Name: Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metody monitorowania defektów morfogenetycznych podczas wydłużenia embrionalnego u nicieni Caenorhabditis elegans. Protokoły te pozwalają identyfikować geny regulujące wczesne i późne fazy rozwoju zarodka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) z Kanady oraz The Canada Foundation for Innovation. Podziękowania dla dr Paula Mainsa (University of Calgary, Calgary, Kanada) za szczep let-502(sb118ts). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje nowatorskie wskaźniki charakteryzujące wczesne i późne fazy wydłużania zarodka.
W sekcji 1 krytycznym krokiem jest potencjalna obecność bakterii na podkładce. Podczas pozyskiwania obrazu zarodki są hermetycznie zamknięte między podpaską a szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnienie szkiełka jest wymagane, aby uniknąć wysuszenia zwierząt podczas pozyskiwania, które trwa dłużej niż dwie godziny. O ile nam wiadomo, żaden z uszczelniaczy używanych do mocowania podkładek agarozowych ...

Przez prawie 50 lat nicień Caenorhabditis elegans stał się potężnym modelem do badania ważnych zagadnień w zakresie rozwoju, neurobiologii, ewolucji, interakcji gospodarz-patogen, itp.1 Siła tego modelu w badaniach nad rozwojem polega na: jego krótkim cyklu życia wynoszącym 3 dni; łatwości, z jaką te zwierzęta mogą być genetycznie zmienione; jego przezroczystości, która umożliwia obserwację przemieszczeń i morfologii komórek w żywych zwierząt i jego rozwój, który jest w większości pozamaciczny. Etapy rozwojowe nicienia obejmują embriogenezę i cztery stadia larwalne (od L1 do L4), po których następuje dorosłość. Podczas rozwoju embrionalnego morfogeneza naskórka przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na jej zdolność do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki nabłonkowe migrują jako grupa, jak reorganizują swoje połączenia i modyfikują swoją indywidualną morfologię, a także ich względne położenie w funkcjonalnym nabłonku. Morfogeneza naskórka dzieli się na cztery etapy: interkalacja grzbietowa polegająca na reorganizacji komórek naskórka grzbietowego, określanych jako tkanka podskórna; zamknięcie brzuszne, polegające na migracji brzusznych komórek podskórnych w kierunku brzusznej linii środkowej, a tym samym na obudowie zarodka monowarstwą komórek nabłonka; Wczesne i późne wydłużenie przekształcające zarodek w kształcie fasoli w larwy robakowate. Po morfogenezie wylęganie się zarodka i larwy L1 zaczynają żerować przy użyciu dostępnych bakterii w swoim bezpośrednim otoczeniu.
Wydłużenie embrionalne jest zatem późną fazą rozwoju embrionalnego. Polega na wydłużeniu zarodka wzdłuż jego osi podłużnej i zmniejszeniu jego średnicy poprzecznej. Wiąże się to z radykalną modyfikacją kształtu komórek podskórnych. Wydłużenie dzieli się na fazę wczesną i późną. Wczesna faza rozpoczyna się na etapie przecinka i kończy się, gdy mięśnie ściany ciała zaczynają się kurczyć w stadium 1,75-krotnym u zarodków typu dzikiego (wt) - co odpowiada zarodkom o długości 1,75 razy w porównaniu z zarodkami niewydłużonymi. Procesy morfogenne zachodzące na tym etapie są napędzane głównie przez obkurczanie się nitkowatych wiązek aktyny (FB) zlokalizowanych na biegunie wierzchołkowym komórek podskórnych, które napędzają ich wydłużenie wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka2. Skurcz FB jest kontrolowany przez fosforylację łańcuchów lekkich miozyny przez trzy kinazy: LET-502/ROCK, MRCK-1 i PAK-1 5. Późna faza wydłużenia rozpoczyna się, gdy mięśnie ściany ciała stają się funkcjonalne i zaczynają się kurczyć. Obejmuje sygnalizację mechanotransdukcji z mięśni ściany ciała do komórek grzbietowych i brzusznych podskórnych i kończy się w momencie wyklucia się zwierząt3.
Wady wydłużenia są zazwyczaj charakteryzowane przez procent zwierząt umierających jako zarodki (śmiertelność embrionalna; Emb) oraz te hamujące ich rozwój jako larwy L1 (fenotyp zatrzymania larw; Lva) i jest znacznie krótsza niż wt. Identyfikacja stadium zahamowania rozwoju wymaga obserwacji mikroskopowej martwych zarodków i zatrzymanych larw3-6.
