In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie zaadsorbowanych warstw białkowych w roztworach wodnych przy użyciu systemu do analizy na granicy faz cieczy i spektrometrii mas jonów wtórnych w czasie przelotu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biomolekuł i biointerfejsu. Na przykład charakterystyka zaadsorbowanych białek na powierzchni ciała stałego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że biomolekuły można uruchomić in situ w środowisku ciekłym oraz w połączeniu z mapowaniem molekularnym. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biomolekuły na granicy faz ciało stałe-ciecz, może być również stosowana w innych systemach, w tym w badaniach pojedynczych komórek nowotworowych, interakcjach leków i przyłączaniu biofilmów. Do pięciomililitrowej strzykawki wlej dwa mililitry 70% roztworu etanolu.

Podłączyć strzykawkę do końcówki wlotowej urządzenia SALVI i powoli wstrzykiwać jeden mililitr płynu w ciągu 10 minut. Pod koniec wstrzyknięcia wyjąć strzykawkę i połączyć wlot i wylot SALVI za pomocą złącza polieterowo-eterowo-ketonowego. Utrzymuj mikrokanał SALVI wypełniony 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.

Następnie napełnij drugą strzykawkę sterylną wodą dejonizowaną. Podłącz go do wlotu SALVI i powoli wstrzykuj dejonizowaną wodę do urządzenia w ciągu 10 minut. Wyjąć strzykawkę i ponownie połączyć ze sobą wlot i wylot urządzenia.

Aby unieruchomić film białkowy, zacznij od pobrania dwóch mililitrów roztworu fibronektyny do strzykawki. Podłączyć strzykawkę do wlotu urządzenia SALVI i powoli wstrzykiwać jeden mililitr płynu w ciągu 10 minut. Następnie wyjąć strzykawkę i ponownie podłączyć wlot i wylot.

Inkubować zestaw w czystym naczyniu hodowlanym w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po inkubacji powoli wstrzykuj jeden mililitr sterylnej wody dejonizowanej w ciągu 10 minut, a następnie ponownie podłącz wlot do wylotu. Aby rozpocząć, połóż stolik ToF-SIMS na płaskiej, czystej powierzchni.

Umieść urządzenie SALVI na stoliku z płytką krzemową i membraną z azotku krzemu skierowanymi do góry. Przymocuj urządzenie SALVI do stage za pomocą czterech metalowych clampelementy i przykręć metalowe elementy przytrzymujące róg urządzenia do metalowej płytki za pomocą czterech. Następnie delikatnie zwiń rurkę PFTE podłączoną do kanału mikroprzepływowego.

Użyj czterech metalowych elementów i czterech, aby przytrzymać sztywną część. Upewnij się, że urządzenie jest umieszczone na otwartej przestrzeni na stoliku, tak aby nie zakłócało pierwotnej wiązki jonów podczas analizy. Następnie zamontuj kubek Faradaya na stoliku za pomocą.

Następnie otwórz drzwi zamka ładunkowego ToF-SIMS i ustaw stolik poziomo na platformie ładunkowej przed zamknięciem drzwi. Włącz pompę próżniową i pozwól, aby komora loadlock pompowała do około 10 do minus szóstego milibara. Następnie, po około 30 minutach, po ustabilizowaniu się próżni, należy przenieść urządzenie SALVI do komory głównej.

Dostosuj pierwotną wiązkę jonów i analizator ToF-SIMS, aby uzyskać rozdzielczość przestrzenną około 400 nanometrów, postępując zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Następnie znajdź kanał mikroprzepływowy za pomocą mikroskopu optycznego. Użyj centrum obrazu optycznego jako odniesienia i wyrównaj je tak, aby było spójne ze środkiem obrazu jonów wtórnych.

Wizualna demonstracja tego kroku ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest trudna do nauczenia, ponieważ próbka jest grubsza niż normalne próbki stałe i trudno jest dostosować ustawienia, aby znaleźć najlepszą ostrość kanału. Przed każdym pomiarem użyj wiązki tlenu o mocy jednego kiloelektronowoltów, aby skanować okienko azotku krzemu przez około 15 sekund, aby usunąć zanieczyszczenie powierzchni. Użyj również pistoletu do powodzi elektronowej, aby skompensować ładunek powierzchniowy podczas wszystkich pomiarów.

Następnie wybierz tryb dodatni lub ujemny przed rozpoczęciem pobierania danych. Użyj 25 kiloelektronowoltów bizmutu trzy plus jako pierwotnej wiązki jonów we wszystkich pomiarach. Aby uzyskać profilowanie głębokości, zeskanuj pierwotną wiązkę jonów na okrągłym obszarze o średnicy około dwóch mikrometrów z rozdzielczością 32 pikseli na 32 piksele.

Aby zminimalizować czas potrzebny do przebicia membrany z azotku krzemu, należy użyć wiązki jonów pierwotnych o dużej szerokości impulsu. Po przebiciu membrany z azotku krzemu utrzymuj ten sam prąd przez około 200 sekund, aby uzyskać wystarczające dane do dwuwymiarowej rekonstrukcji obrazu. W celu zebrania danych zmniejsz szerokość impulsu do 80 nanosekund, aby uzyskać widma o lepszej rozdzielczości masy.

Kontynuuj tę akwizycję przez około 200 sekund. Korzystając z interfejsu mikroprzepływowego SALVI, pierwotna wiązka jonów może bezpośrednio bombardować uwodnioną warstwę fibronektyny. Szereg klastrów wodnych i fragmentów aminokwasów jest wskazywanych przez dane specyfikacji masy ToF-SIMS.

Dostarcza to bezpośrednich dowodów na właściwości cząsteczek wody otaczających i znajdujących się wewnątrz uwodnionych cząsteczek białka. Tutaj można zobaczyć szeregi czasowe profilu głębokości uwodnionego filmu fibronektyny i wody dejonizowanej. Intensywność wybranych jonów drugich jest znikoma przed przebiciem membrany z azotku krzemu.

Po przebiciu membrany z azotku krzemu intensywność jonów wtórnych znacznie wzrasta. Proces krótkiej szerokości impulsu służy do uzyskiwania danych o lepszej rozdzielczości masowej do rekonstrukcji obrazu i widma. Obrazy 2D z uwodnionej warstwy fibronektyny i wody dejonizowanej reprezentują liczbę wybranych jonów wtórnych z próbki.

Im jaśniejszy obraz, tym wyższa liczba jonów wtórnych. Te intuicyjne obrazy dają wyraźne porównanie wybranych jonów wtórnych między różnymi próbkami, co jest pomocne w analizie danych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że mikroreaktor musi być szczelny przed zainstalowaniem w komorze próżniowej.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią i biointerfejsami do zbadania adsorpcji białek, przyłączania biofilmu, monowarstw składanych na powierzchni i wielu innych zjawisk. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać różne próbki cieczy za pomocą SALVI i płynnego ToF-SIMS.