Name: Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji F-aktyny w neuronach korowych szczura przy użyciu immunocytochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia ocenę integralności synaptycznej oraz plastyczności dendrytów w warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH DA013137, DA031604 i HD043680. Częściowe wsparcie zostało zapewnione przez grant szkoleniowy NIH T32 w zakresie nauk biomedyczno-behawioralnych.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny (numer gwarancji: A3049-01).
1. Hodowla neuronów embrionalnych o niskiej gęstości
<ol>
	<li>Przygotowanie do hodowli pierwotnych neuronów korowych
	<ol>
		<li>Rozwiązania:
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór podstawowy poli-L-lizyny, rozpuszczając 5 mg poli-L-lizyny w 10 ml buforu boranowego.</li>
			<li>Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając 1 ml bulionu poli-L-lizyny w 49 ml buforu boranowego.</li>
			<li>Przygotować bufor boranowy o pH 8,4, zaczynając od 395 mldH2O, a następnie dodając wszystkie składniki (1,24 g kwasu borowego + 1,9 g boraksu). Doprowadzić pH do 8,4 na 1 M NaOH. Ustawić na 400 ml i przefiltrować za pomocą nylonowego filtra membranowego 0,2 μm pod maską.</li>
			<li>Przygotuj roztwór HBSS o pH 7,2, zaczynając od 445 mldH2O i dodając wszystkie pozostałe składniki (50 ml 10 x HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Doprowadzić pH do 7,2 na 1 N HCl, doprowadzić do 500 ml i przefiltrować za pomocą filtra z nylonową membraną 0,2 μm pod maską.</li>
			<li>Przygotować pożywkę galwaniczną: DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą. Filtr z nylonowym filtrem membranowym 0,2 μm pod maską.</li>
			<li>Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową: Do 50 ml pożywki Neurobasel dodaj suplementy (500 μl GlutaMax (100X) + 500 μl glukozy + 1 ml B-27 (50X) + 500 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (100X) + 100 μl 7,5% wodorowęglanu sodu. Filtr z nylonowym filtrem membranowym 0,2 μm pod maską.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dwa dni przed posiewem:
		<ol>
			<li>Pokryj dwanaście naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 2 ml roztworu roboczego poli-L-lizyny i trzymaj pod pokrywą O/N.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dzień przed posiewem:
		<ol>
			<li>Opróżnij naczynia ze środka powlekającego i spłucz ddH2O. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na godzinę pod kapturem.</li>
			<li>Przygotować pożywkę posiewową (DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (10% całkowitego roztworu). Odpipetować pipetą 2 ml pożywki do każdej pożywki i inkubować O/N w temperaturze 37 oC, 5% CO2, 
			nuta: Ważne jest, aby podczas hodowli unikać plastikowych naczyń hodowlanych. Użycie naczyń ze szklanym dnem (w przypadku mikroskopów odwróconych) lub szklanych szkiełek nakrywkowych (w przypadku mikroskopów pionowych) pozwala uzyskać ostre i wyraźne obrazy. W porównaniu z naczyniem z plastikowym dnem, naczynie ze szklanym dnem pozwala uniknąć niepożądanych odcieni lub odblasków podczas mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół hodowli komórkowej:
	<ol>
		<li>Umieść schłodzony bufor HBSS (100-150 ml), szalki Petriego 100 mm, kleszcze, nożyczki, probówki 50 ml i probówki 15 ml pod światłem UV w kapturze.</li>
		<li>Poddać eutanazji ciężarną szczurkę poprzez śmiertelne wdychanie 5% sewofluranu pod maską poza pomieszczeniem hodowlanym.</li>
		<li>Sterylizuj 70% EtOH, nałóż skórę dolnej części brzucha za pomocą kleszczy, jednocześnie tnąc od ogona w górę na środku jamy brzusznej. Otwórz macicę za pomocą nożyczek, aby odsłonić łożysko.</li>
		<li>Usuń 8-10 płodów E18. Umieścić 8-10 płodów na szalkach Petriego zawierających roztwór HBSS.</li>
		<li>Przytrzymaj tył głowy płodu kleszczami, a następnie użyj nożyczek, aby odciąć głowę od ciała. Umieść go na innej szalce Petriego wypełnionej 5-7 ml HBSS. Przełóż naczynie do okapu.</li>
		<li>Napełnij dwie dodatkowe szalki Petriego o średnicy 100 mm zimnym HBSS.</li>
		<li>Odłóż czaszkę na bok i zgarnij mózg do nowej szalki Petriego wypełnionej HBSS.</li>
		<li>Użyj ostrych, zakrzywionych kleszczy, oddziel móżdżek i pień mózgu od mózgu, a następnie przenieś mózg na nową szalkę Petriego z zimnym HBSS w środku.</li>
		<li>Użyj pęsety, aby zabezpieczyć, oddziel półkule zakrzywionymi kleszczami. Usuń opony mózgowe; Wyizolować korę czołową i przenieść jej fragmenty do oznaczonych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Napełnij probówkę o pojemności 15 ml świeżym 2 ml HBSS i dodaj 20 μl trypsyny EDTA (10x skoncentrowana mieszanina z 0,5% trypsyny i 5,3 mM EDTA) do każdej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Inkubować 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie obracać rurkę co kilka minut, nie dopuszczając do osiadania.</li>
		<li>Po 10-15 minutach użyj szklanej pipety, aby usunąć stary HBSS i dwukrotnie spłucz nowym HBSS.</li>
		<li>Zanurzyć w inhibitorze trypsyny (1 mg/ml, 2 mg inhibitora trypsyny w 2 ml HBSS), dobrze wymieszać i odstawić na 5 minut. Umyć dwukrotnie świeżym HBSS.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką rozdrabniaj kawałki mózgu 10-15 razy bardzo powoli, aby uniknąć pęcherzyków. Ponownie rozcierać za pomocą skalibrowanej pipety i sterylnej końcówki o zmniejszonej średnicy końcówki bardzo powoli, aż do uzyskania jednorodności.</li>
		<li>Przenieś zdysocjowane komórki o pożądanej gęstości do wstępnie przygotowanych powlekanych szalek hodowlanych (50 komórek/mm2). Inkubować O/N w temperaturze 37 oC, 5% CO2.</li>
		<li>Po 24 godzinach zastąp pożywkę DMEM/F12 świeżo przygotowaną, kompletną, pozbawioną surowicy wzrostu pożywką Neurobasal.</li>
		<li>Utrzymuj komórki przez cały czas w inkubatorze nawilżanym powietrzem o stężeniu 5% CO2/95% powietrza w pomieszczeniu przez co najmniej 12-14 dni przed eksperymentem. Uzupełniaj komórki co 5-6 dni świeżą pożywką Neurobasal, zastępując około 50% starej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znakowanie fluorescencyjne i immunocytochemia
Uwaga: Znakowanie immunofluorescencyjne pierwotnych kultur komórek korowych zostało przeprowadzone w szklanych naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i objętości roboczej 1 ml.
<ol>
	<li>Umyj naczynie ze szklanym dnem dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4 (PBS).</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Traktuj komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej barwnikiem specyficznym dla F-aktyny, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl falloidyny w 1 ml PBS).</li>
	<li>Przepłucz komórki dwukrotnie PBS i zablokuj 10% normalną surowicą kozią w temperaturze RT przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało anty-MAP2 kurczaka (1:2,500) w PBS z 2% normalną surowicą kozią i inkubować O/N w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Po inkubacji dwukrotnie przepłukać w PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Alexa Red 594-sprzężone z kozim przeciwciałem IgG przeciwko kurczakowi (1:500) 2% normalnej surowicy koziej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłucz PBS i dodaj 10 μl/naczynie barwnika Hoescht.</li>
	<li>Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i dwukrotnie przemyć PBS. 
	Uwaga: Oznaczone komórki są teraz gotowe do kroku 3 (zliczanie F-aktyny puncta).</li>
	<li>Konserwować próbkę komórkową za pomocą 100 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu jako środka do szkiełek nakrywkowych i przechowywać w temperaturze 4 oC w ciemności do długotrwałego przechowywania. 
	nuta: Falloidyna jest stosunkowo stabilna w PBS w temperaturze +4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia, a fluorescencję można zachować za pomocą odczynników zapobiegających blaknięciu szkiełek nakrywkowych. Jednak optymalne obrazy uzyskuje się po 1-3 dniach od barwienia, ponieważ falloidyna może zacząć dyfundować przy dłuższym przechowywaniu.</li>
</ol>
3. Liczenie F-aktyny Puncta
<ol>
	<li>Włącz mikroskop fluorescencyjny i przełącz na obiektyw 20×. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i skonfiguruj program o rozmiarze obrazu 1280×960 pikseli i rozdzielczości obrazu 0,17 μm/piksel przy powiększeniu 1×.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy współznakowanych neuronów F-aktyny / MAP2 pod zielonymi (495 nm) / czerwonymi (613 nm) kanałami fluorescencyjnymi.</li>
	<li>Wybierz 5 zielonych (F-aktyna)/czerwonych (MAP2) znakowanych immunologicznie/niebieskich (Hoescht) obrazów fluorescencyjnych pojedynczego neuronu z wyraźnie zdefiniowanymi trzpieniami dendrytycznymi.</li>
	<li>Zidentyfikuj struktury bogate w F-aktynę w segmencie dendrytycznym drugiego rzędu (zakres długości 25-75 μm) z ciągłą immunofluorescencją MAP2.</li>
	<li>Obróć zaznaczony obszar obrazów do poziomu poziomego. Skopiuj i wklej jako nowy obraz.</li>
	<li>Odejmij tło obrazów, stosując spójne korekty dla każdego dania.</li>
	<li>Policz jasnozieloną punkcję F-aktyny i ręcznie prześledź długość wybranego segmentu dendrytycznego przez przeszkolonych niezależnych obserwatorów. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Obliczyć gęstość, dzieląc całkowitą punktę (N) znakowaną F-aktyną przez długość (L) dendrytów znakowanych MAP2. Wyraż dane jako liczbę punktów F-aktyny na 10 μm dendrytu 
	nuta: W każdym wybranym segmencie dendrytycznym uwzględniono Puncta (wielkość ≤1,5 μm) fluorescencji F-aktyny o natężeniu piku co najmniej 50% powyżej średniej intensywności barwienia w trzonie dendrytycznym.</li>
</ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym protokole opisujemy hodowlę neuronów korowych szczurów o niskiej gęstości w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem, co pozwala nam zidentyfikować dendryty poszczególnych neuronów. Następnie używamy barwienia falloidyną i MAP2 w celu wykrycia zmian dendrytycznych. Następnie użyliśmy specjalistycznego oprogramowania do ilościowego określenia zmian w F-aktynie puncta.
Aby określić zmiany w F-actin puncta, cała sieć neuronalna pojedynczego neuronu musi być wyraźnie widoczna, co pozwala...

Głównym celem tego badania jest opracowanie wiarygodnej metody pomiaru (oszacowania) integralności synaptycznej neuronalnej sieci dendrytycznej. Tutaj opisujemy kwantyfikację F-aktyny puncta w pierwotnych neuronach hodowanych na szczurach za pomocą kombinacji barwienia falloidyną i immunocytochemicznego (ICC) wykrywania dendrytów z późniejszą analizą przy użyciu specjalistycznego oprogramowania (NIS-Elements).
Znakowane phallotoksyny mają podobne powinowactwo zarówno do dużych, jak i małych włókien (F-aktyna), ale nie wiążą się z monomeryczną globularną aktyną (G-aktyną), w przeciwieństwie do niektórych przeciwciał aktynowych 1. Niespecyficzne wiązanie falloidyny jest znikome, zapewniając w ten sposób minimalne tło podczas obrazowania komórkowego. Faloidyna jest znacznie mniejsza niż przeciwciała, które zwykle byłyby używane do znakowania białek komórkowych do mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na znacznie intensywniejsze znakowanie F-aktyny przez falloidynę. W ten sposób szczegółowe obrazy lokalizacji F-aktyny w neuronach można uzyskać dzięki zastosowaniu znakowanej falloidyny.
Barwienie dendrytów neuronalnych falloidyną (F-aktyną) generuje dyskretne "gorące punkty" lub jasne "puncta", które reprezentują różne struktury dendrytyczne, w tym dojrzałe kolce, synapsy niekolczaste 2 i niedojrzałe kolce. Niedojrzałe kolce obejmują cienkie filopodia i niektóre formy morfologii plam i mogą reprezentować inicjację spinogenezy 3. Niedojrzałe kolce i niekolczaste łaty nie mają PSD95 4. Zmiany w produkcji F-aktyny prowadzą do późniejszych zmian nie tylko w kolcach, ale także w dodatkowych strukturach dendrytycznych, co sprawia, że falloidyna jest ważnym narzędziem do badania integralności synaptodendrytycznej 5-7. Ogólnie rzecz biorąc, liczba punktów falloidyno-dodatnich (F-aktyny) odzwierciedla równowagę między aktywnymi synapsami (pobudzającymi i hamującymi), dynamiką aktyny i stabilnością synaps 8.
Chociaż ważne jest badanie konkretnych typów synaps (np. kolców pobudzających), gdy cel leczenia jest nieznany, konieczne jest najpierw oszacowanie ogólnej integralności różnych struktur dendrytycznych. Ponieważ F-aktyna jest głównym składnikiem kolców dendrytycznych i innych struktur, w tym synaps hamujących, zmieniona liczba punktów F-aktyny może wskazywać na synaptopatię. Ta synaptopatia może być następnie dalej badana pod kątem bardziej szczegółowych zmian. Nasza metoda kwantyfikacji do wykrywania wielu typów/struktur synaptycznych daje ogólne oszacowanie dendrytycznych zmian synaptycznych (wzrostów i spadków) po różnych zabiegach eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1,5 szkło nakrywkowe</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Boraks</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasel medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk rozwiązanie</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do przysłony</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7</td><td>Kleszcze Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica końska</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak poliklonalny anty-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-sprzężona koza anty-kurczak</td><td>IgG Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Cell Stain ReadyProbes Odczynnik Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E odwrócony fluorescencyjny mikroskop sterowany komputerowo&nbsp;</td><td>Instrumenty</td><td></td><td></td>Nikon</tr><tr><td>0.2 i mu; m Filtr z nylonową membraną Nalgene</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (f-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Nitkowate białko aktyny (F-aktyna) odgrywa główną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Zmiany w dendrytycznych strukturach bogatych w F-aktynę sugerują zmiany w integralności synaptycznej i łączności. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli pierwotnych neuronów korowych szczura, barwienia falloidyną dla F-aktyny punktowej i późniejszych technik kwantyfikacji. Najpierw kora czołowa zarodków szczurów E18 jest dysocjowana na hodowlę komórkową o niskiej gęstości, a następnie neurony hodowane in vitro przez co najmniej 12-14 dni. Po eksperymentalnym leczeniu neurony korowe są barwione falloidyną AlexaFluor 488 (w celu znakowania dendrytycznej F-aktyny puncta) i białkiem związanym z mikrotubulami 2 (MAP2; w celu walidacji komórek neuronalnych i integralności dendrytycznej). Wreszcie, specjalistyczne oprogramowanie służy do analizy i ilościowego określania losowo wybranych dendrytów neuronalnych. Struktury bogate w F-aktynę są identyfikowane na gałęziach dendrytycznych drugiego rzędu (zakres długości 25-75 μm) z ciągłą immunofluorescencją MAP2. Przedstawiony tutaj protokół będzie przydatną metodą do badania zmian w strukturach synaps dendrytycznych po leczeniu eksperymentalnym.

W niniejszych metodach najpierw hodujemy neurony kory mózgu szczura przy niskiej gęstości w szalkach z szklanym dnem o średnicy 35 mm, co pozwala nam na identyfikację dendrytów poszczególnych neuronów. Na Rycini 1 obrazy z kontrastu interferencyjnego (DIC) pokazują zmiany morfologiczne w rozwijających się neuronach kory mózgu płodu szczura w dniach 4, 6, 10, 14, 21 i 27 in vitro. Należy zauważyć, że długość i liczba dendrytów zwiększają się wraz z dojrzewaniem ho...

Nitkowata aktyna (F-aktyna) odgrywa ważną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Kwantyfikacja F-aktyny puncta jest zatem użytecznym narzędziem do badania integralności struktur synaptycznych. Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania F-aktyny puncta znakowanej falloidyną w pierwotnych kulturach neuronów korowych o niskiej gęstości.

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Ogólnym celem niniejszego procesu ilościowego oznaczania punktów filamentowej aktyny w hodowlach neuronów jest wprowadzenie użytecznej metody badania integralności i kognitywności struktur synaptycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki dotyczące spinogenezy, plastyczności synaptycznej oraz stabilności synaptycznej. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie szczegółowego protokołu hodowli pierwotnych neuronów, po której następuje identyfikacja i ilościowe oznaczanie punktów F-aktyny.W sytuacjach, gdy cel osiągnięcia jest nieznany, konieczna jest ocena ogólnej integralności struktur ratia fundantric. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania uszkodzeń neuronów indukowanych przez narkotyki, takie jak kokaina, oraz toksyczne białka HIV, takie jak tat i JP 120. Na dwa dni przed przygotowaniem hodowli należy pokryć 12 szalki z dnem szklanym o średnicy 35 milimetrów dwiema mililitrami roztworu roboczego poli-L-lizyny. Następnie szalki należy przechowywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez noc, aby zachować ich sterylność.Następnego dnia usunąć środek powlekający i wypłukać płytki wodą dwukrotnie destylowaną. Pozostawić płytki do wyschnięcia na jedną godzinę pod dygestorium. Następnie przenieść 2 mL pożywki do wysiewu do każdej płytki.Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. W dniu hodowli umieść pobrany mózg w szalce Petriego zawierającej zimny HBSS. Następnie, stabilizując mózg pęsetą, użyj zakrzywionych kleszczyków do rozdzielenia półkul oraz usunięcia opon mózgowych.Wyizoluj korę czołową i przenieś fragmenty do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Do probówki dodaj dwa mililitry świeżego HBSS oraz 20 mikrolitrów trypsyny z EDTA, a następnie inkubuj tkanki neuronalne przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając zawiesinę co kilka minut.Po zakończeniu inkubacji odessać całe zużyte HBSS za pomocą pipety szklanej. Następnie dwukrotnie wypłukać korę świeżym HBSS. Po drugim płukaniu zanurzyć tkankę w inhibitorze trypsyny.Wymieszać dokładnie i pozostawić próbkę na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć tkanki dwukrotnie świeżym roztworem HBSS. Teraz, używając pipety szklanej z gruszką, bardzo powoli rozetrzeć fragmenty mózgu poprzez 10 do 15 cykli pipetowania.Następnie, używając skalibrowanej pipety wyposażonej w sterylną końcówkę o zredukowanej średnicy, bardzo powoli ponownie homogenizuj zawiesinę tkankową. Gdy roztwór stanie się jednorodny, wysiej komórki z odpowiednią gęstością w uprzednio powlekłych naczyniach hodowlanych i inkubuj przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 24 godzinach wymień medium do wysiewu na świeżo przygotowane kompletne, bezserwatkowe, wąskie medium podstawowe do wzrostu.Następnie należy przenieść komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na co najmniej 12 do 14 dni. Wysiewanie przy niskiej gęstości jest istotne dla wizualizacji poszczególnych neuronów. Z kolei zastosowanie podstawowej pożywki dla neuronów jest kluczowe w celu zminimalizowania proliferacji astrocytów w hodowlach komórkowych.Aby przeprowadzić znakowanie komórek do immunocytochemii, najpierw dwukrotnie przemyj szalkę do hodowli komórek z szklanym dnem roztworem PBS. Następnie utrwal komórki w czteroprocentowej parafomaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź dwa przemycia roztworem PBS.Następnie przeprowadź permeabilizację komórek w 0,1% Triton X 100 w PBS przez pięć minut, a następnie znakuj je barwnikiem specyficznym dla F-aktyny w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach przepłucz komórki dwukrotnie PBS-em i zablokuj niespecyficzne barwienie powierzchni komórek 10% normalną surowicą kozią. Po zakończeniu inkubacji znakuj komórki przez noc w temperaturze 4°C przeciwciałem poliklonalnym przeciwko MAP2 z kurczaka.Następnego dnia komórki należy przepłukać dwukrotnie PBS i znakować odpowiednim przeciwciałem wtórnym. Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej komórki ponownie przepłukuje się PBS, a następnie znakuje 10 µl huxs przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płucze się dwa ostatnie razy PBS i konserwuje 100 µl odczynnika antyblaknącego (anti-fade).W ciągu trzech dni od przeprowadzenia tego barwienia włącz mikroskop fluorescencyjny i wybierz obiektyw 20 X. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu ustaw rozmiar obrazu w pikselach na 1600 na 1200 oraz rozdzielczość obrazu 0,17 mikrona na piksel przy powiększeniu 1 X. Przenieś naczynie z komórkami na stolik mikroskopu.Następnie należy pozyskać obrazy neuronów podwójnie znakowanych przeciwciałami przeciwko F-aktynie i Map2 w kanałach fluorescencji zielonej i czerwonej. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy wybrać pięć zdjęć pojedynczych neuronów w kanałach zielonym, czerwonym i niebieskim, na których widoczne są wyraźne drzewa dendrytyczne. Następnie należy wykorzystać immunofluorescencję Map2 do zidentyfikowania struktur bogatych w F-aktynę w dendrytach drugiego rzędu.Obróć wybrany obszar obrazów poziomo. Następnie skopiuj i wklej ten obszar jako nowy obraz. Po tym odejmij fluorescencję tła obrazu i użyj oprogramowania do policzenia liczby jasnych, zielonych punktów F-actin.Wykorzystaj przeszkolonych niezależnych obserwatorów do pomiaru długości wybranych segmentów dendrytycznych. Następnie wyeksportuj liczbę punktów (puncta) oraz dane dotyczące długości segmentów dendrytycznych do pliku arkusza kalkulacyjnego. Upewnij się, że obserwatorzy uwzględniają punkty F-aktyny o różowej intensywności fluorescencji co najmniej 50% wyższej niż średnia intensywność barwienia w trzonie dendrytycznym w każdym wybranym segmencie.Na koniec oblicz gęstość zgodnie z formułą, wyrażając dane jako liczbę punktów F-aktyny na dziesięć mikronów dendrytu. Tutaj obrazy z kontrastu różnicowego wykazują zmiany morfologiczne obserwowane w rozwijających się płodowych neuronach korowych szczura od 4. do 27. dnia in vitro. Zwróć uwagę na wzrost długości i liczby dendrytów w miarę dojrzewania hodowlanych pierwotnych neuronów szczura.Ponieważ znakowanie F-aktyny falloidyną przebiega bardzo szybko, możliwe jest wizualne oszacowanie integralności sieci synapto-dendrytycznej przed przystąpieniem do immunocytochemicznego znakowania przeciwciałami. Map2 barwi nienaruszone dendryty, potwierdzając, że punkty F-aktyny znajdują się na dendrytach neuronalnych, a nie w innych komórkach, takich jak astrocyty. Na obrazach o wysokiej rozdzielczości można zaobserwować struktury bogate w F-aktynę, zawierające filopodia, wypustki kolców oraz plamki F-aktyny.W tym eksperymencie służącym do oceny uszkodzeń synapto-dendrytycznych indukowanych przez HIV 1 tat, barwienie Map2 wykazało mniejszą liczbę rozgałęzień dendrytycznych oraz zmniejszoną ilość F-aktyny w korowych neuronach szczura po zastosowaniu leczenia HIV 1 tat. Rzeczywiście, liczba punktów F-aktyny zwiększa się lub zmniejsza w odpowiedzi na zastosowane w doświadczeniu leczenie. Na przykład, w tym eksperymencie, gdy hodowane neurony zostały poddane działaniu memantyny, niekonkurencyjnego antagonisty receptora NMDA, odnotowano istotny wzrost gęstości punktów pozytywnych pod kątem F-aktyny.W przeciwieństwie do tego, zastosowanie kombinacji metamfetaminy oraz HIV1 tat spowodowało znaczny zanik punktowych struktur F-aktyny. Po uzyskaniu obrazów o wysokiej rozdzielczości neuronów Map2 z oznakowaną F-aktyną, należy przekazać materiał dwóm przeszkolonym obserwatorom w celu wyboru fragmentów dendrytów drugiego rzędu do analizy gęstości tych struktur. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauk.Metoda ta znajduje zastosowanie nie tylko w monitorowaniu ostrej synaptopatii, ale również w badaniu regeneracji synaptycznej oraz eksperymentalnych procesów restauracji neuronalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak opracować wiarygodną metodę pomiaru integralności synaptycznej sieci dendrytycznej neuronów.

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji końców barbed F-aktyny w stożkach wzrostu neuronów. Po hodowli neuronów na szkiełkach podstawowych, komórki poddaje się permeabilizacji za pomocą roztworu zawierającego saponinę. Następnie krótka inkubacja w buforze z saponiną zawierającym rodaminę-aktynę pozwala na wbudowanie fluorescencyjnej aktyny w wolne końce barbed aktyny.

Znakowanie końców typu barbed F-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Ten film demonstruje procedurę fluorescencyjnego barwienia neuronów korowych szczurów do mikroskopii. Jest ukierunkowany na F-aktynę i białka dendrytyczne w celu analizy integralności strukturalnej i obliczenia gęstości F-aktyny, co ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji i zdrowia neuronów.

Kwantyfikacja nitkowatej aktyny punktowej w neuronach kory mózgowej szczura

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Poznaj metodę kwantyfikacji F-aktyny w neuronach korowych szczura przy użyciu immunocytochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia ocenę integralności synaptycznej oraz plastyczności dendrytów w warunkach in vitro.

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Przeglądaj więcej filmów