In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS
15 lutego 2016
Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.
Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie zaadsorbowanych warstw białkowych w roztworach wodnych przy użyciu systemu do analizy na granicy faz cieczy i spektrometrii mas jonów wtórnych w czasie przelotu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biomolekuł i biointerfejsu. Na przykład charakterystyka zaadsorbowanych białek na powierzchni ciała stałego.
Główną zaletą tej techniki jest to, że biomolekuły można uruchomić in situ w środowisku ciekłym oraz w połączeniu z mapowaniem molekularnym. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biomolekuły na granicy faz ciało stałe-ciecz, może być również stosowana w innych systemach, w tym w badaniach pojedynczych komórek nowotworowych, interakcjach leków i przyłączaniu biofilmów. Do pięciomililitrowej strzykawki wlej dwa mililitry 70% roztworu etanolu.
Podłączyć strzykawkę do końcówki wlotowej urządzenia SALVI i powoli wstrzykiwać jeden mililitr płynu w ciągu 10 minut. Pod koniec wstrzyknięcia wyjąć strzykawkę i połączyć wlot i wylot SALVI za pomocą złącza polieterowo-eterowo-ketonowego. Utrzymuj mikrokanał SALVI wypełniony 70% roztworem etanolu w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.
Następnie napełnij drugą strzykawkę sterylną wodą dejonizowaną. Podłącz go do wlotu SALVI i powoli wstrzykuj dejonizowaną wodę do urządzenia w ciągu 10 minut. Wyjąć strzykawkę i ponownie połączyć ze sobą wlot i wylot urządzenia.
Aby unieruchomić film białkowy, zacznij od pobrania dwóch mililitrów roztworu fibronektyny do strzykawki. Podłączyć strzykawkę do wlotu urządzenia SALVI i powoli wstrzykiwać jeden mililitr płynu w ciągu 10 minut. Następnie wyjąć strzykawkę i ponownie podłączyć wlot i wylot.
Inkubować zestaw w czystym naczyniu hodowlanym w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po inkubacji powoli wstrzykuj jeden mililitr sterylnej wody dejonizowanej w ciągu 10 minut, a następnie ponownie podłącz wlot do wylotu. Aby rozpocząć, połóż stolik ToF-SIMS na płaskiej, czystej powierzchni.
Umieść urządzenie SALVI na stoliku z płytką krzemową i membraną z azotku krzemu skierowanymi do góry. Przymocuj urządzenie SALVI do stage za pomocą czterech metalowych clampelementy i przykręć metalowe elementy przytrzymujące róg urządzenia do metalowej płytki za pomocą czterech. Następnie delikatnie zwiń rurkę PFTE podłączoną do kanału mikroprzepływowego.
Użyj czterech metalowych elementów i czterech, aby przytrzymać sztywną część. Upewnij się, że urządzenie jest umieszczone na otwartej przestrzeni na stoliku, tak aby nie zakłócało pierwotnej wiązki jonów podczas analizy. Następnie zamontuj kubek Faradaya na stoliku za pomocą.
Następnie otwórz drzwi zamka ładunkowego ToF-SIMS i ustaw stolik poziomo na platformie ładunkowej przed zamknięciem drzwi. Włącz pompę próżniową i pozwól, aby komora loadlock pompowała do około 10 do minus szóstego milibara. Następnie, po około 30 minutach, po ustabilizowaniu się próżni, należy przenieść urządzenie SALVI do komory głównej.
Dostosuj pierwotną wiązkę jonów i analizator ToF-SIMS, aby uzyskać rozdzielczość przestrzenną około 400 nanometrów, postępując zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Następnie znajdź kanał mikroprzepływowy za pomocą mikroskopu optycznego. Użyj centrum obrazu optycznego jako odniesienia i wyrównaj je tak, aby było spójne ze środkiem obrazu jonów wtórnych.
Wizualna demonstracja tego kroku ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest trudna do nauczenia, ponieważ próbka jest grubsza niż normalne próbki stałe i trudno jest dostosować ustawienia, aby znaleźć najlepszą ostrość kanału. Przed każdym pomiarem użyj wiązki tlenu o mocy jednego kiloelektronowoltów, aby skanować okienko azotku krzemu przez około 15 sekund, aby usunąć zanieczyszczenie powierzchni. Użyj również pistoletu do powodzi elektronowej, aby skompensować ładunek powierzchniowy podczas wszystkich pomiarów.
