Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro
25 października 2016
Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu przedstawiamy praktyczną metodę protokołu hodowli astrocytów w hipokampie płciowym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw funkcji astrocytów u młodych noworodków płci męskiej i żeńskiej po niedokrwieniu in vitro.
Ogólnym celem tej techniki jest przygotowanie wzbogaconych, specyficznych dla płci kultur astrocytów hipokampa od nowonarodzonych myszy jako narzędzia do badania specyficznych dla płci ról astrocytów po deprywacji tlenu i glukozy oraz ponownym natlenieniu w celu naśladowania niedotlenienia in vivo w środowisku hodowli komórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania mechanistyczne i translacyjne dotyczące specyficznej dla płci roli astrocytów hipokampa po niedotlenieniu niedokrwienia w rozwoju męskich i żeńskich mózgów. Wypreparuj mózg z głowy nowonarodzonego szczeniaka myszy za pomocą małych nożyczek, aby utworzyć nacięcie od tyłu do przedniej linii środkowej przez skórę, aby odsłonić czaszkę.
Ostrożnie przetnij linię środkową czaszki od szyi do nosa. Użyj sterylnych kleszczyków z płaską końcówką, aby oderwać czaszkę. Usuń pień mózgu za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść pozostały mózg w naczyniu preparacyjnym
.Za pomocą zakrzywionych kleszczy odwróć mózg tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry, a następnie oddziel półkule ostrym, sterylnym ostrzem chirurgicznym. Za pomocą płaskich, zakrzywionych kleszczy oderwij półkule mózgowe i ostrożnie usuń wybrzuszone śródmózgowie i tkankę wzgórza, aby odsłonić hipokamp, małą strukturę w kształcie konika morskiego w przyśrodkowym płacie skroniowym. Usuń oba płaty hipokampa i ostrożnie oczyść opony mózgowe i fibroblasty z powierzchni płatów, ciągnąc drobnymi kleszkami.
Przenieś oba płaty hipokampa z jednej myszy do drugiego naczynia wypełnionego około 5 mililitrami HBSS i umieść na lodzie. Zmiel płaty około 4 razy za pomocą ostrego, sterylnego ostrza chirurgicznego. Użyj sterylnej pipety o pojemności 1 mililitra, aby przenieść HBSS i tkankę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie odwirować przy 300 razy G przez 5 minut.
Po odwirowaniu odessać supernatant. Dodaj 3 mililitry 0,25% trypsyny, wymieszaj i inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, delikatnie potrząsając. Po inkubacji odwirować probówkę o stężeniu 300 razy G przez 5 minut.
Po wirowaniu użyj sterylnej szklanej pipety, aby ostrożnie zassać supernatant, a następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża do posiewu astrocytów. Rozcierać od 20 do 30 razy za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Po kolejnym 5-minutowym odwirowaniu przy 300 razy G, odessać supernatant i dodać 2 mililitry pożywki do posiewu astrocytów.
Przełóż zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o wielkości 70 mikronów do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj całą zawiesinę komórkową do powlekanej sterylnej kolby hodowlanej T-25 zawierającej 3 mililitry pożywki do posiewu astrocytów. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Następnego dnia obserwuj postęp konfluencji astrocytów pod mikroskopem świetlnym, odessaj pożywkę i zastąp 2 mililitrami świeżej pożywki do posiewu astrocytów. Około 11 dni in vitro zbierz zbiegające się astrocyty, odsysając pożywkę, a następnie dodając 2 mililitry 0,25% trypsyny. Delikatnie obrócić kolbę kilka razy, a następnie odessać trypsynę za pomocą sterylnej szklanej pipety.
Dodaj kolejne 2 mililitry 0,25% trypsyny i pozostaw kolbę w temperaturze pokojowej na 4-5 minut. Po usunięciu trypsyny umieść kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 na 10 minut. Po inkubacji dodać 5 mililitrów pożywki do posiewu astrocytów i oderwać warstwę astrocytów, uderzając kolbą 3 do 4 razy.
Delikatnie rozetrzyj zawiesinę komórkową na dnie kolby, aby uzyskać całkowite oderwanie, a następnie zbierz astrocyty w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwirować probówkę o sile 300 razy G przez 5 minut. Odessać supernatant, a następnie dodać 1 mililitr świeżej pożywki do posiewu astrocytów.
Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemocytometru i użyj mikroskopu kontrastowego z odwróconą fazą z obiektywem 10x, aby policzyć komórki w dużym centralnym obszarze siatki. Rozcieńczyć komórki do około 1 razy 10 do 5 komórek na 2 mililitry pożywki do posiewu astrocytów. Odpipetować 2 mililitry zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe pokryte lizyną w studzience 24-dołkowej naczynia hodowlanego.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Aby rozpocząć deprywację tlenu i glukozy, należy odessać pożywkę ze szkiełka nakrywkowego zawierającego przylegające astrocyty i przepłukać raz 1 mililitrem izotonicznego roztworu OGD. Dodaj 0,2 mililitra roztworu OGD do studzienki i umieść w inkubatorze do niedotlenienia.
Delikatnie wymieszaj z wytrząsarką orbitalną ustawioną na 50 obr./min przez pierwsze 30 minut hipoksji. W celu ponownego natlenienia zastąp roztwór OGD 2 mililitrami pożywki do posiewu astrocytów i inkubuj w 5% dwutlenku węgla i powietrzu atmosferycznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 godzin. Ten obraz immunofluorescencyjny pokazuje czystość pierwotnej hodowli astrocytów hipokampa myszy.
Hodowla astrocytów została wybarwiona immunologicznie, aby pokazać marker dendrytu neuronalnego, MAP2, na czerwono, i marker mikrogleju, IBA1, na zielono. Jądra są barwione DAPI, które wydaje się niebieskie. Strzałka wskazuje zanieczyszczenie mikroglejem.
Ten reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny hodowanych astrocytów hipokampa w warunkach normoksyjnych pokazuje immunoreaktywność GFAP na czerwono i znakowanie HIF1-alfa na zielono. Ponownie, jądra są barwione DAPI, który wydaje się niebieski. Strzałka wskazuje niskie wyrażenie HIF1-alfa.
Po 2 godzinach pozbawienia tlenu i glukozy oraz 5 godzinach reoksygenacji, ekspresja HIF1-alfa została zwiększona w hodowanych astrocytach hipokampa, na co wskazuje grot strzałki wskazujący na podwyższoną ekspresję jądrową HIF1-alfa. Ekspresja GFAP i ekspresja S100b były regulowane w górę w kulturach astrocytów hipokampa od samców myszy po deprywacji tlenu i glukozy oraz rexoygenacji. Regulację w górę S100b i GFAP zaobserwowano również w astrocytach uzyskanych od samic myszy.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ilościowy PCR, western blot, siRNA i barwienia immunohistochemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzne dla płci zmiany w niektórych ekspresjach genów i białek po niedokrwieniu in vitro. Po jej opracowaniu, technika ta może utorować drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania skutków i konsekwencji udaru w hipokampie, badając astrocyty w kulturze.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji i hodowli specyficznych dla płci astrocytów hipokampa z noworodków myszy w celu zbadania ich reakcji na deprywację tlenu i glukozy (OGD) oraz reoksygenację, co stanowi model in vitro uszkodzenia mózgu w wyniku niedotlenienia i niedokrwienia (HI). Metoda ta umożliwia badanie zależnych od płci różnic w reaktywności astrocytów, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia komórkowych podstaw noworodkowego uszkodzenia mózgu typu HI oraz jego większej dotkliwości u samców.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Noworodkowe uszkodzenia mózgu
Wstęp
- Astroglioza po urazie mózgu związanym z niedotlenieniem i niedokrwieniem (HI) przyczynia się do zachorowalności i śmiertelności noworodków.
- Badania kliniczne wykazują, że noworodki płci męskiej są bardziej podatne na ciężkie skutki neurologiczne urazu HI niż noworodki płci żeńskiej.
- Zrozumienie różnic między płciami na poziomie komórkowym wymaga wiarygodnych metod izolacji populacji astrocytów z podziałem na płeć.
- Reaktywność astrocytów jest powszechnie oceniana za pomocą markerów takich jak GFAP i S100B.
Cel badania
- Opracowanie protokołu przygotowania wzbogaconych, specyficznych dla płci kultur astrocytów hipokampa z nowonarodzonych myszy.
- Modelowanie niedokrwienia in vitro przy użyciu OGD i reoksygenacji w tych kulturach.
- Badanie specyficznych dla płci odpowiedzi astrocytów na uszkodzenie typu HI.
Zastosowane metody
- Wypreparowanie hipokampów z mózgów noworodków myszy, z podziałem na płeć.
- Dysocjacja enzymatyczna i trituracja mechaniczna w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek.
- Kulturowanie astrocytów na szkiełkach podstawkowych pokrytych poli-D-lizyną oraz ich utrzymywanie w pożywce do wysiewu astrocytów.
- Indukcja OGD, a następnie reoksygenacja w celu symulacji urazu HI.
- Immunobarwienie markerów astrocytarnych (GFAP, S100B), neuronalnych (MAP2) i mikroglialnych (IBA1) oraz ekspresji HIF1-alpha.
Główne wyniki
- Pomyślnie utworzono wysoce wzbogacone, specyficzne dla płci kultury astrocytów hipokampa.
- Immunobarwienie potwierdziło czystość astrocytów i wykazało niewielkie zanieczyszczenie mikroglejem.
- OGD i reoksygenacja zwiększyły jądrową ekspresję HIF1-alpha w astrocytach.
- Zarówno w męskich, jak i żeńskich kulturach astrocytów zaobserwowano nadekspresję GFAP i S100B po OGD/reoksygenacji, przy czym odnotowano różnice specyficzne dla płci.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia badanie specyficznych dla płci odpowiedzi astrocytów na urazy typu HI in vitro.
- Stanowi on wartościowe narzędzie do badania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw różnic między płciami w neonatalnych urazach mózgu.
- Metoda ta pozwala na dalsze analizy molekularne, takie jak qPCR i western blotting, w celu zbadania zmian w ekspresji genów i białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niezawodna izolacja i charakterystyka astrocytów hipokampa specyficznych dla płci po niedokrwieniu in vitro pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu zależnych od płci mechanizmów leżących u podłoża noworodkowego urazu mózgu w wyniku niedotlenienia i niedokrwienia. Możliwość ta umożliwia weryfikację mechanizmów oraz zwiększenie pewności prognostycznej w ramach wczesnych programów badawczych ukierunkowanych na neuroprotekcję zapośredniczoną przez astrocyty. Metoda ta wspiera ciągłość translacyjną, zapewniając platformę do ilościowej oceny różnic między płciami w odpowiedziach komórkowych na niedokrwienny uraz.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie zależnej od płci reaktywności astrocytów na uraz niedokrwienny na poziomie komórkowym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie wkładu astrocytów w specyficzną dla płci neuropatologię.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów dla interwencji modulujących astrocyty w przypadku noworodkowego uszkodzenia mózgu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, specyficzne dla płci kultury astrocytów do dalszych analiz molekularnych i farmakologicznych.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację markerów astrocytów (GFAP, S100B) po urazie w celu standaryzacji analizy.
- Wspiera screening związków kandydujących pod kątem różnic w odpowiedzi astrocytów samców i samic.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki uzyskane in vitro z obserwacjami klinicznymi dotyczącymi zależnego od płci stopnia nasilenia noworodkowego uszkodzenia mózgu.
- Umożliwia dostosowanie strategii neuroprotekcyjnych do poziomu ryzyka w oparciu o profile skuteczności specyficzne dla płci.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów dla badań translacyjnych w przedklinicznych modelach niedotleniająco-ischemicznego uszkodzenia mózgu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejsza metoda wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, walidację celów oraz ilościową ocenę odpowiedzi astrocytów zależnej od płci na niedokrwienie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad ścieżkami uszkodzeń pośredniczonymi przez astrocyty oraz różnicami między płciami.
- Przesiewanie: Zapewnia platformę do powtarzalnych, ilościowych odczytów markerów aktywacji astrocytów.
- Analityka: Umożliwia pomiar ekspresji GFAP, S100B oraz HIF1-alpha w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników in vitro do klinicznych wyników zależnych od płci.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje powtarzalny schemat postępowania dla różnorodnych badań molekularnych i farmakologicznych w neurobiologii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad neuroprotekcją specyficzną dla płci.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację astrocytów i modelowanie uszkodzeń w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w przypadku strategii neuroprotekcyjnych ukierunkowanych na płeć oraz priorytetyzacji portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój zasobów adresujących zależne od płci wyniki neurologiczne.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji mózgu noworodka oraz technik pierwotnych kultur komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury do modelowania hipoksji i immunobarwienia.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów izolacji komórek, indukcji uszkodzeń oraz kwantyfikacji markerów pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji metody dla innych obszarów mózgu lub etapów rozwoju.
- Potencjalne ograniczenia obejmują niewielkie zanieczyszczenie mikroglejem oraz zmienność w uzysku astrocytów.
