Name: Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj techniki znakowania białkowego stawonogów i wykrywania śladów metodą ELISA w badaniach dyspersji. Metoda ta umożliwia śledzenie migracji owadów i inwazyjnych gatunków w naturalnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez USDA CRIS 5347-22620-021-00D oraz, częściowo, przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Competitive Grant nr 2011-67009-30141 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne Johanny Nassif. Dziękujemy również Paulowi Bakerowi, Davidowi Hortonowi, Diego Nieto i Frances Sivakoff za udostępnienie niektórych zdjęć użytych na rysunku 3.

1. Procedura znakowania wewnętrznego, retencji i detekcji
<ol>
	<li>Procedura znakowania wewnętrznego
	<ol>
		<li>Zebrać interesujące owady (n ≈ 100 osobników) z kolonii laboratoryjnej hodowanej na pożywce sztucznej lub z terenu i podzielić je na dwa czyste pojemniki hodowlane.</li>
		<li>Do jednego z pojemników włożyć standardową porcję pożywki 20 ml (nieznakowana kontrola negatywna). Drugą porcję pożywki sztucznej 20 ml uzupełnić 1,0 ml roztworu IgG/IgY z kurczaka o stężeniu 1,0 mg/ml, dokładnie wymieszać i umieścić w drugim pojemniku. 
		Uwaga: Jeśli dla badanego owada nie ma dostępnej pożywki sztucznej, znacznik można umieścić na dowolnej pożywce, na której owady te są zazwyczaj utrzymywane (np. fasola szparagowa, jaja ciem, woda, cukier, miód).</li>
		<li>Pozostawić owady do wznowienia żerowania na 24 hr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura sprawdzania retencji znacznika wewnętrznego
	<ol>
		<li>Usunąć porcje pożywki z każdego pojemnika i dostarczyć owadom inne źródło pokarmu w celu ich utrzymania przez czas trwania eksperymentu (np. fasolę szparagową).</li>
		<li>Codziennie (lub w dowolnym wybranym odstępie czasu) pobierać kohortę (n = 20) owadów z każdej grupy badawczej i natychmiast zamrażać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura testu Sandwich ELISA
	<ol>
		<li>Do każdego dołka czystej mikropłytki ELISA dodać 50 µl króliczego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko kurczemu IgY, rozcieńczonego 1:500 w buforze TBS (Tris buffered saline), i inkubować przez co najmniej 1 hr w temperaturze pokojowej (RT) (uwaga: mikropłytki można inkubować również przez noc O/N w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Odlać przeciwciała z płytki i zablokować każdy dołek 300 µl 1,0% roztworu odtłuszczonego mleka w proszku przez 30 min.</li>
		<li>W oczekiwaniu na zakończenie poprzednich etapów inkubacji, umieścić zamrożone owady pojedynczo w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml z 1,0 ml buforu TBS.</li>
		<li>Rozetrzeć każdego owada czystym tłuczkiem do pełnej homogenizacji i dodać 100 µl każdej próbki do oddzielnego dołka płytki ELISA. Inkubować próbki w RT przez 1 hr.</li>
		<li>Do dołków w pierwszej kolumnie każdej płytki ELISA dodać 100 µl kontroli negatywnej (sam TBS) i pozytywnej (białka jaj w TBS). Dodać również 100 µl kontroli negatywnych z owadów (owady nieznakowane) do 8 dołków w ostatniej kolumnie każdej płytki (Figure 1). Inkubować próbki kontrolne w RT przez 1 hr. Należy pamiętać, że schemat przedstawiony na Figure 1 jest szablonem stosowanym w naszych ustandaryzowanych testach. Rozmieszczenie próbek w dołkach pozostaje do uznania badacza.</li>
		<li>Przemyć każdy dołek trzy razy roztworem PBS-tween (phosphate buffered saline-tween), a następnie dodać 50 µl króliczych przeciwciał przeciwko kurczemu IgG/IgY sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych 1:10 000 w 1% roztworze mleka, i inkubować przez 1 hr w RT.</li>