Następnie wybierz tryb dodatni lub ujemny przed rozpoczęciem pobierania danych. Użyj 25 kiloelektronowoltów bizmutu trzy plus jako pierwotnej wiązki jonów we wszystkich pomiarach. Aby uzyskać profilowanie głębokości, zeskanuj pierwotną wiązkę jonów na okrągłym obszarze o średnicy około dwóch mikrometrów z rozdzielczością 32 pikseli na 32 piksele.
Aby zminimalizować czas potrzebny do przebicia membrany z azotku krzemu, należy użyć wiązki jonów pierwotnych o dużej szerokości impulsu. Po przebiciu membrany z azotku krzemu utrzymuj ten sam prąd przez około 200 sekund, aby uzyskać wystarczające dane do dwuwymiarowej rekonstrukcji obrazu. W celu zebrania danych zmniejsz szerokość impulsu do 80 nanosekund, aby uzyskać widma o lepszej rozdzielczości masy.
Kontynuuj tę akwizycję przez około 200 sekund. Korzystając z interfejsu mikroprzepływowego SALVI, pierwotna wiązka jonów może bezpośrednio bombardować uwodnioną warstwę fibronektyny. Szereg klastrów wodnych i fragmentów aminokwasów jest wskazywanych przez dane specyfikacji masy ToF-SIMS.
Dostarcza to bezpośrednich dowodów na właściwości cząsteczek wody otaczających i znajdujących się wewnątrz uwodnionych cząsteczek białka. Tutaj można zobaczyć szeregi czasowe profilu głębokości uwodnionego filmu fibronektyny i wody dejonizowanej. Intensywność wybranych jonów drugich jest znikoma przed przebiciem membrany z azotku krzemu.
Po przebiciu membrany z azotku krzemu intensywność jonów wtórnych znacznie wzrasta. Proces krótkiej szerokości impulsu służy do uzyskiwania danych o lepszej rozdzielczości masowej do rekonstrukcji obrazu i widma. Obrazy 2D z uwodnionej warstwy fibronektyny i wody dejonizowanej reprezentują liczbę wybranych jonów wtórnych z próbki.
Im jaśniejszy obraz, tym wyższa liczba jonów wtórnych. Te intuicyjne obrazy dają wyraźne porównanie wybranych jonów wtórnych między różnymi próbkami, co jest pomocne w analizie danych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że mikroreaktor musi być szczelny przed zainstalowaniem w komorze próżniowej.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią i biointerfejsami do zbadania adsorpcji białek, przyłączania biofilmu, monowarstw składanych na powierzchni i wielu innych zjawisk. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać różne próbki cieczy za pomocą SALVI i płynnego ToF-SIMS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół charakteryzacji zaadsorbowanych filmów białkowych w roztworach wodnych przy użyciu spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu. Metoda ta umożliwia analizę biomolekuł in situ na granicy faz ciało stałe-ciecz, dostarczając informacji na temat różnych układów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Spektrometria mas
- Analiza biomolekularna
Wstęp
- Charakteryzacja biomolekuł jest kluczowa dla zrozumienia ich oddziaływań.
- Wtórna spektrometria mas jonów z pomiarem czasu przelotu umożliwia szczegółowe mapowanie molekularne.
- Metodę tę można zastosować w różnych układach, w tym w komórkach nowotworowych oraz przy badaniu oddziaływań leków.
- Analiza in situ pozwala na lepsze zrozumienie biomolekuł w ich naturalnym środowisku.
Cel badania
- Opracowanie protokołu pipetowania cieczy i wprowadzania próbek.
- Analiza biomolekuł białkowych w roztworach wodnych.
- Zapewnienie wglądu w zachowanie biomolekuł na biointerfejsach.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie systemu do analizy na granicy faz ciecz-próżnia.
- Wtórna spektrometria mas jonów metodą czasu przelotu w analizie.
- Przygotowanie próbek z wykorzystaniem 70% roztworu etanolu.
- Charakterystyka in situ zaadsorbowanych białek.
Główne wyniki
- Pomyślne wprowadzenie próbek do mikrokanałów w celu przeprowadzenia analizy.
- Charakterystyka białek zaadsorbowanych na powierzchniach stałych.
- Wgląd w oddziaływania biomolekuł w środowiskach ciekłych.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad rakiem oraz w badaniach nad oddziaływaniami leków.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia efektywną analizę biomolekuł białkowych.
- Analiza in situ dostarcza cennych informacji na temat zachowania biomolekuł.