Niedawno pokazano, że kilka genów, takich jak regulator Cdc42/Rac i efektor pix-1 i pak-1, kontrolują procesy morfogenne zarówno podczas wczesnej, jak i późnej elongacji3,7. Niedawno wykazaliśmy również, że procesy morfogenne różnią się wzdłuż osi przednio-tylnej zarodków we wczesnym okresie elongacji37. Odkrycia te skłoniły do opracowania nowych wskaźników ukierunkowanych w szczególności na wczesne i późne etapy elongacji oraz innych wskaźników umożliwiających scharakteryzowanie morfologii zarodków wzdłuż ich osi przednio-tylnej podczas wczesnej elongacji.
Te nowatorskie metody polegają na pomiarze długości zarodków na początku i na końcu wczesnego wydłużenia, a także szerokości ich głów i ogonów. 7 Opracowano również dwa protokoły do pomiaru długości nowo wyklutych larw, zsynchronizowanych w stadiumL1 7.
Skorupki jaj zarodków chronią je przed alkalicznym podchlorynem, podczas gdy larwy, dorosłe osobniki i bakterie obecne w pożywce hodowlanej są rozpuszczane przez leczenie. Zabieg ten jest następnie stosowany do oczyszczania zarodków z niezsynchronizowanej populacji zawierającej większość dobrze odżywionych dorosłych8. Ograniczenie pokarmu służy do synchronizacji nowo wyklutych larw. Pomiar długości tych larw jest następnie wykorzystywany do wykrywania wad wydłużenia. Pomiar ten jest preferowany w stosunku do pomiaru zatrzymanych larw na płytkach hodowlanych, ponieważ larwy, które wykluwają się z nie w pełni wydłużonych zarodków, mogą powrócić do "normalnej długości" podczas karmienia, ale zachowają swój zmniejszony rozmiar po zatrzymaniu w przypadku braku pożywienia.
Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły umożliwiające pomiar długości wydłużających się zarodków, jak również szerokości ich głowy i ogona za pomocą poklatkowej mikroskopii DIC i analizy obrazu (Protokół 1). Udostępniamy również szczegółowe protokoły do pomiaru długości zsynchronizowanych larw za pomocą analizy obrazu (Protokół 2) i cytometrii przepływowej (Protokół 3).

<table><tbody><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (chlorek wapnia)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Wysokofluorescencyjne cząstki kontrolne</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosforan potasu, dwuzasadowy)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosforan potasu, monozasadowy)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (siarczan magnezu)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4( fosforan sodu, dwuzasadowy)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (chlorek sodu)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Guma do rysowania Pebeo 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>dowolnym sklepie ze sztuką/rękodziełem</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Złącze buforowe osłony</td><td>Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>Złącze COPAS Biosort</td><td>Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Analiza szlaków sygnałowych, które kontrolują zmiany procesów morfogennych podczas rozwoju embrionalnego, wymaga solidnych i czułych wskaźników. Wydłużenie zarodka nicienia Caenorhabditis elegans jest późnym etapem rozwojowym polegającym na wydłużeniu zarodka wzdłuż jego osi podłużnej. Ten etap rozwoju jest kontrolowany przez komunikację międzykomórkową między komórkami podskórnymi a leżącymi poniżej mięśniami ściany ciała. Te mechanizmy sygnalizacyjne kontrolują morfologię komórek podskórnych poprzez przebudowę cytoszkieletu i połączeń komórka-komórka. Pomiar śmiertelności zarodka i zatrzymania rozwoju w stadiach larwalnych, a także zmiana cytoszkieletu i struktur adhezyjnych komórka-komórka w komórkach podskórnych i mięśniowych to klasyczne fenotypy, które są używane od ponad 25 lat do analizy tych szlaków sygnałowych. Ostatnie badania wymagały opracowania nowych wskaźników ukierunkowanych na wczesną lub późną elongację i charakteryzujących defekty morfogenne wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka. W tym miejscu udostępniamy szczegółowe protokoły umożliwiające dokładny pomiar długości i szerokości wydłużających się zarodków, a także długości zsynchronizowanych larw. Metody te stanowią użyteczne narzędzia do identyfikacji genów kontrolujących wydłużenie, do oceny, czy geny te kontrolują zarówno wczesne, jak i późne fazy tego etapu i czy są wymagane równomiernie wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka.

Stosunki szerokości głowy, ogona oraz głowy do ogona są wiarygodnymi wskaźnikami.
Opisane tutaj protokoły zostały z sukcesem wykorzystane do scharakteryzowania funkcji regulatorów i efektorów GTPaz Rho pix-1, pak-1 oraz let-502 w trakcie wczesnej elongacji7. Ge...