		<li>Przemyć każdy dołek trzy razy roztworem PBS-tween i dodać 50 µl substratu TMB (tetrametylobenzydyn) do każdego dołka.</li>
		<li>Po 10 min odczytać wartości z dołków za pomocą spektrofotometru do mikropłytek ustawionego na długość fali 650 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ mikropłytki dla testu ELISA; próbki, kontrole; analiza danych, ocena wyników immunoanalizy." src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat obrazujący zestandaryzowane oznaczenia dołków stosowane w typowej mikropłytce ELISA z 96 dołkami. Każda płytka zawiera 7 dołków przeznaczonych na kontrole negatywne w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), jeden dołek przeznaczony na pozytywną kontrolę białkową (Pos Ctrl), 80 oddzielnych dołków przeznaczonych na odłowione owady (Sample 1…80) oraz 8 dołków przeznaczonych na nieoznaczone (negatywne) kontrole owadów (Neg Ctrl 1…8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Procedura znakowania zewnętrznego, odłowu i detekcji
<ol>
	<li>Procedura znakowania zewnętrznego
	<ol>
		<li>Zebrać interesujące owady (n ≈ 100 osobników) z kolonii laboratoryjnej lub z terenu i umieścić w dwóch plastikowych pojemnikach o pojemności 1,0 L z otworem o średnicy 2,5 cm wykonanym w bocznej ściance każdego pojemnika.</li>
		<li>Owady w pierwszym pojemniku spryskać 1,0 ml dH2O (próba kontrolna ujemna) za pomocą nebulizatora medycznego. Owady w drugim pojemniku spryskać 1,0 ml 5,0% roztworu białek jaja kurzego za pomocą nebulizatora medycznego.</li>
		<li>Podłączyć wąż nebulizatora do standardowego laboratoryjnego wylotu powietrza, a następnie włożyć wylot nebulizatora do otworu o średnicy 2,5 cm w pojemniku. Następnie stopniowo otwierać dopływ powietrza, aż nebulizator zacznie wytwarzać mgiełkę.</li>
		<li>Kontynuować rozpylanie (znakowanie), aż roztwór białek jaj zostanie całkowicie zużyty (ok. 2-5 min).</li>
		<li>Usunąć nebulizator i zatkać otwór w plastikowym pojemniku korkiem. Pozostawić owady w RT, aż roztwór całkowicie wyschnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura badania trwałości znaku zewnętrznego
	<ol>
		<li>Każdą grupę wysuszonych owadów przenieść do osobnego, czystego pojemnika hodowlanego, aby uniknąć dalszej ekspozycji na znacznik.</li>
		<li>Do czystych pojemników dodać pokarm i wodę, aby utrzymać owady przy życiu przez cały czas trwania badania.</li>
		<li>Codziennie pobierać kohortę (n = 20) owadów z każdej grupy i natychmiast zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura pośredniego testu ELISA
	<ol>
		<li>Zamrożone owady umieścić pojedynczo w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml i dodać 1,0 ml TBS.</li>
		<li>Inkubować próbki przez 1 h na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 120 rpm.</li>
		<li>Dodać kontrole ujemne i dodatnie zgodnie z opisem w kroku 1.3.5.</li>
		<li>Po inkubacji nanieść pipetą alikwot 100 µl z każdej próbki do jednego z 80 wyznaczonych do próbek dołków na nowej płytce ELISA z 96 dołkami, jak pokazano na Ryc. 1. Inkubować próbki przez 1 h w RT (uwaga: mikropłytki można również inkubować O/N w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Przemyć dołki trzykrotnie roztworem PBS-tween, a następnie dodać do każdego dołka 300 µl fosforanu buforu soli z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (PBS-BSA).</li>
		<li>Po 30 min w RT przemyć dwukrotnie roztworem PBS-tween.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 50 µl przeciwciał pierwszorzędowych królika przeciwko albuminie jaja, rozcieńczonych 1:8 000 w PBS-BSA-Silwet (0,05%), i inkubować przez 1 h w RT.</li>
