Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Ogólnym celem tej kwantyfikacji nitkowatej aktyny Punta w hodowanych neuronach jest wprowadzenie użytecznej metody badania integralności i kognitywności struktur synaptycznych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii dotyczące spinogenizy, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona szczegółowy protokół pierwotnej hodowli neuronów, po identyfikacji i kwantyfikacji F-aktyny puncta.

Gdy cel osiągnięcia jest nieznany, konieczne jest oszacowanie ogólnej integralności struktur fundantrycznych ratia. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy badaliśmy uszkodzenia neuronów wywołane przez narkotyki, takie jak kokaina i toksyczne białka HIV, takie jak tat i JP 120 Dwa dni przed założeniem hodowli pokryj 12, 35 milimetrowymi szklanymi naczyniami z dnem, z dwoma mililitrami roztworu roboczego lizyny Poly-L. I przechowuj naczynia w okapie przez noc, aby zachować ich sterylność.

Następnego dnia wyrzuć środek powlekający i spłucz naczynia podwójnie destylowaną wodą. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na godzinę pod maską. Następnie przenieś dwa mililitry podłoża galwanicznego do każdego naczynia.

I inkubuj naczynia przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Jednego dnia hodowli umieść pobrany mózg na szalce Petriego zawierającej zimny HBSS. Następnie, zabezpieczając mózg pęsetą, użyj zakrzywionych kleszczy, aby oddzielić półkule i usunąć opony mózgowe.

Odizoluj korę czołową i przenieś kawałki do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj dwa mililitry świeżego HBSS i 20 mikrolitrów trypsyny EDTA do probówki i inkubuj tkanki nerwowe przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Z delikatnym wirowaniem co kilka minut.

Pod koniec inkubacji użyj szklanej pipety, aby odessać cały stary HBSS. I spłucz korę dwa razy świeżym HBSS. Po drugim umyciu zanurz tkankę w inhibitorze trypsyny.

Dobrze wymieszać i pozostawić próbkę na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj chusteczki dwa razy świeżym HBSS. Teraz użyj szklanej pipety z gumową gruszką, aby bardzo powoli rozcierać kawałki mózgu od 10 do 15 razy.

Następnie, za pomocą skalibrowanej pipety wyposażonej w sterylną końcówkę o zmniejszonej średnicy, bardzo powoli ponownie rozcieraj zawiesinę tkanki. Gdy roztwór jest jednorodny, umieść komórki w odpowiedniej gęstości na wstępnie powlekanych szalkach hodowlanych w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 24 godzinach zastąp pożywkę galwaniczną świeżo przygotowanym, kompletnym, wąskim podłożem podstawowym bez surowicy wzrostowej.

I włóż komórki do inkubatora hodowli komórkowych na co najmniej 12 do 14 dni. Posiewanie o niskiej gęstości jest ważne dla wizualizacji poszczególnych neuronów. A podłoże podstawowe neuronów ma kluczowe znaczenie w minimalizowaniu perforacji astrolizy w kulturach komórkowych.

Aby oznaczyć komórki pod kątem immunocytochemii, najpierw umyj szklane naczynie do hodowli komórek z dnem dwa razy PBS. Następnie utrwal komórki czteroprocentowym paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie następuje dwa mycia PBS.

Następnie przesiąkaj komórki 0,1% Triton X 100 w PBS przez pięć minut i oznaczaj je barwnikiem specyficznym dla F-aktyny w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach spłucz komórki dwukrotnie PBS i zablokuj wszelkie niespecyficzne zabarwienia powierzchni komórek 10% normalną surowicą kozią. Pod koniec inkubacji oznacz nocne komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza poliklonalnym przeciwciałem anty-map two kurczaka.

Następnego ranka przepłucz komórki dwa razy PBS i oznacz je odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym. Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej ponownie przepłucz komórki PBS i oznacz je 10 mikrolitrami huxs przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki dwa ostatnie razy PBS i zakonserwuj je 100 mikrolitrami odczynnika zapobiegającego blaknięciu.

