Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Ogólnym celem tego gradientowego chipa odkształcającego jest zapewnienie prostego podejścia do generowania nieciągłych gradientowych odkształceń statycznych na hydrożelu 3D w celu zbadania zachowań komórek w szeregu warunków odkształcenia. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie bioinżynierii, takie jak stymulacja różnicowania komórek macierzystych i regulacja wyrównania komórkowego w celu rozwoju sztucznych narządów tkankowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że różne szczepy mogą być nakładane na warstwę komórkową i hydrożele w tym samym mikrośrodowisku w celu porównania zachowania komórek.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania chipa są trudne do nauczenia, ponieważ światło powinno być gotowe w ciągu trzech do czterech godzin, aby zapewnić dużą zmienność komórek. Zważ 10 gramów żelatyny w proszku i dodaj ją do szklanej kolby ze 100 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby i umieścić kolbę na mieszającej płycie grzejnej.

Przykryj kolbę folią aluminiową, aby uniknąć parowania wody. Ustaw temperaturę płyty grzejnej na 50 do 60 stopni, a mieszadło na 100 obr./min na godzinę, aby rozpuścić żelatynę w proszku. Po rozpuszczeniu żelatyny bardzo powoli dodawać osiem mililitrów bezwodnika metakrylowego za pomocą pipety.

Pozwól mu reagować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie dodać podgrzany DPBS do kolby do końcowej objętości 500 mililitrów. Pozostaw roztwór do dobrego wymieszania przez 15 minut, aby zatrzymać reakcję.

W międzyczasie przetnij membranę dializacyjną na kilka rurek o długości 25 milimetrów. Zanurz je w wodzie dejonizowanej na 15 minut. I zawiąż węzeł, aby zamknąć jeden koniec rurek dializacyjnych.

Załadować odpowiednią ilość roztworu polimeru do rurek dializacyjnych i zamknąć drugi koniec. Następnie umieść napełnione probówki w pięciolitrowej plastikowej zlewce z wodą dejonizowaną na tydzień. Wodę dejonizowaną należy odnawiać dwa razy dziennie i utrzymywać roztwór w temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza podczas procesu dializy.

Po dializie zebrać roztwór z probówek do szklanej butelki o pojemności 500 mililitrów. Wlej około 450 do 500 mililitrów roztworu do 500-mililitrowego kubka filtrującego. I zastosuj próżnię, aby wymusić przejście roztworu przez membranę filtracyjną w celu sterylizacji.

Następnie przenieś wysterylizowany polimer do kilku 50-mililitrowych wysterylizowanych probówek. Przenieś wysterylizowany polimer do kilku 50-mililitrowych wysterylizowanych probówek i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni. Liofilizuj polimer o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez tydzień za pomocą liofilizatora, aby uzyskać GelMA, który można następnie przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do produkcji chipów najpierw przygotuj polimetakrylan lub PMMA, graj i formuj zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przygotuj osłonę PTMS i zatyczkę PTMS, odpowiednio mieszając 30 gramów elastomeru PTMS i trzy gramy utwardzacza PTMS. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej na jedną godzinę.

Wlej od 1,8 do dwóch gramów mieszanki do formy PMMA na osłonę PTMS. Użyj również odpowiedniej ilości, aby wypełnić każdą wnękę dla formy PMMA dla wtyczki PTMS. Dodatkowo odlać 10 gramów nieutwardzonej mieszaniny PTMS w pustej 10-centymetrowej plastikowej płytce.

Umieść te foremki w komorze próżniowej, aby odgazować przez 30 minut. Utwardzaj PTMS przez dwie godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu utwardzonego PTMS na formie, należy zdjąć osłony PTMS i zaślepki PTMS z form PMMA.

Następnie przebij dwa otwory o średnicy około trzech milimetrów na końcach kanałów przepływowych pokryw PTMS. Wytnij arkusz PTMS uformowany z 10-centymetrowej plastikowej płytki na wiele sześcianów o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. I wybij trzymilimetrowy otwór w każdej kostce PTMS.

Przyklej dwie nieutwardzone kostki PTMS o wymiarach centymetr na jeden centymetr do otworów pokrywy PTMS, aby służyły jako zbiorniki medium i pomagały w procesie utwardzania gradientowych okrągłych wzorów hydrożelowych. Następnie utwardzaj przez godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie przymocuj pokrywy PTMS do dwóch zbiorników PTMS na szkiełku pokrytym TMSPMA.

W tym celu należy wstępnie przygotować stronę łączącą pokrywę PTMS i szkiełko pokryte TMSPMA pod maszyną do plazmy tlenowej przez 90 sekund obróbki plazmą tlenową. Skontaktuj się z plazmową powierzchnią osłon PTMS i suwaka TMSPMA i mocno je dociśnij w celu trwałego połączenia poprzez utworzenie wiązania krzemowo-tlenowego. Wydrukuj fotomaskę, drukując ustalony układ na przezroczystej folii.

Następnie przytnij wydrukowaną fotomaskę do rozmiaru 25 milimetrów na 37,5 milimetra. Zważyć 25 miligramów liofilizowanego GelMA w 0,3 mililitra podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych w 1,5 mililitrowej czarnej probówce do mikrowirówek. Umieść probówkę mikrowirówki na mieszadle laboratoryjnym na płycie grzejnej, aż GelMA rozpuści się w pożywce.

Dodaj 50 miligramów fotoinicjatora do jednego mililitra DPBS w probówce do mikrowirówki. I umieść go w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 15 minut lub do momentu, gdy fotoinicjator się rozpuści. Dodać 25 mikrolitrów 10% fotoinicjatora do probówki mikrowirówkowej.

Odpipetować kilka razy, aby dobrze wymieszać. Następnie policz trzy miliony komórek NIH3T3 za pomocą automatycznego licznika komórek. Po odwirowaniu zawiesiny o sile 200 G przez pięć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 175 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych.

Dodaj roztwór komórkowy do probówki mikrowirówki, aby uzyskać wstępny roztwór komórek polimerowych o stężeniu 5% GelMA, 0,5% fotoinicjatora i około sześciu milionów komórek 3T3 na mililitr. Po wymieszaniu załaduj 100 mikrolitrów prepolimeru komórkowego do mikrostrzykawki o pojemności 100 mikrolitrów. Ręcznie wyrównaj kawałek fotomaski na dolnym slajdzie wysterylizowanego gradientowego chipa odkształceniowego.

I po prostu ustal pozycję, używając małej kropli wody dejonizowanej pomiędzy nimi. Podłącz mikrostrzykawkę o pojemności 100 mikrolitrów, wypełnioną roztworem ogniw prepolimerowych, do wlotu chipa. Następnie umieść 50 mikrolitrów roztworu komórek prepolimerowych w kanale przepływowym za pomocą mikrostrzykawki i zatkaj wylot za pomocą wtyczki PTMS.

Wstrzyknąć dodatkowe 40 mikrolitrów roztworu, aby utworzyć wypukłe wybrzuszenie w okrągłej membranie PTMS. Przenieś chip z fotomaską, mikrostrzykawką i zatyczką PTMS pod lampę UV. I wystawiaj go na działanie promieni słonecznych przez 30 do 45 sekund, aby usieciować koncentryczny okrągły hydrożel w komorze fluidycznej.

Po usieciowaniu wyjmij zatyczkę PTMS i mikrostrzykawkę, aby uwolnić ciśnienie cieczy. Użyj jednomililitrowej strzykawki wypełnionej wstępnie podgrzanym DPBS, aby trzykrotnie wypłukać nieusieciowane żywice, spłukując je od wlotu do wylotu. Następnie napełnij kanał przepływowy około 100 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych.

Umieść chip w wysterylizowanym naczyniu hodowlanym i posiew w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na tydzień. Odświeżaj podłoże każdego dnia. Zrób zdjęcia trzech chipów w dniu zero po czterech godzinach inkubacji jako grupy kontrolnej.

I trzy chipy w trzecim dniu jako zestaw eksperymentalny przy użyciu mikroskopu z obiektywem 20 razy. Zmierz szerokość linii każdego hydrożelu od linii pierwszej do linii 12 za pomocą oprogramowania do obliczenia plam kompresu. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki wzorów hydrożelowych z zerowym mikrolitrem i 40 mikrolitrami nad wstrzyknięciem, po sieciowaniu UV i czterogodzinnej inkubacji.

Szerokość linii hydrożelu 3D w kontroli bez nadmiernego wtrysku wygląda jednolicie zgodnie z oczekiwaniami. Jednak wzory hydrożelowe z 40 mikrolitrami nad wstrzyknięciem dają gradientową szerokość linii hydrożeli zmniejszającą się od linii pierwszej do linii 12. Po trzech dniach inkubacji komórki w hydrożelu rozciągają się w różnych kierunkach.

Komórki w linii pierwszej wyrównują się wzdłuż kierunku promieniowego dzięki stymulacji wydłużania hydrożelu. Wręcz przeciwnie, komórki w linii 12 wyrównują się wzdłuż kształtu hydrożelu, gdzie wskazówka geometryczna dominuje w wyrównaniu komórkowym. W wierszu 7 nie ma określonego wyrównania komórek, w którym dwie wskazówki wyrównania komórkowego linii pierwszej i linii 12 równoważą się nawzajem.

Po zmierzeniu mikrośrodowiska odkształceń gradientowych na hydrożelu 3D można to zrobić za pomocą chipa odkształcenia gradientowego w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas próby tej procedury należy pamiętać o wysterylizowaniu gradientowego chipa odkształcenia przed załadowaniem roztworu prepolimeru ogniwa. Należy również dokładnie przetrzeć powierzchnię chipa 75% etanolem przed umieszczeniem chipów w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak wygenerować gradientowy chip odkształceniowy, aby zbadać zachowanie komórek pod różnymi szczepami imperialnymi.