Name: Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji krystalicznej celulozy w korzeniach Arabidopsis przy użyciu mikroskopii światła spolaryzowanego. Technika ta umożliwia analizę składu ścian komórkowych na poziomie komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr M. Rosenbergowi za jej rady i pomoc w przeprowadzaniu sekcji anatomicznych. Dziękujemy również firmie D. Eisler za pomoc techniczną. Badania te zostały wsparte grantami z FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09) oraz Izraelska Fundacja Naukowa (ISF; 592/13).

1. Wzrost roślin
<ol>
	<li>Sterylizuj nasiona powierzchniowo.
	<ol>
		<li>Sterylizuj nasiona (do 30 mg) metodą mokrą lub suchą. Na przykład, w przypadku metody sterylizacji na sucho, dodać 1 ml lodowatego HCl 37% w 50 ml wybielacza, w szklanej zlewce w zamkniętym eksykatorze przez co najmniej 4 godziny i do nocy. Wykonaj ten krok w okapie chemicznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozłóż sterylne nasiona na talerzach z 0,8% agarem roślinnym w 0,5x pożywce Murashige & Skoog (MS). Owiń talerze Parafilm lub porowatą taśmą i przykryj folią aluminiową.</li>
	<li>Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez 1 - 4 dni, aby zapewnić równomierne kiełkowanie.</li>
	<li>Przenieś płytki do komory wzrostowej odpowiedniej do uprawy sadzonek Arabidopsis. Umieść płytki pionowo, aby utrzymać wzrost korzeni na wierzchu podłoża agarowego i zapobiec penetracji.</li>
	<li>Przenieś sadzonki do utrwalacza 7 dni po wykiełkowaniu (DAG).</li>
</ol>
2. Fiksacja
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu Richardsona, łącząc równe objętości 1% boraksu (czynnika buforowego), 1% błękitu metylenowego i 1% lazuru (barwniki histologiczne) w podwójnie destylowanej wodzie. Przed użyciem przefiltrować przez napędzany strzykawką filtr PVDF 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 50 ml utrwalacza: 1,25% aldehydu glutarowego w 0,05 M kakodylan sodu (środek buforujący). 
	Uwaga: Materiały te są toksyczne i należy się z nimi obchodzić w kapturze chemicznym.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu Richardsona (patrz 2.1) do roztworu utrwalającego (patrz 2.2) w celu uzyskania końcowego roztworu utrwalającego.</li>
	<li>Oznacz każde zagłębienie na płytce 6-dołkowej odpowiednią nazwą próbki.</li>
	<li>Umieścić 2-3 ml końcowego roztworu utrwalającego (patrz 2.3) w studzienkach, tak aby sadzonki po przeniesieniu były całkowicie pokryte płynem.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś za pomocą kleszczy do 10 sadzonek do każdej studzienki. Uszczelnij płytki za pomocą Parafilm. Przechowywać w temperaturze 4 °C, w ciemności, przez co najmniej jedną noc, do tygodnia.</li>
</ol>
3. Odwodnienie
<ol>
	<li>Odwodnić sadzonki. Przenieś je między studzienkami nowych 6-dołkowych płytek, zawierających rosnące stężenia etanolu, jak podano tutaj: 10% etanol przez 15 minut; 30% etanolu przez 15 min; 50% etanolu przez 15 min; 70% etanolu przez 15 min; 85% etanolu przez 15 min; 95% etanolu przez 15 min; 95% etanolu w temperaturze 4 °C, przez noc, minimum. Z sadzonkami należy obchodzić się, ostrożnie chwytając je za liścienie, najlepiej za pomocą plastikowych kleszczy.</li>
</ol>
4. Infiltracja 
<ol>
	<li>Przygotować podłoże infiltracyjne. Wymieszaj zawartość 1 torebki aktywatora zestawu historesin z 50 ml płynnego zestawu żywicy podstawowej w małej szklanej butelce. Mieszaj z magnesem przez 20 minut. Pożywkę infiltracyjną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Oznaczyć każdą studzienkę nowej płytki 6-dołkowej odpowiednią nazwą próbki i napełnić 2-3 ml pożywki infiltracyjnej.</li>