W ciągu trzech dni od tego zabarwienia włącz mikroskop fluorescencyjny i wybierz obiektyw 20 X. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu ustaw rozmiar obrazu w pikselach na 1600 na 1200, a rozdzielczość obrazu 0,17 mikrona na piksel na powiększenie 1x. Przenieś miskę z komórkami na stolik mikroskopu.

I uzyskaj obrazy neuronów mapujących 2 oznaczone co F-aktyną pod zielonymi i czerwonymi kanałami fluorescencyjnymi. Po uzyskaniu wszystkich obrazów wybierz pięć obrazów pojedynczych neuronów w kanałach zielonym, czerwonym i niebieskim z wyraźnie zaznaczonymi trzpieniami dendrytycznymi. I użyj ciągłej immunofluorescencji mapy drugiej, aby zidentyfikować struktury bogate w F-aktynę w drugich uporządkowanych segmentach dendrytycznych.

Obróć zaznaczony obszar obrazów w poziomie. Skopiuj i wklej region jako nowy obraz. Następnie odejmij fluorescencję tła obrazu i użyj oprogramowania, aby policzyć liczbę jasnozielonych F-aktyny puncta.

Użyj przeszkolonych niezależnych obserwatorów, aby zmierzyć długość wybranych segmentów dendrytycznych. A następnie wyeksportuj liczby punktowe i dane o długości segmentów dendrytycznych do pliku arkusza kalkulacyjnego. Upewnij się, że obserwatorzy uwzględniają F-aktynę posture puncta o różowej intensywności fluorescencji co najmniej 50% ponadprzeciętnej intensywności barwienia w trzonie dendrytycznym w każdym wybranym segmencie.

Na koniec oblicz gęstość zgodnie ze wzorem, wyrażając dane jako liczbę punktów F-aktyny na dziesięć mikronów dendrytu. W tym przypadku obrazy kontrastu interferencji różnicowej pokazują zmiany morfologiczne obserwowane w rozwijających się neuronach korowych płodu szczura w dniach od 4 do 27 en vitro. Zwróć uwagę na wzrost długości i liczby dendrytów w miarę dojrzewania pierwotnych neuronów hodowanych szczurów.

Ponieważ znakowanie F-aktyny falloidyną jest bardzo szybkie, możliwe jest wizualne oszacowanie integralności sieci synapto-dendrytycznej przed przystąpieniem do immunocytochemicznego znakowania przeciwciał. Map2 barwi nienaruszone dendryty, potwierdzając, że F-aktyna puncta znajduje się na dendrytach neuronalnych, a nie jest zlokalizowana w innych komórkach, takich jak astrocyty. Na obrazach o wysokiej rozdzielczości można zaobserwować struktury bogate w F-aktynę zawierające filopodia phi, wypukłości kręgosłupa i plamy F-aktyny.

W tym eksperymencie mającym na celu ocenę uszkodzenia synapto-dendrytycznego wywołanego przez HIV 1, barwienie Map2 ujawniło mniej gałęzi dendrytycznych i zmniejszoną F-aktynę w neuronach korowych szczura po leczeniu HIV 1 tat. Rzeczywiście, F-aktyna punktowa zwiększa się lub zmniejsza w odpowiedzi na eksperymentalne leczenie. Na przykład w tym eksperymencie, w którym hodowane neurony traktowano niekonkurencyjnym antagonistą receptora NMDA, memantyną, dodatni receptor F-aktyny puncta doświadczył znacznego wzrostu gęstości.

Natomiast leczenie skojarzone metamfetaminą i HIV1 tat spowodowało znaczną utratę F-aktyny puncta. Po uzyskaniu obrazów o wysokiej rozdzielczości neuronów Map2 oznaczonych węglem F-aktyny, pamiętaj, aby dwóch przeszkolonych obserwatorów wybrało segmenty dendrytów drugiego rzędu do analizy gęstości puncta. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie badań neurobiologicznych.

Nie tylko do monitorowania ostrej synaptopatii, ale także do badania odzyskiwania synaps i eksperymentalnych procesów odbudowy neuronów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować niezawodną metodę pomiaru integralności synaptycznej neuronowej sieci dendrytycznej.