		<li>Przemyć każdy dołek trzykrotnie roztworem PBS-tween, a następnie dodać 50 µl przeciwciał kozich przeciwko IgG królika sprzężonych z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonych 1:2 000 w PBS-BSA-Silwet (0,05%), i inkubować przez 1 h w RT.</li>
		<li>Przemyć każdy dołek trzykrotnie roztworem PBS-tween i dodać do każdego dołka 50 µl substratu TMB.</li>
		<li>Po 10 min odczytać wartości w dołkach za pomocą spektrofotometru do mikropłytek ustawionego na długość fali 650 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz średnią wartość absorbancji dla 8 owadów z kontroli negatywnej na każdej płytce ELISA, a następnie oblicz odchylenie standardowe na podstawie połączonych kontrol negatywnych ze wszystkich płytek ELISA w danym badaniu12.</li>
	<li>Do średniej uzyskanej dla każdej płytki ELISA dodaj sześciokrotność połączonego odchylenia standardowego, aby wyznaczyć wartość progu dodatniego testu ELISA. Każda próbka owada, dla której wartość absorbancji jest równa lub wyższa od tej wartości, zostaje uznana za dodatnią pod kątem obecności markera białkowego.</li>
</ol>

Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Procedura immunoznakowania białek stawonogów została opisana po raz pierwszy prawie ćwierć wieku temu9. Od tego czasu procedura ta została dostosowana do badania wzorców dyspersji szerokiej gamy stawonogów przy użyciu IgG/IgY podawanych zarówno wewnętrznie, jak i zewnętrznie. Białka te okazały się niezawodnymi markerami dla wielu badanych dotychczas gatunków owadów. Jednakże, jak wspomniano powyżej, głównym ograniczeniem w stosowaniu IgG/IgY jest ich wysoka cena. W konsekwencji IgG/IgY są użyteczne jedynie w b...

Śledzenie ruchu szkodników stawonogów, naturalnych wrogów (parazytoidów i drapieżników) oraz zapylaczy w naturze jest niezbędne do lepszego zrozumienia, jak poprawić usługi ekosystemowe. Kluczowym elementem większości rodzajów badań nad dyspersją jest posiadanie niezawodnej metody znakowania stawonogów będących przedmiotem zainteresowania. Do oznaczania stawonogów użyto różnych materiałów (np. farb, barwników, kolorowych pyłów, znaczników, rzadkich pierwiastków, białek) w celu oceny dynamiki ich populacji, zdolności dyspersyjnych, zachowań żywieniowych i innych interakcji ekologicznych1,2.
Stosowność markera użytego do danego badania rozproszenia będzie zależała od rodzaju prowadzonego badania. Istnieją trzy szerokie kategoryzacje oznaczania stawonogów: (1) znakowanie-uwalnianie-ponowne przechwytywanie (MRR), (2) znakowanie-przechwytywanie i (3) samodzielne przechwytywanie znaków. W przypadku badań typu mark-release-recapture, badacz zazwyczaj oznacza stawonogi zbiorczo w laboratorium i wypuszcza je w centralnym punkcie pola. Stawonogi są następnie ponownie chwytane w różnych odstępach przestrzennych i czasowych za pomocą różnych urządzeń do zbierania (np. siatki do zamiatania, odkurzacza, pułapki lepkiej)3,4,5. Ponownie schwytane okazy są następnie badane pod kątem specyficznego znaku, aby odróżnić wypuszczone od rodzimych osobników. W przypadku badań nad wychwytywaniem znaczników badacz zwykle nanosi znak bezpośrednio w terenie za pomocą sprzętu do opryskiwania (np. opryskiwacza plecakowego, opryskiwacza polowego i dyszowego). Najlepsze markery do badań nad wychwytywaniem znaków są niedrogie i łatwe do zastosowania w siedlisku stawonoga. W przypadku badań nad samodzielnym schwytaniem znaków, badacz zwykle umieszcza znaki na przynęcie stawonogów6,7 lub wejściu do gniazda8. Z kolei stawonóg zaznacza się wewnętrznie, pożerając oznaczoną przynętę lub zewnętrznie, "ocierając się" o znak, gdy wychodzi z gniazda.
Jak wspomniano powyżej, wiele rodzajów znaczników zostało użytych do oznaczania różnych gatunków stawonogówów. Jednak bardzo niewiele z nich jest użytecznych dla wszystkich trzech kategorii badań nad rozproszeniem. Opracowanie procedury znakowania immunologicznego białek było dużym przełomem w znakowaniu owadów. Znakowanie immunologiczne umieszcza etykietę białkową na stawonogach wewnętrznie lub zewnętrznie, która z kolei jest wykrywana przez test immunoenzymatyczny swoisty dla przeciwciał (ELISA). Pierwszymi tego typu markerami białkowymi były immunoglobulina królika (IgG) i IgG/IgY kurczaka9,10. Okazały się one bardzo skutecznymi znakami do badań MRR i self-marker-capture (patrz dyskusja). Niestety, białka IgG/IgY są kosztowne i dlatego nie są praktyczne w badaniach nad wychwytywaniem znaczników i większości rodzajów badań nad samowychwytywaniem znaczników. Następnie opracowano testy ELISA drugiej generacji do wykrywania białek dla białek zawartych w białkach jaj kurzych (albumina), mleku krowim (kazeina) i mleku sojowym (białko inhibitora trypsyny). Każdy test jest bardzo czuły, specyficzny i, co najważniejsze, wykorzystuje białka, które są znacznie tańsze niż białka IgG/IgY11. Białka te okazały się skuteczne w badaniach MRR, wychwytywania znaczników i samowychwytywania znaczników (patrz dyskusja).
W tym artykule opisujemy i pokazujemy, jak przeprowadzić badania laboratoryjne nad retencją śladów białkowych. Takie badania są pierwszą fazą badań potrzebnych do każdego rodzaju badań dyspersji w terenie. W szczególności bardzo ważne jest, aby badacze wiedzieli, jak długo ślad zostanie zachowany na docelowych gatunkach stawonogów przed rozpoczęciem badań terenowych. W tym miejscu opisujemy i pokazujemy, jak wewnętrznie i zewnętrznie znakować owady do badań terenowych MRR, mark-capture i self-mark-capture. Następnie pokazujemy, jak wykrywać obecność znaków za pomocą pośrednich i warstwowych testów ELISA.

<table><tbody><tr><td>Pojemnik do przechowywania żywności (do hodowli owadów)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Różne rozmiary</td><td>Różni producenci i sprzedawcy. Tkanina siatkowa jest przyklejona w oknie</td></tr><tr><td>Nebulizator o małej objętości (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Dostępny online oraz w sklepach z artykułami medycznymi. Inne marki też się sprawdzą.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,6 ml z nakrętką</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Każdy podobny typ będzie działał. Preferujemy marki, które mają łatwe do otwarcia pokrywy.</td></tr><tr><td>Styropianowy pojemnik na probówki do mikrowirówek (siatka 5x20)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Ten projekt jest fajny, ponieważ nie zapycha rur.</td></tr><tr><td>Dozownik, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Coś podobnego pomoże przyspieszyć dozowanie.</td></tr><tr><td>Tłuczki, plastikowe jednorazowe młynki do chusteczek, 1,5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Dostępne u różnych dostawców. Tłuczki można czyścić i sterylizować w autoklawie w celu ponownego użycia.</td></tr><tr><td>Płytki BD Falcon ELISA, 96-dołkowe (płaskie dno)</td><td>Pipeta BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, ręczna (20-200 &mikro; l)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 lub 1070-0200</td><td>Każdy podobny typ będzie działał. Ten model jest ergonomiczny.</td></tr><tr><td>Zbiorniki, sterylny odczynnik</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Wszystko podobne zadziała.</td></tr><tr><td>Pipeta elektroniczna, 8-kanałowa (50-1 200 &mikro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Gdybyś miał wybrać jeden model elektroniczny, ten rozmiar jest najbardziej przydatny.</td></tr><tr><td>Pipeta elektroniczna, 8-kanałowa (10-300 i mikro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Wszystko podobne zadziała.</td></tr><tr><td>Wielodołkowa podkładka płytkowa (8-pozycyjna, prosta)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>Wszystko podobne będzie działać w przypadku ręcznego mycia płyt.</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek z detekcją absorbancji</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax 250</td><td>Wszystko podobne będzie działać.</td></tr><tr><td>Kurczak IgG/IgY</td><td>Stany Zjednoczone Biologiczny</td><td>I1903-15R</td><td>Dostępne również z innych źródeł</td></tr><tr><td>Białka jaj</td><td>Sklep spożywczy</td><td>" Wszyscy biali", " Trzepaczki do jajek", etc.</td><td>Wymieszaj 5 ml z 95 ml dH2O, aby uzyskać 5% roztwór</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2,42 g/L, aby uzyskać TBS</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29,22 g/L, aby uzyskać TBS i 8,0&nbsp; g&#8288;/&#8288; L dla PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1,14 g/L dla PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0,2 g/L dla PBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0,2 g/L dla PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, Klasa EIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Dodać 0,5 ml na L do PBS po rozpuszczeniu soli.</td></tr><tr><td>PBS z 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 opakowanie w 1 L dH2O</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-kurze IgY (IgG) (cała cząsteczka) wytwarzane u królika (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro; l w 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Mleko w proszku, mleko w proszku lub świeże (1%)</td><td>Sklep</td><td></td> spożywczy <td>Wymieszaj 10 g z 1 l dH2O, aby uzyskać 1% roztwór</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IgY (IgG) (cała cząsteczka)-peroksydaza kurczaka wytwarzane u królika (1:10 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &micro; l w 1 l 1% mleka</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-albuminowe jaja kurzego wytwarzane u królika (1:8 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Rozcieńczony 125 &mikro; l w 1 l PBS-BSA</td></tr><tr><td>Kozia koniugatat anty-króliczej peroksydazy IgG (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Rozcieńczyć 0,5 ml w 1 l PBS-BSA, następnie dodać 1,3&nbsp; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) kopolimer krzemowo-polieterowy</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Dodaj jako ostatni składnik</td></tr><tr><td>TMB Microwell Jednoskładnikowy substrat peroksydazy</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitorowanie ruchu stawonogów jest często wymagane dla lepszego zrozumienia powiązanej dynamiki populacji, wzorców rozprzestrzeniania się, preferencji roślin żywicielskich i innych interakcji ekologicznych. Stawonogi są zwykle śledzone w naturze poprzez oznaczanie ich unikalnym znakiem, a następnie ponowne zbieranie ich w czasie i przestrzeni, aby określić ich zdolności do rozprzestrzeniania się. Oprócz rzeczywistych znaczników fizycznych, takich jak kolorowy kurz lub farba, różne rodzaje białek okazały się bardzo skuteczne w oznaczaniu stawonogów do badań ekologicznych. Białka mogą być podawane wewnętrznie i/lub zewnętrznie. Białka można następnie wykryć na ponownie schwytanych stawonogach za pomocą specyficznego dla białka testu immunoenzymatycznego (ELISA). Tutaj opisujemy protokoły zewnętrznego i wewnętrznego znakowania stawonogów białkiem. Przedstawiono dwa proste przykłady eksperymentalne: (1) wewnętrzny znacznik białkowy wprowadzony do owada poprzez zapewnienie diety wzbogaconej w białko oraz (2) zewnętrzny znacznik białkowy nałożony miejscowo na owada za pomocą nebulizatora medycznego. Następnie przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący metod kanapkowych i pośrednich ELISA stosowanych do wykrywania śladów białkowych na owadach. W tej demonstracji omówiono różne aspekty pozyskiwania i wykrywania markerów białkowych na stawonogach w celu wychwytywania znaczników, uwalniania, wychwytywania znaczników i samowychwytywania znaczników, a także różne sposoby, w jakie procedura znakowania immunologicznego została dostosowana do szerokiej gamy celów badawczych.

Markowanie wewnętrzne:
Wyniki testu retencji markerów wewnętrznych przedstawiono na Rysunku 2A. Obliczona krytyczna wartość progu dla testu ELISA wyniosła 0,054. Ogólnie (dla wszystkich czterech dat poboru prób łącznie), owady traktowane bez dodatku białka wykazywały konsekwentnie niskie wartości ELISA (x̄ = 0,038 ± 0,002, n = 80). Z kolei wszystkie owady karmione dietą wzbogaconą w bia...

Białka są często używane do oznaczania stawonogów do badań nad rozprzestrzenianiem się. Przedstawiono metody podawania wewnętrznych i zewnętrznych znaczników białkowych na stawonogach. Przedstawiono również techniki wykrywania znaczników białkowych, zarówno za pomocą pośrednich lub kanapkowych testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Ogólnym celem tej demonstracji jest opisanie sposobu oznaczania owadów białkiem do badań nad dyspersją lub migracją. Demonstracja ta obejmuje metody wykrywania znaczników za pomocą kanapki lub pośredniego testu immunoenzymatycznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rozprzestrzenianiem się owadów.Może być używany do badania wzorców migracji owadów, preferencji roślin żywicielskich owadów i rozprzestrzeniania się gatunków inwazyjnych. Zaletą tej techniki jest to, że metoda wykrywania jest prosta i niedroga. Nadaje się do dużej przepustowości, a zwierzęta można łatwo oznaczyć bezpośrednio w ich naturalnym środowisku.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności, ponieważ wydaje się ona trudniejsza niż jest w rzeczywistości, ponieważ większość badaczy terenowych nie ma doświadczenia z tą prostą techniką. Pierwszy pomysł na tę metodę pojawił się w 1989 roku. Hodowaliśmy drapieżniki owadów wielkookich na sztucznej diecie.Obawialiśmy się, że te robaki nie będą skutecznymi drapieżnikami na szkodnika Lygus po długim okresie chowu w niewoli na nienaturalnej diecie. Innymi słowy, zostałyby udomowione. Potrzebowaliśmy bezpiecznej, skutecznej i niedrogiej metody, aby odróżnić je po wypuszczeniu w teren od ich rodzimych odpowiedników.Żadna z obecnych metod znakowania nie spełnia tych kryteriów. Wcześniejsze doświadczenie, które zdobyłem przy użyciu procedury ELISA do przeprowadzania analiz zawartości jelit drapieżników pod kątem pozostałości białkowych specyficznych dla Lygus, podsunęło mi pomysł nałożenia obcego śladu białkowego na drapieżnika hodowanego w laboratorium. Z kolei w terenie zebranym u pluskwiaków wielkookich mogliśmy przeanalizować szczątki Lygusa oraz szczątki obcego białka.Na początek zbierz około 100 interesujących owadów z kolonii laboratoryjnej lub z pola i podziel je na dwa czyste pojemniki do hodowli. Załaduj jeden pojemnik zwykłym 20-mililitrowym pakietem dietetycznym, aby służył jako kontrola negatywna. Dla drugiego, zasznuruj opakowanie dietetyczne z miligramem IgG-IgY kurczaka.Dodaj jeden mililitr roztworu i dokładnie wymieszaj. W razie potrzeby użyj tego, czym owady są zwykle karmione zamiast opakowania. Po 24 godzinach od hodowli na tych pakietach dietetycznych, należy zaopatrzyć obie grupy owadów w normalny, nieoznakowany pokarm.W żądanych odstępach czasu zbierz 20 pojedynczych owadów z każdej kohorty. Zamroź je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż wszystkie wymagane kohorty zostaną zebrane do eksperymentu. Aby przygotować 96-dołkową płytkę do testu ELISA, do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała anty-kurzego IgY królika rozcieńczonego jeden na 500 w soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS.Pozostawić załadowaną płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Później opróżnij studzienki i dodaj 300 mikrolitrów roztworu blokowego do każdej studzienki. Jest to jednoprocentowy roztwór odtłuszczonego mleka w proszku.Pozostaw płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji blokowej przenieś pojedyncze zamrożone owady do mikroprobówek wirówkowych załadowanych jednym mililitrem TBS. Następnie dokładnie zhomogenizuj każdego owada czystym tłuczkiem.Gdy płytka jest gotowa, załaduj każdą studzienkę 100 mikrolitrami jednej homogenizowanej próbki owadów. Każda 96-dołkowa płytka mieści 80 próbek. Pozostaw pierwszą i ostatnią kolumnę tabliczki pustą dla elementów sterujących.W pierwszej kolumnie załaduj siedem 100 mikrolitrowych podwielokrotności samego TBS i załaduj jedną studzienkę 100 mikrolitrami TBS z pozytywną kontrolą białka jaja. W ostatniej kolumnie załaduj 100 mikrolitrów ośmiu pojedynczych nieoznakowanych preparatów na owady. Pozostawić próbki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.Po inkubacji ostrożnie umyj studzienki trzykrotnie buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Tween lub PBS-Tween. Dzięki naszemu doświadczeniu nauczyliśmy się, że większość błędów występuje na etapach prania. Rozpryskanie może prowadzić do częstego występowania fałszywych reakcji pozytywnych, więc bądź ostrożny.Po umyciu dodaj 50 mikrolitrów króliczej anty-kurczakowej IgG-IgY sprzężonej z peroksydazą chrzanową i rozcieńcz jeden do 10 000 w jednoprocentowym roztworze mleka. Pozostawić roztwór do inkubacji w studzienkach przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Później umyj płytkę trzykrotnie za pomocą PBS-Tween, tak jak poprzednio.Następnie załaduj studzienki 50 mikrolitrami podłoża TMB. Możesz od razu zacząć zauważać zmianę koloru. Pozostawić płytkę do inkubacji przez 10 minut przed odczytaniem jej za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.Odczytaj tabliczkę przy 650 nanometrach i zapisz wartości. Aby zewnętrznie oznaczyć owady, przygotuj litrowe plastikowe butelki z otworami dostępowymi i podziel 100 owadów na dwie butelki. Następnie spryskaj owady w jednym pojemniku jednym mililitrem wody destylowanej, która służy jako kontrola negatywna.Następnie podłącz nebulizator medyczny do wylotu powietrza i wyreguluj przepływ powietrza tak, aby nebulizator wytwarzał parę. Spryskaj inne owady jednym mililitrem pięcioprocentowego roztworu białka jaja kurzego. Proces opryskiwania powinien trwać od dwóch do pięciu minut.Następnie zakorkuj otwory i pozostaw roztwór do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu przenieś owady z powrotem do ich normalnych pojemników hodowlanych, zgodnie ze standardową dietą i utrzymuj je jak zwykle. Później zbieraj owady w określonych odstępach czasu w celu przetestowania.Aby sprawdzić retencję znaku zewnętrznego, należy zastosować procedurę identyczną z testem ELISA do badania retencji znaku wewnętrznego, z niewielkimi modyfikacjami. Po przeniesieniu owadów do mikroprobówek wirówkowych z TBS, pozwól im moczyć się na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min przez godzinę, zamiast je homogenizować. Po namoczeniu owadów należy odpipetować 100 mikrolitrów roztworu do dołków na płytkę i pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę.Po wypłukaniu próbek owadów dodaj 300 mikrolitrów PBS z jednym procentem BSA do każdej studzienki. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj studzienki dwukrotnie za pomocą PBS-Tween. Następnie do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko albuminie jaja królika, rozcieńczonego jeden na osiem tysięcy w sylwetce PBS-BSA.Inkubuj płytkę przez co najmniej godzinę i umyj studzienki jak poprzednio. Następnie do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową i rozcieńczonej jeden na dwa tysiące w sylwetce PBS-BSA. Pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie postępować zgodnie z wcześniej opisanym protokołem.Zachowanie znaku wewnętrznego zostało przetestowane w czterech punktach czasowych. Ogólnie rzecz biorąc, owady, którym podawano białko, dawały konsekwentnie niskie wartości ELISA. Natomiast wszystkie owady karmione dietą wzbogaconą w białko dawały niezmiennie wysokie wartości ELISA.Znaki zewnętrzne zostały również przetestowane w czterech punktach czasowych. Owady, które były miejscowo oznaczane białkami jaj, dawały niezmiennie silne wartości. Jak można było przewidzieć, w kontrolach ujemnych spryskiwanych wodą zarejestrowano bardzo niskie wartości ELISA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać owady i analizować je pod kątem obecności znaku. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w cztery godziny i 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. W ciągu jednego dnia można przetworzyć 16 płytek testowych zawierających ponad 1000 próbek.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że test jest niezwykle czuły. W związku z tym konieczne jest, aby wszystkie powierzchnie, pojemniki i sprzęt były wolne od zanieczyszczeń białkowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania lokalnych i obejmujących cały obszar wzorców rozprzestrzeniania się owadów w siedliskach rolniczych, miejskich, leśnych i innych siedliskach naturalnych.Zademonstrowaliśmy to na przykładzie na małą skalę, jednak technika ta została wykorzystana na znacznie większą skalę do oznaczania owadów bezpośrednio w ich naturalnym środowisku za pomocą komercyjnego sprzętu do opryskiwania. Byliśmy zdumieni kreatywnymi zastosowaniami naszych współpracowników.

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące selekcji klonalnych linii komórkowych oraz testu bioluminescencji wapniowej w celu analizy relacji struktura-aktywność syntetycznych neuropeptydów stawonogów względem ich pokrewnych receptorów GPCR. Test ten może być wykorzystany do deorfanizacji receptorów oraz badań relacji struktura-aktywność na potrzeby projektowania analogów syntetycznych oraz odkrywania peptydów i potencjalnych leków.

Analiza funkcjonalna receptorów sprzężonych z białkiem G u komarów (Aedes aegypti) i kleszczy (Rhipicephalus microplus) z wykorzystaniem testu bioluminescencji wapniowej

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

Opisujemy, jak określić ilościowo stawonogi żyjące w liściach, zamykając liście i końce gałęzi w torbie, przycinając i zamrażając materiał w worku, a następnie płucząc wcześniej zamrożony materiał w wodzie, aby oddzielić stawonogi od podłoża w celu ilościowego określenia.

Metoda ilościowego oznaczania stawonogów żyjących w liściach

Obecny protokół opisuje metodę zbierania wystarczającej ilości śliny od owadów wysysających za pomocą sztucznego podłoża. Jest to wygodna metoda zbierania śliny owadów i badania funkcji śliny pod kątem zachowań żywieniowych owadów i przenoszenia wirusa przenoszonego przez wektory.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj techniki znakowania białkowego stawonogów i wykrywania śladów metodą ELISA w badaniach dyspersji. Metoda ta umożliwia śledzenie migracji owadów i inwazyjnych gatunków w naturalnym środowisku.

Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

Przeglądaj więcej filmów