	<li>Przenieś sadzonki z 95% roztworu etanolu do podłoża infiltracyjnego za pomocą kleszczy. Upewnij się, że sadzonki są całkowicie pokryte podłożem.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 dni, aby zapewnić maksymalną penetrację tkanek roślinnych.</li>
</ol>
5. Przygotowanie bloku
<ol>
	<li>Umieść małe etykiety, oznaczone ołówkiem z nazwą próbki, w każdym dołku form do zatapiania.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do zatapiania, dodając 1 ml utwardzacza do 15 ml pożywki infiltracyjnej (patrz 4.1). Nie próbuj przygotowywać objętości mniejszej niż 15 ml, aby uniknąć problemów z polimeryzacją.</li>
	<li>Wypełnij połowę każdej studzienki w formie 200 μl podłoża do zatapiania i przykryj kawałkiem folii przyciętym do kształtu formy, ale do rozmiaru o 1 mm większego z każdej strony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny, aby umożliwić polimeryzację. Nie przekraczać 5 godzin.</li>
	<li>Przygotować dodatkową porcję podłoża do zatapiania (patrz ppkt 5.2) i przechowywać na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji podczas układania wierzchołków korzeni w formie.</li>
	<li>Odetnij każdą końcówkę korzenia pod lunetą preparacyjną za pomocą skalpela i bardzo ostrożnie ustaw ją: pionowo dla przekrojów poprzecznych lub poziomo dla przekroju wzdłużnego, w odległości około 2 - 3 mm od obrzeża formy. Całkowicie napełnij formę roztworem blokującym i przykryj folią nad głową. Należy pamiętać, że roztwór blokujący nieznacznie się skurczy po polimeryzacji.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Aby wysuszyć bloki, umieść je w pudełku z suchym żelem krzemionkowym i pozostaw co najmniej na noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Przygotuj szklane noże ze szklanych prętów za pomocą nożownika. Użyj szklanych noży do cięcia tkanek. Pokrój szklany pręt w kwadrat, a następnie przetnij kwadrat po przekątnej, aby uzyskać dwa noże, za pomocą diamentowego narzędzia do nacinania.</li>
	<li>Cięcie bloków na plastry o szerokości 2 - 3 μm za pomocą maszyny do cięcia. Umieść plastry na szkiełku podstawowym na kropelkach wody destylowanej i umieść szkiełko na bloku grzewczym ustawionym na małe ciepło (50 - 60 °C), aż woda odparuje.</li>
</ol>
7. Przygotowanie preparatu do mikroskopu polaryzacyjnego
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór Richardsona (patrz 2.1) do 0,2% pierwotnego roztworu i użyć 1 ml do przykrycia plastrów. Umieść na bloku grzewczym na 5 sekund, a następnie umyj wodą destylowaną.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełko na gorącej płycie. Obserwuj pod lunetą sekcyjną i zaznacz tył szkiełka markerem, aby wskazać położenie interesujących nas wycinków, aby ułatwić ich późniejszą identyfikację pod mikroskopem.</li>
	<li>Dodać 100 μl podłoża montażowego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
8. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zakryte szkiełko zawierające sekcje korzeniowe należy umieścić pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w system Polscope odpowiedni do uzyskiwania informacji o opóźnieniu oraz polaryzator/interferencyjny filtr optyczny (Rysunek 1 A-D).</li>
	<li>Wybierz powiększenie, które umożliwia wyraźną wizualizację całej próbki (np. 40X w tym badaniu) i ustaw ostrość mikroskop na pustym polu, które zawiera przekrój bloku, ale nie ma przekroju głównego. Spróbuj znaleźć czysty obszar bez skaz. Użyj tego regionu, aby ustawić tło.</li>
	<li>Ustaw parametry systemu obrazowania i oprogramowania: Ustaw zakres na 17 nm. Zastosuj "Automatyczną ekspozycję" i uzyskaj obraz tła z pustego pola (patrz 8.2). W każdym eksperymencie używany jest jeden obraz tła.</li>
</ol>
9. Analiza Polscope orientacji mikrofibryli celulozy
<ol>
	<li>Analiza przekrojów podłużnych.
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełko zawierające przekroje podłużne pod mikroskopem i uzyskać jego obraz opóźnienia. Ustaw ostroskop na interesującym Cię wycinku korzenia. Podaj nową nazwę pliku.</li>
		<li>Przechwyć obraz abrio (obraz z informacją o opóźnieniu) przez okno "Live Abrio". Pamiętaj, aby uchwycić przekrój zawierający ścianę komórkową, którą można zidentyfikować po barwionej celulozie biegnącej wzdłuż obwodu komórki, jak pokazano na rysunku 2C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazu.
	<ol>
		<li>Kliknij dwukrotnie odpowiedni obraz w stosie obrazów. Wybierz "Orientacja Pseudo kolor" w zakładce "Ustawienia wyświetlania".</li>
		<li>Aby oszacować kąt mikrofibryli celulozy, dopasuj odpowiedni odcień ściany komórkowej do odcienia na kole kolorów. 
		UWAGA: Koło kolorów na rysunku 2C odbija powolną oś światła leżącą wzdłuż mikrofibryli, która wskazuje kierunek wzdłuż długiej osi mikrofibryli. Kąt mikrowłókien celulozowych to kąt wskazywany przez kolor i długą oś komórki. Na przykład wydłużająca się komórka we wstawce ma kolor niebieskozielony, nachylony o około 90° do długiej osi komórek.</li>
		<li>Aby określić ilościowo średni kąt mikrofibrylowy w ścianie komórkowej, użyj narzędzia "Opóźnienie i znacznik azymutu" z paska narzędzi oprogramowania. Wybierając narzędzie, wskaż i kliknij obszar zainteresowania w uzyskanym obrazie. 
		UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie kątów (azymutu) w stopniach (Rysunek 2C).</li>
		<li>W alternatywnym oprogramowaniu do analizy obrazu w świetle spolaryzowanym o otwartym dostępie, wtyczkę "Pol-Analyzer" z menu wtyczek. W nowo otwartym oknie wybierz zakładkę "Birefringence" i otwórz, a następnie zapisz plik tła i plik obrazu.</li>
		<li>W oknie obrazu wybierz "Specyfikacje" i dostosuj "Rozmiar piksela ROI" (użyj 5 pikseli w tym badaniu). W oknie "Specyfikacje" wybierz opcję "pokaż wartości w tabeli wyników".</li>
		<li>Użyj narzędzia Wielokąt, aby oznaczyć obszar zainteresowania w oknie obrazu. Wybierz "Linie orientacyjne", aby uzyskać orientację mikrofibrylu celulozy. 
		UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie kątów (azymutu) w stopniach. 
		UWAGA: Średni kąt obliczony jedną z dwóch metod należy następnie znormalizować do położenia sekcji głównej wzdłuż suwaka. Aby skorygować odchylenie od poziomego położenia całego odcinka korzenia wzdłuż szkiełka, określ ilościowo średni kąt mikrofibrylowy ściany komórkowej flankującej komórkę wzdłuż jej długiej osi (tj. prostopadłej do przekroju i wzdłuż osi wzrostu korzenia, rysunek 2C). Kąt ten wynosi 180°, gdy sekcja korzeniowa jest dokładnie ustawiona wzdłuż suwaka. Aby obliczyć kąt mikrofibryli, odejmij średni zmierzony kąt mikrofibrylowy flankującej ściany komórkowej od 180°. Dodaj uzyskaną różnicę do średniego zmierzonego kąta mikrofibryli ściany komórkowej, która leży płasko na szkiełku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Analiza Polscope akumulacji celulozy krystalicznej
<ol>
	<li>Użyj przekrojów poprzecznych (poprzecznych). Należy zauważyć, że akumulację celulozy krystalicznej można porównać między komórkami tylko wtedy, gdy ich mikrofibryle celulozy są ustawione pod podobnym kątem (jak określono w 9).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie odpowiedni obraz w stosie obrazów. Wybierz "Pseudo kolor" w zakładce "Ustawienia wyświetlania".</li>
	<li>Do pomiaru opóźnienia. Powiększ obraz. Wybierz "Region" i zaznacz wszystkie regiony zainteresowania. Przejdź do zakładki "pomiary" i "Kopiuj do schowka" wszystkie wartości.
	<ol>
		<li>Przenieś dane do Excela i wyodrębnij wymagane informacje (średni obszar opóźnienia). Normalizacja danych. 
