Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie i ilościowe określenie liczby komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, które przeniknęły do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii guzów mózgu poprzez identyfikację czynników ważnych dla transportu obwodowych komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona zależne od czasu dane ilościowe dotyczące liczby i statusu aktywacji leukocytów, które dostały się do tego OUN.

Po umieszczeniu znieczulonej myszy w ramce stereotaktycznej, wykonaj dwucentymetrowe nacięcie linii środkowej nad czaszką od kości czołowej do kości potylicznej za pomocą ostrza skalpela. Następnie cofnij skórę w miejscu nacięcia za pomocą retraktorów Collibra. Następnie opuść strzykawkę o pojemności mikrolitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 33 bezpośrednio nad bma.

Dostosuj położenie igły, aby dotrzeć do miejsca docelowego implantacji guza. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby zaznaczyć to miejsce, delikatnie ocierając się o okostną. Wywierć otwór w czaszce w miejscu docelowym wiertłem o średnicy 0,8 milimetra, aż dotrze do leżącej poniżej opony twardej podczas wiercenia.

Stosuj przerywany nacisk, a następnie szybko zdejmij wiertło z powierzchni czaszki, aby uniknąć nadmiernego ciepła i siły. Następnie przepłucz strzykawkę z mikrolitrem 0,9% chlorku sodu w stożkowej mikroprobówce polipropylenowej o pojemności 1,7 mililitra, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana. Delikatnie przesuń kilkakrotnie stożkową mikrorurkę polipropylenową o pojemności 0,6 mililitra zawierającą komórki nowotworowe, aby dokładnie zawiesić komórki.

Następnie pobrać dwa mikrolitry komórek do strzykawki mikrolitrowej i upewnić się, że do strzykawki nie zostały wprowadzone pęcherzyki powietrza. Dozuj jeden mikrolitr komórek na podkładkę do przygotowywania 70% alkoholu izopropylowego, pozostawiając dokładnie jeden mikrolitr komórek nowotworowych w strzykawce. Następnie przyłóż igłę w dół, aż dotknie opony twardej.

Następnie opuść igłę na 3,5 milimetra do mózgu, a następnie cofnij igłę o 0,5 milimetra powoli i płynnie. Dostarczyć komórki, naciskając tłok strzykawki w ciągu jednej do dwóch minut. Aby wykonać perfuzję przezsercową na głęboko znieczulonej myszy.

Wbić igłę do lewej komory serca. Użyj małej pary nożyczek do preparacji, aby przeciąć prawy przedsionek, aby umożliwić wykrwawienie perfuzji, układu krążenia myszy roztworem tyro przez kilka minut, aż wątroba i płuca całkowicie zbledną z powodu braku krwi. Upewnij się, że żadna duża ilość krwi nie wydostaje się z prawego przedsionka.

Przed wyjęciem igły piasty z aluminium o rozmiarze 20 z lewej komory. Po wyjęciu igły odpiąć mysz od bloku z ekstrudowanej pianki polistyrenowej i obrócić mysz brzuszną stroną do dołu. Za pomocą dużej pary nożyczek preparacyjnych oddziel głowę od reszty ciała.

Następnie przetnij skórę głowy na linii środkowej za pomocą małej pary nożyczek preparacyjnych pracujących od kości potylicznej do pyska, aby odsłonić czaszkę. Następnie cofnij skórę po obu stronach czaszki i mocno przytrzymaj czaszkę. Użyj pary kostnych URS, aby ostrożnie przebić się przez czaszkę, zaczynając od kości potylicznej i pracuj do przodu, aby całkowicie odsłonić grzbietową i boczną powierzchnię mózgu.

Pobranie mózgu myszy z czaszki bez spowodowania jej uszkodzenia może początkowo okazać się trudne. Ci, którzy nie mają doświadczenia w tej technice, mogą chcieć spróbować kilka razy przed przeprowadzeniem odpowiednich eksperymentów. Po usunięciu kości czaszki odwróć głowę myszy brzuszną stroną do góry.

