Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Ogólnym celem tego anatomicznego preparatu przekroju poprzecznego jest ilościowe określenie względnej akumulacji kryształów i celulozy w rozdzielczości komórkowej, umożliwiając bezpośrednie porównanie różnych tkanek w pierwotnym korzeniu Arabidopsis. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii i rozwoju roślin, takie jak to, w jaki sposób skład komórkowy danego typu komórek wpływa na wzrost całych narządów. Po wysterylizowaniu nasion Arabidopsis zgodnie z protokołem tekstowym, rozprowadź sterylne nasiona na płytkach zawierających 0,8% agaru roślinnego i pożywkę 0,5XM.

Za pomocą parafilmu owiń talerze i przykryj folią aluminiową. Przechowuj płytki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez jeden do czterech dni, aby zapewnić równomierne kiełkowanie. Następnie przenieś płytki do komory wzrostowej odpowiedniej do uprawy sadzonek Arabidopsis, ustawiając płytki pionowo, aby utrzymać wzrost korzeni na pożywce agarowej Przygotuj roztwór Richardsona zgodnie z protokołem tekstowym Przed użyciem przefiltruj przez napędzaną strzykawką jednostkę filtrującą PVD 0,22 mikrona.

Następnie pod kapturem chemicznym przygotuj 50 mililitrów utrwalacza, łącząc 38 ml 0,5 M kakodylanu sodu z 2,5 ml aldehydu glutarowego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu Richardsona do roztworu utrwalającego, aby wygenerować końcowy roztwór utrwalający. Użyj wstępnie oznaczonej płytki, a następnie umieść 2 do 3 ml końcowego roztworu utrwalającego w studzienkach, aby roztwór całkowicie pokrył sadzonki.

Za pomocą plastikowych kleszczy ostrożnie przenieś do 10 sadzonek do każdej studzienki. Użyj parafilmu do uszczelnienia płytek przed przechowywaniem w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną noc i do jednego tygodnia. Aby odwodnić utrwalone sadzonki, użyj kleszczy, aby podnieść rośliny za pomocą nich i przenieść je do dołków nowych, oznaczonych sześcioma płytkami dołkowymi zawierającymi rosnące stężenia etanolu w podanych tutaj czasach.

Przygotuj pożywkę infiltracyjną w małej szklanej butelce, mieszając zawartość jednej torebki Historesin Activator z 50 ml płynu z żywicą zasadową. Włóż magnes i mieszaj roztwór na płytce mieszającej przez 20 minut. Napełnij oznaczone studzienki płytki sześciodołkowej 2 do 3 ml pożywki infiltracyjnej.

Następnie, gdy sadzonki są całkowicie odwodnione, użyj kleszczy, aby przenieść je z 95% roztworu etanolu do pożywki infiltracyjnej, upewniając się, że są w pełni pokryte pożywką. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery dni, aby zapewnić maksymalną penetrację tkanek roślinnych. Aby przygotować bloki, umieść małe etykiety ołówkiem oznaczonym nazwą próbki w każdej studzience, zatapiając formy.

Przygotować podłoże do zatapiania, dodając 1 ml utwardzacza do 15 ml pożywki infiltracyjnej. Za pomocą około 200 mikrolitrów podłoża do zatapiania napełnij połowę każdej studzienki w formie. I użyj kawałka folii nad głową, aby przykryć formę dodatkowym 1 ml z każdej strony.

Inkubuj pleśnie w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić częściową polimeryzację. Następnie przygotuj dodatkową partię podłoża do zatapiania i trzymaj je ładnie, aby uniknąć polimeryzacji podczas układania końcówek korzeni w formie. Dodaj podłoże do zatapiania na małym talerzu i umieść jedną sadzonkę w podłożu.

Pod lunetą sekcyjną użyj skalpela, aby przeciąć każdą końcówkę korzenia, a następnie bardzo ostrożnie umieść ją w formie w odległości około 2 do 3 mm od obwodu formy, albo pionowo w przypadku sekcji przenoszenia, albo poziomo w przypadku odcinków podłużnych. Po ułożeniu tkanki użyj podłoża do zatapiania, aby całkowicie wypełnić formę i przykryć folią nad głową. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny: Aby wysuszyć bloki, umieść je w eksykatorze z suchym żelem krzemionkowym i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.

Za pomocą nożownika wyposażonego w diamentowe narzędzie do nacinania przygotuj szklane noże ze szklanych prętów, przecinając szklaną drogę na kwadrat, a następnie przecinając kwadrat po przekątnej, aby uzyskać dwa noże. Sprawdź, czy oba noże mają ostre krawędzie. Zamontuj blok w uchwycie.

Następnie za pomocą jednoostrzowego ostrza przemysłowego usuń nadmiar materiału blokowego do jednego mm od wierzchołka korzenia, aby uzyskać kształt piramidy. Pokrój uformowany blok na plastry o szerokości od 2 do 3 mikronów i przenieś plasterki na oznaczone szklane szkiełko. Następnie dodaj kropelki wody na plasterki.

Ważne jest, aby przygotować sekcje o jednolitej szerokości, aby zminimalizować zmienność analizowanych danych. Umieść szkiełka na blokach grzewczych ustawionych na małe ciepło, aż woda odparuje. Aby przygotować szkiełka do oglądania pod mikroskopem spolaryzowanym, rozcieńczyć roztwór Richardsona do 2% oryginalnego roztworu i użyć około 1 ml do przykrycia plastrów.

Następnie umieść próbki na bloku grzewczym na 5 sekund i umyj je wodą destylowaną. Po wysuszeniu szkiełek na płycie grzejnej obserwuj plastry pod mikroskopem preparacyjnym i użyj markera, aby zaznaczyć tył szkiełka, aby wskazać położenie interesujących go plasterków. Dodać 100 mikrolitrów podłoża montażowego przed przykryciem szkiełkiem nakrywkowym.

Obraz i analiza zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazano tutaj przekrój korzenia pierwotnego rzodkiewnika z promienistą organizacją jego komórek i tkanek składowych, w tym komórek innych niż włosy, komórek rzęsatych i kory. Ten konfokalny obraz pokazuje ekspresję BRI1-GFP w komórkach innych niż włosy na zmutowanym tle BRI1, który hamuje jednokierunkową ekspansję sąsiednich komórek i wzrost całego korzenia.

Jak widać tutaj, podłużne przekroje korzeni uzyskane z typu dzikiego i z linii wyrażających BRI1 w komórkach niewłosowatych wykazywały podobną orientację mikrowłókienek celulozy o dużej zmienności kątów obecnych w komórkach merystematycznych w porównaniu z komórkami w strefie przejściowej. Umożliwia to porównanie względnej akumulacji kryształu w celulozie w odpowiednich komórkach merystematycznych i wydłużających się dwóch tłach genetycznych, jak pokazano tutaj w przekrojach poprzecznych, i ujawnia korelację między ekspresją BRI1 w komórkach niewłosych a wysoką lokalną akumulacją kryształu w celulozie. Ogólnie rzecz biorąc, w filmach nowicjusze w tej metodzie będą mieli problemy, ponieważ trudno jest uzyskać dobrze zorientowane korzenie podczas procedury osadzania.

Dlatego do przekrojenia należy przygotować kilka bloków. Po opanowaniu pojedynczej sekcji blokowej można wykonać w ciągu 2 do 3 godzin. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że akumulacja kryształu w celulozie jest porównywalna między komórkami, jeśli mają one podobną orientację mikrowłókien celulozy, określoną przez przekroje podłużne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak naprawić sadzonki rzodkiewnika i jak osadzić je w blokach, a następnie przygotować podłużne i poprzeczne przekroje korzeni. Powinieneś również mieć dobry wgląd w dane, które można uzyskać za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego.