Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie unieśmiertelnionych, multipotencjalnych komórek progenitorowych uszu wewnętrznego w typy komórek ucha wewnętrznego. Ta metoda może nam pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regeneracji słuchu, takie jak to, w jaki sposób komórki progenitorowe mogą stać się komórkami rzęsatymi ślimaka lub neuronami słuchowymi. Co ważne, technika ta zapewnia system komórkowy in vitro, który może być stosowany równolegle z systemami modelowymi ssaków in vivo.

Dzisiejszą procedurę zademonstrują Azadeh Jadali, adiunkt w moim laboratorium, a także Zhichao Song i Alejandra Laureano, dwie doktorantki w laboratorium. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj trzech mililitrów tego płynu, aby pokryć jeden razy dziesięć do szóstego unieśmiertelnionego multipotencjalnego progenitora lub komórek IMOP w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Inkubuj komórki przez pięć do siedmiu dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla.

Co drugi dzień podwójaj objętość płynu w kulturze, dodając świeżą pożywkę. Aby przejść komórki, najpierw przenieś je z naczynia hodowlanego do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. A następnie umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć do dziesięciu minut.

W tym czasie spodziewaj się, że otosfery tworzące kolonie zgromadzą się na dnie stożka poprzez sedymentację grawitacyjną. Następnie odessaj supernatant, uważając, aby nie naruszyć palety. Ponownie zawiesić otosfery, dodając 0,5 mililitra wcześniej przygotowanego, wstępnie podgrzanego, jednomilimolowego zbilansowanego roztworu soli wzmocnionego EDTA lub HBSS, a następnie pipetując w górę iw dół dwa do trzech razy.

Aby ułatwić dysocjację otosfer na pojedyncze komórki, umieść stożek w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Okresowo obracaj roztwór, a gdy nie zaobserwujesz otosfer jako osadu na dnie probówki, przenieś go do temperatury pokojowej. Kontynuuj dodawanie dwóch mililitrów pożywki hodowlanej do komórek, aby zneutralizować EDTA.

I odwiruj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut w temperaturze 200 g. Następnie odessać rozcieńczony roztwór EDTA i umyć komórki w pięciu mililitrach 1x PBS. Po rozkręceniu komórek przy użyciu tych samych ustawień, zassaj 1x PBS.

Następnie dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej do stożka. I ponownie zawieś paletę komórek. Do liczenia rozcieńczyć komórki IMOP od jednego do stu w pożywce hodowlanej.

Następnie dodaj 75 mikrolitrów tego roztworu do kasety umieszczonej w mikroprzepływowym liczniku cząstek i określ liczbę komórek. Następnie umieść jedną komórkę IMOP razy dziesięć do szóstej w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, jak opisano wcześniej, i powtarzaj tę procedurę pasażowania co pięć do siedmiu dni. Trzy dni po posiewie użyj sedymentacji grawitacyjnej, aby zebrać otosfery, jak pokazano wcześniej.

Przystąp do odsysania supernatantu. I delikatnie ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego. Następnie użyj dziesięciomililitrowej pipety o dużych porach, aby przenieść otosfery do nowego naczynia o średnicy 60 milimetrów.

Różnicuj otosfery przez dziesięć dni. Dodawanie dwóch mililitrów świeżej pożywki różnicującej do kultury co drugi dzień. Następnie ponownie zbierz otosfery poprzez sedymentację grawitacyjną.

I odessać zużyte podłoże. Następnie utrwal otosfery w czteroprocentowym paraformaldehydzie w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń roztwór formaldehydu i umyj komórki w 1x PBS zawierającym 0,1 procent Triton x100.

Kontynuuj, blokując otosfery w 1x PBS uzupełnionym dziesięcioprocentową surowicą kozią i 0,1% Tritonem x100. Po upływie jednej godziny zastąpić bufor blokujący buforem zawierającym odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała Cdkn1b lub CDH1. Następnie inkubuj komórki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

A następnego dnia kontynuuj barwienie immunologiczne przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych, falloidyny i Hoechsta, jak opisano w innym miejscu. Aby przygotować się do obrazowania, umieść podłoże montażowe na szklanym szkiełku. A następnie wprowadź poplamione otosfery do podłoża.

Następnie połóż szkiełko nakrywkowe na próbce. Po pozostawieniu podłoża montażowego do wyschnięcia przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w 16-bitową kamerę CCD. Korzystając z obiektywu powietrznego 20x 0,75, uzyskaj obrazy epifluorescencji, zbierając dane z kanałów niebieskiego, zielonego, czerwonego i podczerwieni.

Najpierw wyczyść okrągłe szkiełka nakrywkowe, umieszczając je w sterylnej 100-milimetrowej płytce i zanurzając w 70-procentowym etanolu. Delikatnie porusz szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że są przykryte i pozostaw naczynie w temperaturze pokojowej na dziesięć minut. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy w sterylnym 1x PBS, a następnie raz sterylną wodą.

Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia, wystawiając je na działanie światła UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. W celu natychmiastowego użycia umieścić jedno sterylne szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 24-dołkowej. I delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe leżą płasko.

Następnie pokryj szkiełka nakrywkowe, dodając 0,25 mililitra 1x PBS zawierającego 10 mikrogamów na mililitr poli D lizyny do każdej studzienki. Po inkubacji płytki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, usuń roztwór poli D lizyny i umyj studzienki trzy razy sterylnym 1x PBS. Po zassaniu płynu z ostatniego płukania wprowadź 0,25 mililitra 1x PBS zawierającego 10 mikrogramów na mililitr Lamininy do każdej z 24 studzienek.

Po inkubacji płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odessać roztwór Laminin, a następnie umyć każdą studzienkę jednym mililitrem 1x PBS trzy razy, ale pozostawić PBS z ostatniego płukania w studzienkach, aż komórki będą gotowe do poszczepienia. Aby rozpocząć różnicowanie neuronów, policz komórki ze zdysocjowanych otosfer, jak opisano wcześniej. A następnie ponownie zawiesić je we wstępnie rozgrzanym pożywce różnicowania neuronów.

Kontynuuj wysiewając od jednego do jednego punktu, pięć razy dziesięć do piątej komórki IMOP do każdego dołka płytki zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z pięcioprocentową zawartością dwutlenku węgla. Wymiana pożywki różnicowania neuronalnego co drugi dzień.

Po siedmiu dniach odessać pożywkę i przymocować komórki, które powinny być przymocowane do szkiełek nakrywkowych, dodając cztery procent formaldehydu do każdej studzienki. I pozostawić je na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń formaldehyd i umyj komórki raz w 1x PBS zawierającym 0,1 procent Triton x100.

Następnie wyjmij bufor do mycia. I dodaj bufor blokujący składający się z 1x PBS zawierającego dziesięć procent normalnej koziej surowicy i 0,1 procent Triton x100 do każdej studzienki. Pozostaw komórki na godzinę w temperaturze pokojowej.

A następnie usunąć płyn i zastąpić go buforem blokującym zawierającym odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała Cdkn1b lub Tubb3. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przemyj komórki raz 1x PBS zawierającym jeden procent Triton x100. A następnie przystąp do barwienia immunologicznego, jak opisano wcześniej.

Po zakończeniu barwienia wykonaj końcowe mycie, dodając 1x PBS do studzienek. Aby przygotować je do analizy, należy usunąć szkiełka nakrywkowe, do których przymocowane są barwione komórki, z płytki 24-dołkowej. I umieść je na podłożu montażowym na szklanym szkiełku.

Po pozostawieniu podłoża montażowego do wyschnięcia przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uzyskaj obrazy epifluorescencji, jak opisano wcześniej. Otosfery hodowane przez dziesięć dni w pożywce różnicującej nabłonek wykazują zwiększoną ekspresję Cdkn1b, inhibitora kinazy zależnej od cyklu i markera różnicowania ucha wewnętrznego, w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi. W tym przypadku barwienie Hoechsta wykazało jądra komórkowe.

Komórki te wykazują również zmiany morfologiczne we włóknach aktynowych i regionach adhezji komórka-komórka charakterystycznych dla nabłonka. Wskazuje na to pojawienie się falloidyny i znakowania Cdh1 na obrzeżach komórki. Otosfery mogą być również kierowane do tworzenia neuronów.

Ten jasny obraz pola pokazuje, że po siedmiu dniach w pożywce różnicowania neuronów, komórki IMOP wykazują neuryty. Barwienie immunologiczne tych komórek markerem neuronalnym Tubb3 potwierdza ich różnicowanie. A także solidnie wyrażają Cdkn1b.

Sugeruje to, że podwójny sygnał Tubb3, Cdkn1b może być używany jako wskaźnik różnicowania neuronów w komórkach IMOP. Komórki zróżnicowane i niezróżnicowane fluorescencyjną Cdkn1b zostały również znormalizowane poprzez określenie jego stosunku do sygnału Hoechsta, dostarczając wyników ilościowych. Histogramy tych danych są pokazane tutaj.

Na tych wykresach przedstawiono procenty niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek IMOP powyżej z góry określonego progu znormalizowanego Cdkn1b. Obie zróżnicowane populacje wykazują znaczny wzrost odsetka komórek wykazujących ekspresję Cdkn1b w porównaniu z niezróżnicowanymi kontrolami, co potwierdza różnicowanie sugerowane przez immunofluorescencję. Po opanowaniu, rutynową hodowlę i różnicowanie komórek IMOP można przeprowadzić w ciągu 30 minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainicjować różnicowanie komórek IMOP. Dziękuję za obejrzenie tego filmu. I powodzenia w eksperymentach.