Przetnij nerwy czaszkowe u podstawy mózgu, aby uwolnić je od czaszki. W tej procedurze za pomocą czystej, jednosiecznej żyletki należy wyizolować obszar mózgu zawierający guz, wykonując strzałkowe cięcie w środku mózgu. Aby wyciąć dwie półkule, odwróć półkulę ipsilateralną przyśrodkową w dół i wykonaj jedno nacięcie koronalne w móżdżku, a drugie nacięcie w opuszce węchowej, aby wyizolować tkankę docelową zawierającą implant nowotworowy.

Następnie umieść docelową tkankę w oznakowanym młynku do tkanek ze szkła zawierającym jeden mililitr DPBS. Wcisnąć tłok do końca w dół i przekręcić go siedem razy, aby przerwać działanie tkanki. Następnie podnieś tłok, aby płyn opadł z powrotem na dno młynka do tkanek.

Powtórz ten krok trzy razy. Jednak przekręć tłok tylko cztery razy podczas następnych dwóch powtórzeń i trzy razy podczas ostatniego powtórzenia. Aby uniknąć nadmiernego obciążania tkanki mózgowej.

Następnie nałóż trzy jednomililitrowe objętości lodowatego DPBS na boki tłoka, aby wypłukać resztki materii mózgowej do młynka do tkanek. Następnie zawieszamy materię mózgową TRID poprzez pipetowanie w górę iw dół i umieszczamy w oznakowanej 15-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Opłucz boki młynka do tkanek dodatkowym mililitrem lodowatego DPBS i dodaj do tej samej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Trzymaj wszystkie probówki zawierające TRID materię mózgową na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną przetworzone. Następnie odwiruj materię mózgową TRID w 15-mililitrowych probówkach wirówkowych o temperaturze 740 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić granulowaną materię mózgową w jednym mililitrze wcześniej przygotowanej mieszaniny kolagenazy i enzymów trawiennych DNA.

Umieść 15-mililitrowe probówki wirówkowe w stojaku na probówki i umieść stojak w łaźni wodnej CS o temperaturze 37 stopni na 15 minut. Następnie delikatnie mieszaj próbki dwukrotnie w okresie inkubacji, przesuwając probówki, aby ułatwić dezagregację tkanek. Następnie dodaj sześć mililitrów zimnego DPBS do każdej probówki, aby rozcieńczyć enzymy trawienne.

Ruruj to w górę iw dół, aby ponownie zawiesić i przefiltrować całkowitą objętość przez sterylne filtry z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów do nowych, oznaczonych 15-mililitrowych probówek wirówkowych na lodzie. Następnie obracaj zawiesinę komórek mózgowych w dół z prędkością 740 razy G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać osad z pojedynczą komórką. Wyjmij 15-mililitrowe probówki z wirówki i umieść je na lodzie.

Następnie zwiększ ustawienie temperatury w wirówce do około 21 stopni Celsjusza, przygotowując się do następnego kroku. Następnie całkowicie usuń naciek komórek i wstępnie ponownie zawieś granulki komórek w jednym mililitrze pożywki wirowej o gęstości 70% za pomocą mikropipety P 1000. Następnie dodaj cztery dodatkowe mililitry pożywki wirówkowej o gęstości 70% do każdej probówki.

Załóż bezpiecznie nakrętki i homogenizuj zawiesinę komórek, delikatnie odwracając probówkę kilka razy, a następnie przenieś 15-mililitrowe probówki wirówkowe zawierające komórki mózgowe zawieszone w gęstości 70%. Odwirowywanie pożywki z lodu do stojaka na probówki w temperaturze pokojowej pojedynczo. Ostrożnie nałóż dwa mililitry roztworu pożywki wirówkowej o gęstości 37% na pięć mililitrów pożywki wirowej o gęstości 70%, aby utworzyć czysty interfejs między dwiema warstwami pożywki wirówkowej o gęstości.