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Ogólnym celem tej grupy eksperymentów jest zidentyfikowanie wad rozwojowych u nicienia Caenorhabditis elegans podczas wczesnej i późnej fazy elongacji zarodkowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie genetyki rozwoju. Umożliwia ona charakterystykę genów kontrolujących późny etap rozwoju zarodkowego Caenorhabditis elegans, nazywany elongacją zarodkową.Główną zaletą tej grupy technik jest to, że pozwalają one zidentyfikować geny kontrolujące wczesny lub późny etap elongacji, a także te, które sterują procesami morfogenetycznymi w przedniej lub tylnej części embrionu. Procedurę zaprezentuję wraz z Olivierem Rocheleau-Leclair, byłym studentem naszego laboratorium. Procedura ta wymaga zastosowania obiektywów DIC, pryzmatu oraz systemu przechwytywania obrazu do mikroskopii time-lapse stosów Z (Z stacks).W pierwszej kolejności ustaw próbkę zamocowaną na szkiełku przedmiotowym do obserwacji. Szczegóły przygotowania znajdują się w protokole tekstowym. Rozpoczynając od małego powiększenia, zidentyfikuj embriony w fazach przedmorfogenezy.Następnie dodaj kroplę oleju i użyj obiektywu o większym powiększeniu. Teraz wyznacz górny i dolny punkt embrionów, aby zarejestrować i ustawić parametry stosu Z (Z stack). Skonfiguruj tryb time-lapse tak, aby obrazy były pobierane co dwie minuty.Upewnij się, że migawka świetlna jest zamknięta pomiędzy poszczególnymi akwizycjami obrazu. Czas potrzebny do uchwycenia wczesnego etapu wydłużania może wynosić od jednej do ośmiu godzin, w zależności od stadium rozwoju zarodka. Następnie uruchom program akwizycji obrazu i zapisz wyniki.Następnie należy przystąpić do ich analizy przy użyciu oprogramowania Fiji ImageJ. Po załadowaniu obrazów należy wybrać tryb wyświetlania Hyperstack. Następnie należy dostosować jasność i kontrast, stosując tryb Auto w tabelach wyszukiwania (Lookup Tables).Następnie przejdź do sekcji Analyze Set Measurements i ustaw parametry. Dla każdego zarodka ustaw pasek Z Scale tak, aby skupić się na gardle, które stanowi dobry punkt orientacyjny dla środka zarodka. Teraz dostosuj pasek Time Scale do początku wczesnej elongacji dla konkretnego zarodka.Zanotuj ten czas. Następnie, oblicz długość embrionu, korzystając z narzędzia Analyze Measure, rysując linię od końca ogona do pyska wzdłuż linii środkowej. Zanotuj tę długość.Następnie należy ustawić punkt czasowy na koniec zdarzenia wczesnego wydłużania i powtórzyć pomiar długości. Wartości te należy wykorzystać do obliczenia czasu trwania wczesnego wydłużania oraz przyrostu długości podczas tego procesu. Zmianę szerokości można również zmierzyć, używając narzędzia linii prostej do narysowania linii w poprzek linii środkowej głowy.Jest to odpowiednie miejsce do wykonywania spójnych pomiarów. Powtórz tę czynność w linii środkowej ogona, a następnie oblicz stosunek głowy do ogona dla dowolnego punktu czasowego i wykorzystaj tę wartość do oceny zmian w szerokości. W przypadku niniejszego protokołu cytometr przepływowy musi zostać przygotowany do analizy przepływu dużych cząstek.Taka maszyna staje się w istocie sorterem nicieni. Przed rozpoczęciem pracy uruchom blok laserowy, kompresor, sorter nicieni oraz oprogramowanie. W oprogramowaniu naciśnij Start i sprawdź sterowanie laserem argonowym (Argon Laser Control).Wybierz tryb Run i poczekaj, aż laser nagrzeje się do mocy bliskiej 10 milliwattów, a następnie wybierz Done. Pozostaw układ na co najmniej 15 minut w celu wyrównania ciśnienia. Teraz przygotuj próbkę.Najpierw nanieś 10 µL zsynchronizowanych L1 typu dzikiego na szkiełko zegarkowe i oszacuj pod mikroskopem odsetek martwych jaj. Jeśli szacunek przekracza 20%, nie należy używać próbki. Przenieś około 700 µL zsynchronizowanych L1 w roztworze M9 do probówki o pojemności 15 ml i dodaj jodek propidyny do stężenia 10 µg/mL.Pozostawć barwnik na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj system. Niezbędne jest ustawienie natężenia przepływu za pomocą kontrolerów przepływu osłonki (Sheath Flow Controller) i próbki (Sample Flow Controller) odpowiednio na 5,1 i 5,51.Po ustabilizowaniu się ciśnienia zaznacz pole Pressure Okay. Następnie użyj polecenia