznakowanej polipropylenowej rurki faksowej na lodzie. Powtórz ten krok raz, aby uzyskać całkowitą objętość 400 mikrolitrów na próbkę. Zdolność eksperymentatorów do tworzenia czystej granicy między dwiema warstwami pożywki wirującej o dużej gęstości ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnej izolacji p BMC.Należy powoli wlewać pożywkę wirówkową o gęstości 37%, ustawiając probówkę pod kątem 20 do 30 stopni nad blatem. Rysunek ten przedstawia strategię bramkowania dla typowej bramki eksperymentalnej umieszczonej na GR jednej dodatniej komórki szpikowej CD 11 B pokazanej w kroku piątym i NK 1.1. Dodatnie komórki NK pokazane w kroku szóstym są następnie stratyfikowane na podstawie ekspresji GZMB odpowiednio w krokach piątym i szóstym pierwszym.Na tym rysunku bramkowanie wsteczne GR jednej dodatniej komórki szpikowej CD 11 B i komórek NK 1,1 dodatnich komórek NK w porównaniu z SSCA pokazuje mniejszy rozmiar limfoidalny komórek NK w porównaniu ze stosunkowo większą populacją szpikową, zapewniając w ten sposób dalsze potwierdzenie tożsamości tych dwóch subpopulacji pbmc. Przedstawione tutaj dane pokazują, że wszczepienie komórek glejaka GL 26 sital one I do syngenu. Mózg myszy XC 57 z czarną szóstką J szybko indukuje rekrutację dodatnich liczb PBMC CD 45 pokazanych w połączeniu z każdym punktem danych wzdłuż krzywej GL 26 sit GAL jeden I reprezentuje indukcję fałdowania naciekającego guz pbmc powyżej kontroli.GGL 26 siedzi w guzach NT w określonej godzinie po implantacji guza lub HPI w oparciu o specyficzny koktajl przeciwciał zastosowany w demonstracji: wykazano, że GR jeden dodatni CD 11 B dodatnie komórki szpikowe i NK 1.1 Dodatnie komórki NK NK specyficznie wchodzą do GAL jednego mikrośrodowiska guza z niedoborem w ciągu 48 godzin od wszczepienia guza. Jednak całkowita liczba komórek szpikowych naciekających glejaka znacznie przewyższała liczbę komórek NK . Po opanowaniu metodologia jest nakreślana od zbierania mózgów do przepływu.Analiza cytometryczna może być wykonana w ciągu około sześciu godzin przez jednego eksperymentatora. Konieczne jest, aby cała objętość każdej próbki PBMC była analizowana za pomocą cytometru przepływowego w celu uzyskania rzetelnego porównania całkowitej liczby eksperymentów uzupełniających pbmc naciekających glejaka. Taka analiza immunohistochemiczna może być przeprowadzona w celu uzyskania danych przestrzennych na temat nacieków komórek odpornościowych i umożliwienia pomiaru ogólnej wielkości guza i mikroanatomii w punktach czasowych, które odpowiadają punktom ocenianym za pomocą tej procedury.Technika ta może być zastosowana do badania różnych modeli guzów mózgu, w tym tych generowanych de novo za pomocą onkogenu kodującego DNA osocza bez istotnych zmian w całej procedurze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować zawiesiny komórek glejaka do stereotaktycznego i przeszczepu do mózgu myszy, jak przejść obfity guz, myszy z mózgiem oraz jak izolować i przepływać cyto metrycznie, analizować glejaka naciekającego komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie barwnika fluorescencyjnego estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do identyfikacji i separacji różnych subpopulacji komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym na podstawie częstotliwości podziałów komórkowych.

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Poznaj metodę izolacji i analizy cytometrycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka. Technika dostarcza ilościowych danych o liczbie i aktywacji komórek immunologicznych we wczesnym mikrośrodowisku nowotworowym mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Przeglądaj więcej filmów