		UWAGA: Aby uwzględnić różnice w grubości między plasterkami, należy wyrazić wartości względem określonej krawędzi ściany komórkowej na slajdzie. Aby znormalizować, podziel średnią opóźnienie odpowiadającą ścianie komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania przez średnią opóźnienie innej ściany komórkowej na tym samym obrazie. Na przykład zewnętrzna ściana komórkowa naskórka została znormalizowana do wewnętrznej ściany komórkowej kory mózgowej w naszym badaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz pomiary dla co najmniej 3 odcinków na korzeń, przy czym co najmniej 3 pierwiastki na próbkę.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li>
<li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM%2C+XRD%2C+NMR+and+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresources%22%5BJournal%5D)">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li>
<li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling%2C+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li>
<li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.+A-2%3A+Polymer+Physics%22%5BJournal%5D)">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li>
<li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li>
<li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Arabidopsis+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li>
<li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li>
<li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control%3A+brassinosteroid+activity+gets+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li>
<li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li>
<li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li>
<li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

W tym miejscu przedstawiono metodę oznaczania akumulacji celulozy krystalicznej w różnych tkankach tworzących korzenie rzodkiewnika , przy zachowaniu informacji anatomicznej. W związku z tym stanowi on dodatkowy krok w kierunku zrozumienia procesów wzrostu roślin w rozdzielczości komórkowej. Metoda ta może być również stosowana do badania dodatkowych gatunków roślin i organów.
Podczas stosowania tej metody należy wziąć pod uwagę kilka punktów. Po pierwsze, akumulacja celulozy krystali...

Roślinna ściana komórkowa jest dynamiczną strukturą. Rosnące komórki są otoczone pierwotną ścianą komórkową, której organizacja umożliwia ekspansję komórek. Komórki, które przestają rosnąć, pozostawiają sztywniejszą ścianę wtórną, która zwiększa mechaniczne podparcie rośliny. Obie ściany komórkowe składają się z mikrowłókien celulozy osadzonych w matrycy polisacharydów o różnych strukturach (np. hemicelulozie i pektynie), które różnią się w zależności od etapu rozwoju i tkanek1,2. Celuloza jest syntetyzowana jako łańcuchy (1,4)-β-D-glukanu, które są ściśle ustawione, tworząc mikrofibrylę struktury krystalicznej. Celuloza amorficzna odnosi się do regionów, w których łańcuchy glukanu są mniej uporządkowane. Stosunek między domenami krystalicznymi i amorficznymi jest jednym z parametrów, o których uważa się, że wpływają na właściwości mechaniczne ściany komórkowej, zapewniając odpowiednio wytrzymałość mechaniczną i charakterystykę lepkosprężystości3. Opracowano kilka metod wykrywania i ilościowego określania dwóch form ułożenia celulozy, wśród nich dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego i polaryzacja krzyżowa/magiczny kąt wirowania ciała stałego NMR4. Dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego można wykorzystać do określenia proporcji krystalicznych i amorficznych domen celulozy w próbce5. Alternatywna metoda wykorzystuje frakcjonowanie zawartości ściany komórkowej na materiał nierozpuszczalny w kwasach i rozpuszczalny w kwasach, w celu rozróżnienia odpowiednio celulozy krystalicznej i amorficznej lub innych polimerów. W tym podejściu włączenie znakowanej glukozy ([14C] glukozy) stosuje się do ilościowego określenia celulozy6,7. Metody te wymagają w najlepszym razie dużych ilości materiału roślinnego do analiz całych narządów, a zatem są niewystarczająco wrażliwe na specyficzne dla tkanek zmiany w strukturze ściany komórkowej. Wizualizację mikrowłókien celulozy w rozdzielczości komórkowej można uzyskać w badaniach obrazowania na żywo w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi8,9, które mogą zidentyfikować zmiany w orientacji mikrowłókien celulozy. Jednak barwniki te nie są używane do oznaczania ilościowego, nie są specyficzne dla celulozy krystalicznej i mogą zakłócać normalną strukturę ściany komórkowej8. Polscope to technika obrazowania, która opiera się na zdolności celulozy krystalicznej do rozszczepiania wiązek światła i opóźniania części światła10. Opóźnienie światła jest najsilniejsze w przypadku mikrofibryli, które leżą prostopadle do kierunku rozchodzenia się światła. W przypadku mikrowłókien o podobnej orientacji, im wyższy stopień krystaliczności, tym większa unieruchomienie światła11. W związku z tym polscope jest używany do badania zarówno względnych poziomów, jak i orientacji mikrowłókien celulozy.
Korzenie wykazują liniowy wzrost, podczas którego komórki pochodzące z niszy komórek macierzystych, na końcu korzenia, przechodzą serię podziałów komórkowych, zanim gwałtownie się rozrosną12. Komórki tworzące korzeń rozszerzają się w sposób jednokierunkowy (anizotropowy), zgodnie z dyktatem małocząsteczkowych hormonów sygnalizacyjnych, które wpływają na właściwości ściany komórkowej13. Zróżnicowane reakcje na hormony, w czasie i przestrzeni, dostarczają środków do zapewnienia zrównoważonego wzrostunarządów14. W związku z tym analiza struktury ściany komórkowej w wysokiej rozdzielczości może dostarczyć ważnych informacji niezbędnych do lepszego zrozumienia związku między specyficznymi dla typu komórek reakcjami na wzrost całego narządu. W niniejszym artykule przedstawiamy implementację polscope do badania specyficznej tkankowo akumulacji celulozy krystalicznej w korzeniach rzodkiewnika, obserwowanej w wysokiej jakości przekrojach anatomicznych. Metoda ta ujawniła niedawno specyficzną dla typu komórki akumulację krystalicznej celulozy w odpowiedzi na przestrzenne zaburzenia aktywności hormonalnej15.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Boraks</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td></td><td></td> strzykawkowy 0,22 mm strzykawkowy 0,22 mm Azure Sigma 861065<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Leica historesin&nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>formy do zatapiania</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &micro; P.P.C.&nbsp;</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>folia górna</td></tr><tr><td>Nożyce</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td>Mikroskop średnioświetlny z montażem</td> <td>Thermo</td><td>9990402</td></tr> System obrazowania <tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio System obrazowania</td><td>CRI</td><td>Abrio Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 Oprogramowanie</td><td></td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu w świetle spolaryzowanym z otwartym dostępem &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową, której skład decyduje o ich ostatecznym rozmiarze i kształcie. Ściana komórkowa składa się ze złożonej matrycy zawierającej polisacharydy, które obejmują mikrofibryle celulozy, które tworzą zarówno struktury krystaliczne, jak i łańcuchy celulozowe o organizacji amorficznej. Orientacja włókien celulozowych i ich stężenia dyktują właściwości mechaniczne ogniwa. Do określania poziomów celulozy krystalicznej stosuje się kilka metod, z których każda ma zarówno zalety, jak i ograniczenia. Niektórzy potrafią rozróżnić proporcje regionów krystalicznych w całkowitej celulozie. Są one jednak ograniczone do analiz całych narządów, w których brakuje informacji czasoprzestrzennych. Inne, opierające się na obrazowaniu na żywo, są ograniczone przez użycie nieprecyzyjnych barwników. W tym miejscu przedstawiamy czuły system oparty na spolaryzowanym świetle do specyficznej kwantyfikacji względnego opóźnienia światła, reprezentujący akumulację krystalicznej celulozy w przekrojach korzeni Arabidopsis thaliana. W tej metodzie zachowana jest rozdzielczość komórkowa i dane anatomiczne, co umożliwia bezpośrednie porównania między różnymi tkankami tworzącymi rosnący korzeń. Podejście to otwiera nowy wymiar analityczny, rzucając światło na związek między składem ściany komórkowej, zachowaniem komórek i wzrostem całych narządów.

Badamy wpływ specyficznych dla typu komórek odpowiedzi na brassinosteroidy (BR), wykorzystując korzeń Arabidopsis jako organ modelowy15-17. Gdy receptor BR, BRI1, jest kierowany w tle mutanta bri1 do podzbioru komórek epidermy zwanych komórkami bezwłoskowymi (Rysunek 2A,B), hamuje on jednokierunkową ekspansję komórek sąsiednich oraz wzrost całego korzenia15. W celu ujawnienia mechanizmu leżącego u podstaw tego hamowania przeprowadzo...