Acquire i ręcznie potrząśnij probówką, aby usunąć pęcherzyki powietrza z kanału między kubkiem z próbką a komorą analityczną. W oknie Acquisition Window w końcu pojawi się informacja o braku pęcherzyków.Jest to również kluczowe dla przebiegu eksperymentu. Teraz należy ustawić parametry dla pomiarów fluorescencji oraz TOF. Ustaw skale dla TOF, EXT, Green, Yellow oraz Red na wartość 256.Następnie ustaw wzmocnienie (Gain) zgodnie z opisem. Następnie ustaw sterowanie PMT (PMT Control) na wartość 700 dla kanałów Green i Yellow oraz na 900 dla kanału Red. Teraz skalibruj sorter nicieni.Nalej 20 mililitrów ogólnych kontrolnych cząsteczek o wysokiej fluorescencji do probówki i umieść ją w sorterze. W oprogramowaniu wybierz opcję Run Control Particles z menu Tools i kliknij Acquire. Sprawdź, czy otrzymany współczynnik zmienności jest większy lub równy 11, a średnia wynosi 21 plus lub minus sześć.Jeśli tak nie jest, należy spróbować oczyścić tubule, klikając przycisk Clean lub poprzez szybkie przepłukanie kanału przepływu. Następnie należy wyjść z trybu Control Particles, odznaczając odpowiednią opcję w menu Tools. Po zakończeniu 30-minutowego barwienia nicieni jodem propidyny, należy dodać 10 ml M9 do zabarwionych nicieni i wymieszać.Inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie pobrać pięć mililitrów rozcieńczenia i dodać do kubka z próbką zawierającego 15 mililitrów M9. Przepuścić to rozcieńczenie przez sorter nicieni. Nacisnąć przycisk Acquire i obserwować szybkość przepływu.Może zajść potrzeba dostosowania stężenia nicieni, aby uzyskać odpowiedni przepływ, wynoszący od 15 do 25 obiektów na sekundę. Po osiągnięciu właściwego stężenia obiektów, należy dodać do badania cząsteczki kontrolne, aby uzyskać końcowe stężenie od około 0,5 do 1x cząsteczek kontrolnych w roztworze. Następnie, w menu Gating, należy ustawić parametr Gating Parameter na TOF versus Green.Następnie dostosuj parametry sortowania do TOF względem kanału Red. Pozwoli to na oddzielenie cząstek kontrolnych od komórek zwierząt martwych i żywych. Teraz uruchom eksperyment, klikając Acquire.Przeanalizuj około 10 000 obiektów, co odpowiada około 8 000 zwierzętom. Następnie przerwij eksperyment i kliknij Store, aby zapisać dane w pliku tekstowym do analizy. Aby ocenić powtarzalność pomiaru szerokości głowy, pomiar wykonano niezależnie pięć razy na 12 embrionach typu dzikiego w stadium 1,2 fold.Po zastosowaniu testu Browna-Forsythe'a nie stwierdzono różnic w wariancji danych. Powtarzalność oraz efekty serii związane z pomiarem szerokości głowy przetestowano za pomocą obrazowania 4D DIC w trzy różne dni. W tych trzech grupach pomiarowych nie stwierdzono wariancji ani efektów serii.Oba opisane protokoły zostały wykorzystane do oceny długości zahamowanych larw w typie dzikim oraz w liniach mutantów. Analiza obrazu pozwoliła na uzyskanie bezwzględnych pomiarów długości w mikrometrach. W niniejszym eksperymencie mutanty były mniejsze od typów dzikich.Pomiar długości za pomocą cytometrii przepływowej dał porównywalne wyniki. Pomiary te okazały się jednak znacznie bardziej powtarzalne. Zatem metoda ta powinna pozwolić na wykrycie subtelniejszych efektów w populacjach mutantów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymanie stałej prędkości przepływu w trakcie eksperymentu, aby zapewnić rzetelne porównanie analizowanych szczepów. Po opanowaniu tej metody pomiar długości larw za pomocą cytometrii przepływowej umożliwia charakterystykę od 18 do 24 warunków lub szczepów mutantów dziennie, nawet przy uwzględnieniu wstępnej kalibracji urządzenia. Stosując tę procedurę, jesteśmy w stanie badać morfologię komórek hipodermy.W tym celu możemy wykorzystać marker fluorescencyjny oraz mikroskopię konfokalną, aby scharakteryzować funkcję molekularną zidentyfikowanych genów. Należy pamiętać, że jodek propidyny może być niezwykle niebezpieczny, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Poznaj metody monitorowania defektów morfogenetycznych podczas wydłużenia embrionalnego u nicieni Caenorhabditis elegans. Protokoły te pozwalają identyfikować geny regulujące wczesne i późne fazy rozwoju zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów