Podawanie i wykrywanie śladów białkowych na stawonogach w celu badań nad dyspersją

Ogólnym celem tej demonstracji jest opisanie sposobu oznaczania owadów białkiem do badań nad dyspersją lub migracją. Demonstracja ta obejmuje metody wykrywania znaczników za pomocą kanapki lub pośredniego testu immunoenzymatycznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rozprzestrzenianiem się owadów.

Może być używany do badania wzorców migracji owadów, preferencji roślin żywicielskich owadów i rozprzestrzeniania się gatunków inwazyjnych. Zaletą tej techniki jest to, że metoda wykrywania jest prosta i niedroga. Nadaje się do dużej przepustowości, a zwierzęta można łatwo oznaczyć bezpośrednio w ich naturalnym środowisku.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności, ponieważ wydaje się ona trudniejsza niż jest w rzeczywistości, ponieważ większość badaczy terenowych nie ma doświadczenia z tą prostą techniką. Pierwszy pomysł na tę metodę pojawił się w 1989 roku. Hodowaliśmy drapieżniki owadów wielkookich na sztucznej diecie.

Obawialiśmy się, że te robaki nie będą skutecznymi drapieżnikami na szkodnika Lygus po długim okresie chowu w niewoli na nienaturalnej diecie. Innymi słowy, zostałyby udomowione. Potrzebowaliśmy bezpiecznej, skutecznej i niedrogiej metody, aby odróżnić je po wypuszczeniu w teren od ich rodzimych odpowiedników.

Żadna z obecnych metod znakowania nie spełnia tych kryteriów. Wcześniejsze doświadczenie, które zdobyłem przy użyciu procedury ELISA do przeprowadzania analiz zawartości jelit drapieżników pod kątem pozostałości białkowych specyficznych dla Lygus, podsunęło mi pomysł nałożenia obcego śladu białkowego na drapieżnika hodowanego w laboratorium. Z kolei w terenie zebranym u pluskwiaków wielkookich mogliśmy przeanalizować szczątki Lygusa oraz szczątki obcego białka.

Na początek zbierz około 100 interesujących owadów z kolonii laboratoryjnej lub z pola i podziel je na dwa czyste pojemniki do hodowli. Załaduj jeden pojemnik zwykłym 20-mililitrowym pakietem dietetycznym, aby służył jako kontrola negatywna. Dla drugiego, zasznuruj opakowanie dietetyczne z miligramem IgG-IgY kurczaka.

Dodaj jeden mililitr roztworu i dokładnie wymieszaj. W razie potrzeby użyj tego, czym owady są zwykle karmione zamiast opakowania. Po 24 godzinach od hodowli na tych pakietach dietetycznych, należy zaopatrzyć obie grupy owadów w normalny, nieoznakowany pokarm.

W żądanych odstępach czasu zbierz 20 pojedynczych owadów z każdej kohorty. Zamroź je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż wszystkie wymagane kohorty zostaną zebrane do eksperymentu. Aby przygotować 96-dołkową płytkę do testu ELISA, do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała anty-kurzego IgY królika rozcieńczonego jeden na 500 w soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS.

Pozostawić załadowaną płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Później opróżnij studzienki i dodaj 300 mikrolitrów roztworu blokowego do każdej studzienki. Jest to jednoprocentowy roztwór odtłuszczonego mleka w proszku.

Pozostaw płytkę do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji blokowej przenieś pojedyncze zamrożone owady do mikroprobówek wirówkowych załadowanych jednym mililitrem TBS. Następnie dokładnie zhomogenizuj każdego owada czystym tłuczkiem.

Gdy płytka jest gotowa, załaduj każdą studzienkę 100 mikrolitrami jednej homogenizowanej próbki owadów. Każda 96-dołkowa płytka mieści 80 próbek. Pozostaw pierwszą i ostatnią kolumnę tabliczki pustą dla elementów sterujących.

W pierwszej kolumnie załaduj siedem 100 mikrolitrowych podwielokrotności samego TBS i załaduj jedną studzienkę 100 mikrolitrami TBS z pozytywną kontrolą białka jaja. W ostatniej kolumnie załaduj 100 mikrolitrów ośmiu pojedynczych nieoznakowanych preparatów na owady. Pozostawić próbki do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.

Po inkubacji ostrożnie umyj studzienki trzykrotnie buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Tween lub PBS-Tween. Dzięki naszemu doświadczeniu nauczyliśmy się, że większość błędów występuje na etapach prania. Rozpryskanie może prowadzić do częstego występowania fałszywych reakcji pozytywnych, więc bądź ostrożny.

Po umyciu dodaj 50 mikrolitrów króliczej anty-kurczakowej IgG-IgY sprzężonej z peroksydazą chrzanową i rozcieńcz jeden do 10 000 w jednoprocentowym roztworze mleka. Pozostawić roztwór do inkubacji w studzienkach przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Później umyj płytkę trzykrotnie za pomocą PBS-Tween, tak jak poprzednio.

Następnie załaduj studzienki 50 mikrolitrami podłoża TMB. Możesz od razu zacząć zauważać zmianę koloru. Pozostawić płytkę do inkubacji przez 10 minut przed odczytaniem jej za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.

Odczytaj tabliczkę przy 650 nanometrach i zapisz wartości. Aby zewnętrznie oznaczyć owady, przygotuj litrowe plastikowe butelki z otworami dostępowymi i podziel 100 owadów na dwie butelki. Następnie spryskaj owady w jednym pojemniku jednym mililitrem wody destylowanej, która służy jako kontrola negatywna.

Następnie podłącz nebulizator medyczny do wylotu powietrza i wyreguluj przepływ powietrza tak, aby nebulizator wytwarzał parę. Spryskaj inne owady jednym mililitrem pięcioprocentowego roztworu białka jaja kurzego. Proces opryskiwania powinien trwać od dwóch do pięciu minut.

Następnie zakorkuj otwory i pozostaw roztwór do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu przenieś owady z powrotem do ich normalnych pojemników hodowlanych, zgodnie ze standardową dietą i utrzymuj je jak zwykle. Później zbieraj owady w określonych odstępach czasu w celu przetestowania.

Aby sprawdzić retencję znaku zewnętrznego, należy zastosować procedurę identyczną z testem ELISA do badania retencji znaku wewnętrznego, z niewielkimi modyfikacjami. Po przeniesieniu owadów do mikroprobówek wirówkowych z TBS, pozwól im moczyć się na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min przez godzinę, zamiast je homogenizować. Po namoczeniu owadów należy odpipetować 100 mikrolitrów roztworu do dołków na płytkę i pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę.

Po wypłukaniu próbek owadów dodaj 300 mikrolitrów PBS z jednym procentem BSA do każdej studzienki. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj studzienki dwukrotnie za pomocą PBS-Tween. Następnie do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko albuminie jaja królika, rozcieńczonego jeden na osiem tysięcy w sylwetce PBS-BSA.

Inkubuj płytkę przez co najmniej godzinę i umyj studzienki jak poprzednio. Następnie do każdej studzienki dodaj 50 mikrolitrów koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową i rozcieńczonej jeden na dwa tysiące w sylwetce PBS-BSA. Pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie postępować zgodnie z wcześniej opisanym protokołem.

Zachowanie znaku wewnętrznego zostało przetestowane w czterech punktach czasowych. Ogólnie rzecz biorąc, owady, którym podawano białko, dawały konsekwentnie niskie wartości ELISA. Natomiast wszystkie owady karmione dietą wzbogaconą w białko dawały niezmiennie wysokie wartości ELISA.

Znaki zewnętrzne zostały również przetestowane w czterech punktach czasowych. Owady, które były miejscowo oznaczane białkami jaj, dawały niezmiennie silne wartości. Jak można było przewidzieć, w kontrolach ujemnych spryskiwanych wodą zarejestrowano bardzo niskie wartości ELISA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać owady i analizować je pod kątem obecności znaku. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w cztery godziny i 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. W ciągu jednego dnia można przetworzyć 16 płytek testowych zawierających ponad 1000 próbek.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że test jest niezwykle czuły. W związku z tym konieczne jest, aby wszystkie powierzchnie, pojemniki i sprzęt były wolne od zanieczyszczeń białkowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania lokalnych i obejmujących cały obszar wzorców rozprzestrzeniania się owadów w siedliskach rolniczych, miejskich, leśnych i innych siedliskach naturalnych.

Zademonstrowaliśmy to na przykładzie na małą skalę, jednak technika ta została wykorzystana na znacznie większą skalę do oznaczania owadów bezpośrednio w ich naturalnym środowisku za pomocą komercyjnego sprzętu do opryskiwania. Byliśmy zdumieni kreatywnymi zastosowaniami naszych współpracowników.