Następnie zaznacz położenie granicy faz między dwiema warstwami markerem z cienką końcówką, aby można ją było łatwo zidentyfikować po odwirowaniu, gdy różnica staje się mniej widoczna. Wirować 15-mililitrowe probówki wirówkowe z prędkością 740 razy G przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez przerwy. Aby uniknąć późniejszego zakłócenia granicy faz między warstwami pożywki do wirowania gęstości, należy zebrać pbmc, które zgromadziły się na granicy faz między dwiema warstwami pożywki do wirowania gęstości, wprowadzając do probówki mikropipetę P 200.

Ostrożnie omijając warstwę lipidową raz na poziomie pasma PBMC, powoli wyekstrahuj 200 mikrolitrów z powierzchni warstwy pożywki wirującej o gęstości 70% i przenieś do odpowiednio oznakowanej polipropylenowej rurki faksowej na lodzie. Powtórz ten krok raz, aby uzyskać całkowitą objętość 400 mikrolitrów na próbkę. Zdolność eksperymentatorów do tworzenia czystej granicy między dwiema warstwami pożywki wirującej o dużej gęstości ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnej izolacji p BMC.

Należy powoli wlewać pożywkę wirówkową o gęstości 37%, ustawiając probówkę pod kątem 20 do 30 stopni nad blatem. Rysunek ten przedstawia strategię bramkowania dla typowej bramki eksperymentalnej umieszczonej na GR jednej dodatniej komórki szpikowej CD 11 B pokazanej w kroku piątym i NK 1.1. Dodatnie komórki NK pokazane w kroku szóstym są następnie stratyfikowane na podstawie ekspresji GZMB odpowiednio w krokach piątym i szóstym pierwszym.

Na tym rysunku bramkowanie wsteczne GR jednej dodatniej komórki szpikowej CD 11 B i komórek NK 1,1 dodatnich komórek NK w porównaniu z SSCA pokazuje mniejszy rozmiar limfoidalny komórek NK w porównaniu ze stosunkowo większą populacją szpikową, zapewniając w ten sposób dalsze potwierdzenie tożsamości tych dwóch subpopulacji pbmc. Przedstawione tutaj dane pokazują, że wszczepienie komórek glejaka GL 26 sital one I do syngenu. Mózg myszy XC 57 z czarną szóstką J szybko indukuje rekrutację dodatnich liczb PBMC CD 45 pokazanych w połączeniu z każdym punktem danych wzdłuż krzywej GL 26 sit GAL jeden I reprezentuje indukcję fałdowania naciekającego guz pbmc powyżej kontroli.

GGL 26 siedzi w guzach NT w określonej godzinie po implantacji guza lub HPI w oparciu o specyficzny koktajl przeciwciał zastosowany w demonstracji: wykazano, że GR jeden dodatni CD 11 B dodatnie komórki szpikowe i NK 1.1 Dodatnie komórki NK NK specyficznie wchodzą do GAL jednego mikrośrodowiska guza z niedoborem w ciągu 48 godzin od wszczepienia guza. Jednak całkowita liczba komórek szpikowych naciekających glejaka znacznie przewyższała liczbę komórek NK . Po opanowaniu metodologia jest nakreślana od zbierania mózgów do przepływu.

Analiza cytometryczna może być wykonana w ciągu około sześciu godzin przez jednego eksperymentatora. Konieczne jest, aby cała objętość każdej próbki PBMC była analizowana za pomocą cytometru przepływowego w celu uzyskania rzetelnego porównania całkowitej liczby eksperymentów uzupełniających pbmc naciekających glejaka. Taka analiza immunohistochemiczna może być przeprowadzona w celu uzyskania danych przestrzennych na temat nacieków komórek odpornościowych i umożliwienia pomiaru ogólnej wielkości guza i mikroanatomii w punktach czasowych, które odpowiadają punktom ocenianym za pomocą tej procedury.

Technika ta może być zastosowana do badania różnych modeli guzów mózgu, w tym tych generowanych de novo za pomocą onkogenu kodującego DNA osocza bez istotnych zmian w całej procedurze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować zawiesiny komórek glejaka do stereotaktycznego i przeszczepu do mózgu myszy, jak przejść obfity guz, myszy z mózgiem oraz jak izolować i przepływać cyto metrycznie, analizować glejaka naciekającego komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.