- Metodę tę można dostosować do różnych zastosowań w badaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośrednią charakterystykę molekularną uwodnionych białek w ich natywnym środowisku wodnym, co wypełnia istotną lukę w analizie biointerfejsów. Dzięki zachowaniu stanu hydratacji białek podczas analizy ToF-SIMS, dostarcza ona wglądu w mechanizmy adsorpcji biomolekularnej oraz oddziaływania woda-białko, które są istotne dla walidacji celu terapeutycznego. Podejście to wspiera wczesne etapy odkrywania leków, dostarczając rozdzielczych przestrzennie danych chemicznych, które pomagają w funkcjonalnej ocenie celu i zmniejszają niepewność podczas identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów adsorpcji białek na granicach faz ciało stałe-ciecz w fizjologicznych warunkach hydratacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośrednią detekcję fragmentów aminokwasów i sygnatur klastrów wody w celu potwierdzenia obecności i konformacji białka.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka projektowego poprzez ujawnienie wpływu warstw hydratacji na oddziaływania biomolekularne z powierzchnią.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie bezetykietowych map molekularnych rozmieszczenia białek z rozdzielczością przestrzenną ~400 nm w celu charakterystyki powierzchni testowych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych pomiarów liczby jonów wtórnych, co pozwala na ocenę powtarzalności w różnych warunkach immobilizacji białek.
- Gotowość testowa: Ułatwia przygotowanie powierzchni do screeningu poprzez weryfikację integralności filmu białkowego przed rozpoczęciem kampanii screeningu związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy testy wiązania in vitro ze środowiskami zbliżonymi do naturalnych poprzez charakteryzację białek w stanie uwodnionym.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane zdarzenia wiązania zachodzą poprzez bezpośredni kontakt białek, czy są zapośredniczone przez warstwy hydratacyjne.
- Znaczenie przedkliniczne: Wspiera modelowanie układów istotnych dla chorób, umożliwiając analizę fibronektyny oraz innych białek macierzy pozakomórkowej w roztworze.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od przesiewania wiązania z celem po optymalizację związku wiodącego – dostarczając danych molekularnych z powierzchni międzyfazowych, które uzupełniają testy w roztworach objętościowych. Jest ona stosowana po wstępnej walidacji celu, a przed badaniami przesiewowymi na komórkach, oferując warstwę mechanistyczną dla etapu przejścia od hitu do związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów adsorpcji oraz funkcjonalności celów związanych ze szlakami poprzez bezpośrednie mapowanie molekularne.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów poprzez weryfikację jednorodności filmu białkowego oraz spójności sygnału zależnej od hydratacji.
- Analityka: Dostarcza widm z rozdzielczością masową oraz dwuwymiarowych map jonów, które pozwalają na porównanie fragmentów białek i klastrów wody w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Nawiązują do prac przedklinicznych poprzez utrzymanie stanu hydratacji białka, co zwiększa relewantność w odniesieniu do warunków biointerfejsu in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do analizy międzyfazowej z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować w przypadku wielu celów i rodzin białek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez ograniczenie niejednoznaczności w mechanizmach oddziaływań białko-powierzchnia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje analizę uwodnionych białek dzięki powtarzalnemu dozowaniu płynów i mikrofluidycznemu interfejsowi kompatybilnemu z próżnią.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o mechanistyczne dane międzyfazowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, wyjaśniając, czy oddziaływanie z celem jest bezpośrednie, czy zapośredniczone przez hydratację.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie analizy powierzchni próżniowych oraz obsługi urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia szczelnego działania systemu SALVI.
- Metoda jest zależna od aparatury ToF-SIMS z możliwością przełączania trybów jonów dodatnich/ujemnych oraz profilowania głębokościowego.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w obszarze nauki o powierzchniach oraz biologii w zakresie przygotowania próbek i interpretacji danych.
- Wymagane jest uwzględnienie modyfikacji przy rozszerzaniu analiz poza fibronektynę na inne białka o odmiennej kinetyce adsorpcji.
- Ograniczeniem jest konieczność zapewnienia kompatybilności z ultrawysoką próżnią, co zawęża analizę do powierzchni umożliwiających uszczelnienie układu mikroprzepływowego w warunkach próżniowych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Cleaning and Sterilization of the SALVI Microchannel
2:05
Immobilization of the Protein Film in SALVI
2:50
Install SALVI into the ToF-SIMS Loadlock Chamber
4:05
ToF-SIMS Data Acquisition
7:35
Results: Dynamic Liquid Surface and Liquid-solid Interface Analysis
9:02
Conclusion