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Ogólnym celem przygotowania tego przekroju anatomicznego jest ilościowe określenie wzglomnego gromadzenia się kryształów i celulozy w rozdzielczości komórkowej, co umożliwia bezpośrednie porównania między różnymi tkankami w pierwotnym korzeniu Arabidopsis. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny fizjologii i rozwoju roślin, takie jak wpływ składu komórkowego danego typu komórek na wzrost całego organu. Po wysterylizowaniu nasion Arabidopsis zgodnie z protokołem tekstowym, należy rozłożyć sterylne nasiona na płytkach zawierających 0,8% agar roślinny i pożywkę 0,5XM.Zawiń płytki parafilmem i przykryj folią aluminiową. Przechowuj płytki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez jeden do czterech dni, aby zapewnić jednorodne kiełkowanie. Następnie przenieś płytki do komory wzrostu odpowiedniej do hodowli siewek Arabidopsis, ustawiając płytki pionowo, aby utrzymać wzrost korzeni na powierzchni podłoża agarowego. Przygotuj roztwór Richardsona zgodnie z protokołem tekstowym. Przed użyciem przefiltruj roztwór przez jednostkę filtrującą PVD 0,22 mikrona sterowaną strzykawką.Następnie, pracując pod wyciągiem chemicznym, przygotuj 50 mililitrów utrwalacza, łącząc 38 ml 0,5M kodylanu sodu z 2,5 ml glutaraldehydu. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu Richardson's do roztworu utrwalającego, aby otrzymać końcowy roztwór do utrwalania. Używając wcześniej oznakowanej płytki, nalej od 2 do 3 ml końcowego roztworu do dołków w taki sposób, aby roztwór całkowicie przykrył siewki.Używając plastikowej pęsety, ostrożnie przenieś do każdej studzienki do 10 siewek. Użyj parafilmu do uszczelnienia płytek przed przechowywaniem w ciemności w temperaturze 4 °C przez co najmniej jedną noc i maksymalnie jeden tydzień. Aby odwodnić utrwalone siewki, użyj pęsety, aby podnieść rośliny i przenieś je do studzienek nowych, oznakowanych płytek sześcio-studzienkowych zawierających wzrastające stężenia etanolu przez czas wymieniony tutaj.Przygotować medium infiltracyjne w małej szklanej butelce, mieszając zawartość jednej torebki aktywatora Historesin z 50ml podstawowej żywicy płynnej. Włożyć magnes i mieszać roztwór na mieszalce magnetycznej przez 20 minut. Napełnić oznaczone studzienki płytki sześciostudzienkowej od 2 do 3 ml medium infiltracyjnego.Gdy siewki zostaną całkowicie odwodnione, należy użyć pęsety, aby przenieść je z 95% ethanol do medium infiltracyjnego, upewniając się, że są one w pełni przykryte medium. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsius przez co najmniej cztery dni, aby zapewnić maksymalną penetrację tkanek roślinnych. W celu przygotowania bloków, do każdej formy do zatapiania należy włożyć małe etykiety z zapisanymi ołówkiem nazwami próbek.Przygotuj medium do zatapiania, dodając 1ml utwardzacza do 15ml medium do infiltracji. Wypełnij połowę każdego otworu w formie około 200 mikrolitrami medium do zatapiania. Następnie przykryj formę kawałkiem folii, dodając dodatkowo 1ml po każdej stronie.Inkubuj formy w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić częściową polimeryzację. Następnie przygotuj dodatkową partię medium do zatapiania i utrzymuj je w niskiej temperaturze, aby zapobiec polimeryzacji podczas rozmieszczania wierzchołków korzeni w formie. Nalej medium do zatapiania na małą płytkę i umieść w medium jedną siewkę.Pod stereomikroskopem należy za pomocą skalpela odciąć każdy wierzchołek korzenia, a następnie bardzo ostrożnie umieścić go w formie w odległości około 2 do 3 mm od jej krawędzi – pionowo w przypadku przekrojów poprzecznych lub poziomo dla przekrojów podłużnych. Po ułożeniu tkanki należy całkowicie wypełnić formę medium do zatopienia i przykryć ją folią ochronną. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny. Aby osuszyć bloczki, należy umieścić je w eksykatorem z suchym żelem krzemionkowym i pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.Używając przecinaka do szkła wyposażonego w diamentowy rylec, przygotuj noże szklane z prętów szklanych, odcinając z pręta kwadrat, a następnie przecinając go po przekątnej, aby uzyskać dwa noże. Sprawdź, czy oba noże mają ostre krawędzie. Zamocuj blok w uchwycie.Następnie, używając jednostronnego ostrza przemysłowego, usuń nadmiar materiału z bloku do odległości jednego mm od wierzchołka korzenia, aby uzyskać kształt piramidy. Podziel ukształtowany blok na plastry o szerokości od 2 do 3 mikronów i przenieś je na oznakowane szkiełko przedmiotowe. Następnie nanieś krople wody na plastry.Ważne jest przygotowanie przekrojów o jednolitej szerokości, aby zminimalizować zmienność analizowanych danych. Umieść szkiełka przedmiotowe na blokach grzejnych ustawionych na niską temperaturę, aż woda odparuje. Aby przygotować preparaty do oglądania pod mikroskopem polaryzacyjnym, rozcieńcz roztwór Richardsona do 2% pierwotnego stężenia i użyj około 1 ml, aby pokryć przekroje.Następnie umieść próbki na bloku grzejnym na 5 sekund i przemyj je wodą destylowaną. Po wysuszeniu szkiełek na płycie grzejnej obejrzyj skrawki pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą markera zaznacz na rewersie szkiełka położenie interesujących skrawków. Przed nałożeniem szkiełka cover slip dodaj 100 µL medium montażowego.Należy wykonać obrazowanie i analizę zgodnie z protokołem tekstowym. Przedstawiony tutaj przekrój poprzeczny korzenia głównego Arabidopsis wykazuje radialną organizację jego komórek i tkanek, w tym komórek nietworzących włośników, komórek tworzących włośniki oraz kory. Ten obraz konfokalny pokazuje ekspresję BRI1-GFP w komórkach nietworzących włośników w tle mutanta BRI1, co hamuje jednokierunkową ekspansję sąsiednich komórek oraz wzrost całego korzenia.Jak widać tutaj, przekroje podłużne korzeni uzyskane z typu dzikiego oraz z linii wykazujących ekspresję BRI1 w komórkach bezwłoskowych wykazały podobną orientację mikrofibryli celulozy, z dużą zmiennością kątów w komórkach merystematycznych w porównaniu do komórek w strefie przejściowej. Umożliwia to porównanie wzglomnej akumulacji kryształów w celulozie w odpowiadających sobie komórkach merystematycznych i elongacyjnych w dwóch tła genetycznych, co przedstawiono tutaj w przekrojach poprzecznych i co ujawnia korelację między ekspresją BRI1 w komórkach bezwłoskowych a wysoką lokalną akumulacją kryształów w celulozie. Generalnie osoby nieznające tej metody mogą mieć trudności podczas oglądania filmów, ponieważ uzyskanie dobrze zorientowanych korzeni podczas procedury zatapiania w medium jest wymagające.Z tego powodu do sekcjonowania należy przygotować kilka bloków. Po opanowaniu techniki, sekcjonowanie pojedynczego bloku zajmuje od 2 do 3 godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że akumulacja kryształów w celulozie jest porównywalna między komórkami, jeśli mają one podobną orientację mikrowłókien celulozowych, co określa się na podstawie przekrojów podłużnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób utrwalania siewek Arabidopsis, ich zatapiania w blokach oraz późniejszego przygotowywania podłużnych i poprzecznych przekrojów korzeni. Powinni Państwo również uzyskać wgląd w dane, jakie można uzyskać dzięki zastosowaniu mikroskopii w świetle spolaryzowanym.

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób materiał roślinny do immunolokalizacji białek i pektyn Arabinogalaktanu jest utrwalony, osadzony w hydrofilowej żywicy akrylowej, podzielony na sekcje i zamontowany na szkiełkach podstawowych. Pokazujemy, że epitopy związane ze ścianą komórkową zostaną wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał.

Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę kwantyfikacji krystalicznej celulozy w korzeniach Arabidopsis przy użyciu mikroskopii światła spolaryzowanego. Technika ta umożliwia analizę składu ścian komórkowych na poziomie komórkowym.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Przeglądaj więcej filmów