Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro

Ogólnym celem tej techniki jest przygotowanie wzbogaconych, specyficznych dla płci kultur astrocytów hipokampa z noworodków myszy, jako narzędzia do badania specyficznych dla płci ról astrocytów po deprywacji tlenu i glukozy oraz ponownym utlenowaniu, w celu odwzorowania in vivo niedokrwienia niedotlenieniowego w środowisku hodowli komórkowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania mechanistyczne i translacyjne dotyczące specyficznej dla płci roli astrocytów hipokampa po niedokrwieniu niedotlenieniowym w rozwijających się mózgach samców i samic. Wypreparuj mózg z głowy noworodka myszy, używając małych nożyczek do wykonania nacięcia skóry w linii środkowej od tyłu do przodu, aby odsłonić czaszkę.

Ostrożnie przetnij czaszkę w linii środkowej, od szyi do nosa. Za pomocą sterylnej pęsety płaskiej odchyl kości czaszki. Usuń pień mózgu przy użyciu pęsety zakrzywionej, a pozostałą część mózgu umieść w naczyniu do sekcji.

Używając zakrzywionej pęsety, odwróć mózg tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry, a następnie rozdziel półkule ostrym, sterylnym skalpelem chirurgicznym. Za pomocą płaskiej zakrzywionej pęsety odchyl półkule mózgu i ostrożnie usuń wystającą tkankę śródmózgowia i wzgórza, aby odsłonić hipokamp – niewielką strukturę w kształcie konika morskiego w przyśrodkowej części płata skroniowego. Usuń oba płaty hipokampa i ostrożnie oczyść powierzchnię płatów z opon mózgowych i fibroblastów, odciągając je precyzyjną pęsetą.

Przenieś oba płaty hipokampa od jednej myszy do drugiej szalki wypełnionej około 5 mililitrami HBSS i umieść na lodzie. Posiekaj płaty około 4 razy, używając ostrego, sterylnego skalpela chirurgicznego. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 mililitra przenieś HBSS wraz z tkanką do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie wiruj przy 300 ×g przez 5 minut.

Po wirowaniu odessać nadsącz. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny, wymieszać i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 20 minut przy delikatnym wstrząsaniu. Po inkubacji wirować probówkę z prędkością 300 ×g przez 5 minut.

Po wirowaniu za pomocą sterylnej pipety szklanej ostrożnie odessać nadsącz, a następnie dodać 10 ml uprzednio podgrzanego medium do wysiewu astrocytów. Przetrzeć zawiesinę 20–30 razy za pomocą wypalanej pipety szklanej. Po kolejnym 5-minutowym wirowaniu przy 300 ×g odessać nadsącz i dodać 2 ml medium do wysiewu astrocytów.

Przenieś zawiesinę komórkową przez filtr siatkowy o oczkach 70 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przenieś całą zawiesinę komórkową do powlekanej, sterylnej kolby hodowlanej T-25 zawierającej 3 ml pożywki do wysiewu astrocytów. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

Następnego dnia obserwować postęp konfluencji astrocytów pod mikroskopem świetlnym, odessać medium i zastąpić je 2 mililitrami świeżego medium do wysiewu astrocytów. Około 11 dnia in vitro zebrać konfluentne astrocyty poprzez odessanie medium, a następnie dodanie 2 mililitrów 0,25% trypsyny. Delikatnie obrócić kolbę kilka razy, a następnie odessać trypsynę za pomocą sterylnej pipety szklanej.

Dodaj kolejne 2 ml 0,25% trypsyny i pozostaw kolbę w temperaturze pokojowej na 4-5 minut. Po usunięciu trypsyny umieść kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 na 10 minut. Po inkubacji dodaj 5 ml pożywki do wysiewu astrocytów i oddziel warstwę astrocytarną, uderzając 3 do 4 razy w kolbę.

Delikatnie potraktuj zawiesinę komórkową poprzez pipetowanie wzdłuż dna kolby, aby uzyskać całkowite odłączenie komórek, a następnie zbierz astrocyty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirowarkuj probówkę przy 300 ×g przez 5 minut. Odessaj nadsącz, a następnie dodaj 1 ml świeżego medium do wysiewu astrocytów.

Nanieś 10 µL zawiesiny komórkowej do komory Bürкера (hemocytometru) i za pomocą odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego z obiektywem 10x policz komórki w dużym, centralnym obszarze z siatką. Rozcieńcz komórki do stężenia około 1 × 10⁵ komórek na 2 ml pożywki do wysiewu astrocytów. Pipetą nanieś 2 ml zawiesiny komórkowej na szklaną lamellkę pokrytą poli-D-lizyną, umieszczoną w dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej.

Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. Aby rozpocząć deprywację tlenu i glukozy, odessać medium z szkiełka podstawowego zawierającego przylegające astrocyty i przepłukać raz 1 ml izotonicznego roztworu OGD. Dodać 0,2 ml roztworu OGD do dołka i umieścić w inkubatorze hipoksycznym.

Mieszać delikatnie za pomocą inkubatora orbitalnego ustawionego na 50 rpm przez pierwsze 30 minut hipoksji. W celu reoxygenacji zastąpić roztwór OGD 2 mililitrami pożywki do wysiewu astrocytów i inkubować w 5% dwutlenku węgla i powietrzu atmosferycznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 godzin. Ten obraz immunofluorescencyjny przedstawia czystość pierwotnej hodowli astrocytów hipokampa myszy.

Kulturę astrocytów poddano immunobarwieniu, aby wykazać marker dendrytów neuronalnych MAP2 (kolor czerwony) oraz marker mikrogleju IBA1 (kolor zielony). Jądra komórkowe zostały zabarwione DAPI, który widoczny jest w kolorze niebieskim. Strzałka wskazuje zanieczyszczenie mikroglejem.

Ten reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny hodowli astrocytów hipokampa w warunkach normoksji wykazuje immunoreaktywność GFAP w kolorze czerwonym oraz znakowanie HIF1-alpha w kolorze zielonym. Jądra komórkowe zostały ponownie zabarwione DAPI, który widoczny jest w kolorze niebieskim. Strzałka wskazuje niską ekspresję HIF1-alpha.

Po 2 godzinach deprywacji tlenu i glukozy oraz 5 godzinach reoksygenacji, ekspresja HIF1-alpha wzrosła w hodowlach astrocytów hipokampa, co wskazuje grot strzałki oznaczający podwyższoną ekspresję jądrową HIF1-alpha. Ekspresja GFAP oraz ekspresja S100b uległy upregulacji w hodowlach astrocytów hipokampa pochodzących od samców myszy po deprywacji tlenu i glukozy oraz reoksygenacji. Upregulację S100b i GFAP zaobserwowano również w astrocytach uzyskanych od samic myszy.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowy PCR, western blotting, siRNA oraz barwienia immunohistochemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące zmian specyficznych dla płci w ekspresji określonych genów i białek po niedokrwieniu in vitro. Po dopracowaniu technika ta może otworzyć przed badaczami z dziedziny neuronauki drogę do zgłębiania efektów i następstw udaru w hipokampie poprzez badanie astrocytów w hodowli.