Name: Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj metodę generowania gradientowych naprężeń statycznych w hydrożelu z komórkami do badania zachowań komórkowych. Ta technika umożliwia kontrolowane badanie wpływu mechanicznego na komórki w inżynierii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Program Studiów Podyplomowych za Granicą (NSC-101-2917-I-007-010); Program Inżynierii Biomedycznej (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); oraz Krajowy Program Nanotechnologii (NSC-101-2120-M-007-001-); oraz Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST-104-2221-E-007-072-MY3), Narodowa Rada Nauki R.O.C., Tajwan. Autorzy chcieliby podziękować prof. Ali Khademhosseini, Guldenowi Camci-Unalowi, Arghya Paulowi i Ronglihowi Liao z Harvard Medical School za podzielenie się hydrożelem i technologią enkapsulacji komórek.

1. Synteza GelMA
<ol>
	<li>Odważyć 10 g żelatyny w proszku i dodać ją do szklanej kolby ze 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby i umieścić kolbę na mieszającej płycie grzejnej.</li>
	<li>Przykryj kolbę folią aluminiową, aby uniknąć parowania wody. Ustawić temperaturę płyty grzejnej na 50-60 °C, a mieszadło na 100 obr./min na 1 godzinę, aby dobrze rozpuścić żelatynę w proszku.</li>
	<li>Po rozpuszczeniu żelatyny bardzo powoli dodawać 8 ml bezwodnika metakrylowego (jedna kropla na sekundę) za pomocą pipety. Pozwól mu reagować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Dodać wstępnie ogrzany DPBS (40 °C) do kolby do końcowej objętości 500 ml i pozostawić na 15 minut, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>W międzyczasie przetnij membranę dializacyjną (masa cząsteczkowa odcięcia 14 kDa) na kilka rurek o długości 25 cm. Zanurz je w wodzie dejonizowanej (DI) na 15 minut i zawiąż węzeł, aby zamknąć jeden koniec rurek dializacyjnych.</li>
	<li>Załadować odpowiednią ilość (30 - 60 ml) roztworu polimeru do probówek dializacyjnych i zamknąć drugi koniec. Umieść je w 5-litrowej plastikowej zlewce z wodą DI na tydzień. Wodę demineralizowaną należy wymieniać dwa razy dziennie i utrzymywać roztwór w temperaturze 40 - 50 °C podczas procesu dializy.</li>
	<li>Zebrać roztwór z probówki do szklanej butelki o pojemności 500 ml. Wlej ~ 450 - 500 ml roztworu do kubka filtracyjnego o pojemności 500 ml (wielkość porów 0,22 μm) i zastosuj podciśnienie do kubka filtra, aby wymusić przejście roztworu przez membranę filtracyjną w celu sterylizacji.</li>
	<li>Przenieś wysterylizowany polimer do kilku wysterylizowanych probówek o pojemności 50 ml i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 3 - 5 dni.</li>
	<li>Liofilizować polimer o temperaturze -80 °C przez 1 tydzień za pomocą liofilizatora, aby uzyskać GelMA. Przechowuj GelMA w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Modyfikacja 3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu (TMSPMA)
<ol>
	<li> Pokrój komercyjne szkiełka szklane na dwie małe części (25 mm x 37,5 mm) i zanurz je w 0,5 M roztworze NaOH na 4 godziny. Umyj szkiełka dużą ilością wody DI.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stojaku w szklanym pojemniku z 95% etanolem i czyść za pomocą ultradźwięków o częstotliwości 43 kHz przez 15 minut. Wysuszyć szkiełko na powietrzu.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 5% TMSPMA w 99,5% etanolu na 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj szkiełka w 95% etanolu, wysusz je na powietrzu i wyżarzaj powłokę TMSPMA w piecu w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.</li>
</ol>
3. Produkcja chipów
<ol>
	<li>Weź jedną płytkę z polimetakrylanu metylu (PMMA) o grubości 2 mm i jedną 0,3 mm, nałóż taśmę dwustronną na jedną stronę powierzchni PMMA i zwolnij wkładkę z jednej strony. Pozostaw dwie płyty PMMA o grubości 2 mm i jedną płytę o grubości 1 mm bez taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 2 mm bez taśmy dwustronnej na 42 mm x 30 mm w celu wykonania płyty dolnej. Wytnij płytę PMMA o grubości 2 mm za pomocą taśmy dwustronnej, aby wykonać ramkę graniczną o wymiarach zewnętrznych 42 mm x 30 mm i wymiarach wewnętrznych 37,5 mm x 25 mm.</li>
	<li>Wytnij laserowo płytkę PMMA o grubości 0,3 mm za pomocą taśmy dwustronnej w 12-milimetrowy środkowy okrąg z dwoma kanałami przepływowymi o szerokości 2 mm i długości 8 mm po przeciwnych stronach okręgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a).</li>
	<li>Aby przygotować formę PMMA do odlewania pokrywy PDMS, zmontuj trzy części elementów PMMA z kroków 3.2-3.3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1b) za pomocą taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 2 mm za pomocą taśmy dwustronnej na kawałek o wymiarach 5 cm x 5 cm z układem 3 x 3 pustych prostokątów o wymiarach 8,5 mm x 8,5 mm. Wytnij kolejny kawałek o wymiarach 5 cm x 5 cm za pomocą układu 3 x 3 pustych kółek o średnicy 4 mm. Wytnij laserowo płytę PMMA o grubości 1 mm bez taśmy dwustronnej na dolną płytę PMMA o wymiarach 5 cm x 5 cm.</li>
	<li>Przygotuj formę PMMA do odlewania wtyczki PDMS, montując trzy części komponentów PMMA z kroku 3.5 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1c) za pomocą taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Przygotować pokrywę PDMS i zatyczkę PDMS, odpowiednio mieszając 30 g elastomeru PDMS i 3 g utwardzacza PDMS; odgazowywać mieszaninę w komorze próżniowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wlej 1,8-2,0 g mieszanki do formy PMMA na pokrywę PDMS i użyj odpowiedniej ilości do wypełnienia każdej wnęki formy PMMA dla wtyczki PDMS. Odlać 10 g nieutwardzonej mieszaniny PDMS na czystą 10-centymetrową płytkę z tworzywa sztucznego. Umieść te foremki w komorze próżniowej, aby odgazować na 30 minut.</li>
	<li>Utwardzać PDMS przez 2 godziny w temperaturze 80 °C. Po schłodzeniu utwardzonego PDMS na formie, należy odłączyć osłony PDMS i zaślepki PDMS od form PMMA.</li>
	<li>Przebić dwa otwory o średnicy około 3 mm na końcach kanałów przepływowych pokryw PDMS.</li>
	<li>Pokrój arkusz PDMS uformowany z 10-centymetrowej plastikowej płytki na wiele kostek o wymiarach 1 cm x 1 cm i wybij 3-milimetrowy otwór w każdej kostce PDMS. Przykleić dwie nieutwardzone kostki PDMS o wymiarach 1 cm x 1 cm do otworów pokrywy PDMS (aby służyły jako zbiorniki pożywki i wspomagały proces utwardzania gradientowych okrągłych wzorów hydrożelowych) i utwardzały przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Przyklej pokrywy PDMS z dwoma zbiornikami PDMS na szkiełku pokrytym TMSPMA, poddając wstępnej obróbce stronę łączącą pokrywy PDMS i szkiełka pokrytego TMSPMA pod maszyną plazmową tlenową (moc RF 30 W (tryb wysoki) i sprężone powietrze 600 mTorr) lub elektronicznym generatorem koronowym wysokiej częstotliwości (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) przez 90 s obróbki plazmowejO2.</li>
	<li>Zetknąć się z plazmową powierzchnią pokryw PDMS i suwaka TMSPMA i mocno je docisnąć w celu trwałego połączenia poprzez utworzenie wiązania Si-O-Si. 
	UWAGA: Umieszczenie frytki w piekarniku w temperaturze 80 °C na 1 godzinę może jeszcze bardziej zwiększyć siłę wiązania.</li>
	<li>Po schłodzeniu zanurz frytki w 95% etanolu na 15 minut i wysusz na powietrzu. Następnie sterylizuj wióry pod promieniowaniem UV przez 1 godzinę i przechowuj je w pudełku owiniętym folią aluminiową w kapturze laminarnym.</li>
</ol>
4. Statyczne odkształcenie gradientowe na hydrożelu wypełnionym komórkami
<ol>
	<li>Wydrukuj i wytnij kawałek fotomaski o wymiarach 25 mm x 37,5 mm, drukując układ w <silna klasa="xfig">Rysunek 2b na przezroczystej folii. Dostosuj rozmiar wydruku Rysunek 2b, aby dopasować wymiar w Rysunek 2a.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml pożywki DMEM z 10% FBS, 1% Pen-Strep i 250 ml DPBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do użycia jako pożywka do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odważyć 25 mg liofilizowanego preparatu GelMA w 0,3 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki do hodowli komórkowych w czarnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę do mikrowirówki na mieszadle laboratoryjnym/płycie grzejnej, aż GelMA rozpuści się w pożywce.</li>
	<li>Odważyć 50 mg fotoinicjatora w 1 ml DPBS w probówce do mikrowirówki i umieścić w piecu o temperaturze 80 °C na 15 minut lub do momentu, gdy fotoinicjator się rozpuści.</li>
	<li>Weź 25 μl 10% fotoinicjatora z kroku 4.4 i dodaj go do probówki mikrowirówkowej z kroku 4.3. Odpipetować kilka razy, aby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Policz 3 x 106 komórek NIH 3T3 za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować zawiesinę o sile 200 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 175 μl pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodaj roztwór komórkowy z kroku 4.6 do probówki mikrowirówki z kroku 4.5, aby uzyskać prepolimerowy roztwór komórek o stężeniu 5% GelMA, 0,5% fotoinicjatora i ~6 x 106 komórek 3T3/ml. Po wymieszaniu załaduj 100 μl prepolimeru komórkowego do mikrostrzykawki o pojemności 100 μl.</li>
	<li>Ręcznie wyrównaj (patrz Rysunek 3a) kawałek fotomaski na dolnym szkiełku wysterylizowanego chipa odkształcenia gradientowego i po prostu ustal pozycję, używając małej kropli wody DI pomiędzy nimi. Podłącz mikrostrzykawkę o pojemności 100 μl wypełnioną roztworem ogniw prepolimerowych do wlotu chipa.</li>
	<li>Umieść (patrz klasa <strong="xfig">Rysunek 3b) 50 μl roztworu komórek prepolimerowych w kanale przepływowym za pomocą mikrostrzykawki, a następnie zatkaj wylot za pomocą wtyczki PDMS. Wstrzyknąć dodatkowe 40 μl roztworu, aby utworzyć wypukłe wybrzuszenie w okrągłej membranie PDMS.</li>
	<li>Przesuń chip z fotomaską (na dole), mikrostrzykawką (wlot) i wtyczką PDMS (wylot) z kroku 4.9 pod lampą UV (365 nm, 9 mW/cm2) i wystaw go na 30 - 45 s, aby usieciować koncentryczny okrągły hydrożel w komorze fluidycznej.</li>
	<li>Wyjmij zatyczkę PDMS i mikrostrzykawkę, aby uwolnić ciśnienie cieczy (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3c). Użyj strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej wstępnie podgrzanym DPBS, aby 3 razy wypłukać nieusieciowane żywice, spłukując je od wlotu do wylotu.</li>
	<li>Napełnij kanał przepływowy około 100 μl pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umieścić chip w wysterylizowanym naczyniu hodowlanym i kulturę w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C na tydzień. Odświeżaj podłoże każdego dnia.</li>
	<li>Zrób zdjęcia trzech chipów w dniu 0 po 4 godzinach inkubacji, jako grupa kontrolna, i trzech chipów w dniu 3, jako zestaw eksperymentalny, używając mikroskopu z obiektywem 20X. Zmierz szerokość linii każdego hydrożelu od linii 1 do linii 12 za pomocą oprogramowania (np. ImageJ), aby obliczyć naprężenia kompresujące ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4). 
	UWAGA: Procent wydłużenia oblicza się, dzieląc wartość różnicy szerokości linii między 40 μL a 0 μL przez szerokość linii przy 40 μL.</li>
</ol>
5. Barwienie komórek do analizy wyrównania
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki wstrzyknąć 4% paraformaldehydu (PFA) w DPBS w temperaturze pokojowej do chipa przepływowego na 15 minut w celu utrwalenia hydrożelu wypełnionego komórkami. 
	UWAGA: Uwaga. PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Zastąp roztwór 0,5% roztworem przenikającym błonę komórkową w DPBS przez 10 minut, aby przeniknąć przez błonę komórkową w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>PBS przemyć próbki 3 razy w odstępach od 5 do 10 minut między myciami (przy użyciu załadowanej strzykawki, jak w kroku 5.1).</li>
	<li>Załaduj 1% roztwór BSA do kanału fluidycznego na 45-60 minut w temperaturze pokojowej (za pomocą załadowanej strzykawki przez port wlotowy).</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml metanolu do fiolki z falloidyną Alexa Fluor 488, aby uzyskać końcowe stężenie roztworu podstawowego 6,6 μM.</li>
	<li>Weź 5 μl falloidyny Alexa Fluor 488 z kroku 5.5 i rozcieńcz ją w 200 μl DPBS z 0,1% BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,165 μM Alexa Fluor 488 falloidyny.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu mieszaniny do kanału fluidycznego za pomocą mikropipety i inkubować chip w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut w celu barwienia aktyny. PBS przemyć (jak wyżej) próbki 3 razy.</li>
	<li>Przygotować 1 μg/ml DAPI w PBS, przepuścić przez chip i wybarwić jądra komórkowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Pipetować DPBS do kanału fluidycznego, aby wypłukać roztwór barwiący i ponownie napełnić komorę fluidyczną roztworem PBS, aby wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Uchwyć obrazy fluorescencyjne komórek 3T3 w hydrożelach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego pod 40-krotnym powiększeniem z detektorem CCD i zestawami filtrów ex / em przy 488/520 nm i 358/461 nm odpowiednio dla falloidyny Alexa Fluor 488 (aktyna) i DAPI (jądro).</li>
</ol>

<ol><li>Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystems+for+biomimetic+stimulation+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells.</a> Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).</li>
<li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulation+of+the+cardiac+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+tissue+constructs+that+mimic+myocardium+structure+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics.</a> Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).</li>
<li>Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes+in+a+compliant+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system.</a> Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+effects+of+mechanical+strain+on+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).</li>
<li>Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+strain+stimulates+fibroblastic+phenotype+shift+in+smooth+muscle+cells+in+an+engineered+tissue+model+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall.</a> Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).</li>
<li>Ramon-Azcon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacrylate+as+a+promising+hydrogel+for+3D+microscale+organization+and+proliferation+of+dielectrophoretically+patterned+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells.</a> Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).</li>
<li>Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-Based+Comparison+of+the+Osteogenesis+of+Human+Bone+Marrow-+and+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+under+Mechanical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation.</a> PLoS One. 7 (9), e46689(2012).</li>
<li>Gould, R. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22281945">Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture.</a> Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17060641">Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells.</a> Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).</li>
<li>Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-Induced+Alignment+in+Collagen+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strain-Induced Alignment in Collagen Gels.</a> PLoS One. 4 (6), e5902(2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/4/2/1084">Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery.</a> Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+Counts%3A+Microenvironmental+Regulation+of+Stem+Cells+by+Biophysical+and+Material.+Cues%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).</li>
<li>Segers, V. F., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+therapy+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell therapy for cardiac disease.</a> Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).</li>
<li>Hsieh, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+static-strain+stimulation+in+a+microfluidic+chip+for+3D+cellular+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment.</a> Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiono proste podejście do porównania zachowania wyrównania komórek po prowadzeniu kształtu hydrożelu i rozciąganiu. Elastyczna membrana PDMS tworzy krzywiznę w kształcie kopuły do generowania różnych wysokości koncentrycznych okrągłych hydrożeli. Po zwolnieniu ciśnienia membrana PDMS automatycznie przykłada siłę do hydrożeli z mikrowzorem, tworząc gradientowe odkształcenie/wydłużenie, z maksimum w środku i minimum na zewnętrznej granicy. Ponieważ tworzenie odkształcenia gradientowego jest projektow...

Służąc jako materiał blokowy, który naśladuje natywne mikrośrodowisko, hydrożel zawierający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) może odbudować biomimetyczne rusztowania tkankowe, aby wspierać wzrost komórek. Aby posiadać funkcje tkanki, niezbędne jest zorganizowane wyrównanie komórek. Różne dopasowania komórek 2D (tj. komórki hodowane na powierzchni) i 3D (tj. komórki zamknięte w hydrożelu) uzyskano poprzez hodowlę lub enkapsulację komórek w elastycznych podłożach lub na elastycznych podłożach z mikro- lub nanowzorcami1. Wyrównanie komórek 3D w mikroarchitekturze jest bardziej atrakcyjne, ponieważ mikrośrodowisko jest bliższe natywnemu konstruktowi tkankowemu2,3,4. Jednym z powszechnych podejść do wyrównywania komórek 3D jest geometryczna wskazówka hydrożelu shape2,3. Ze względu na ograniczoną przestrzeń do proliferacji komórek w kierunku krótkiej osi, komórki dążą do wyrównania wzdłuż kierunku długiej osi w hydrożelu o mikrowzorze. Innym podejściem jest zastosowanie rozciągania rozciągającego do hydrożeli w celu uzyskania wyrównania komórek równolegle do kierunku rozciągania4,5.
Stymulacja biofizyczna za pomocą hydrożeli ECM, takich jak napięcie kompresyjne lub pole elektryczne, może regulować funkcje komórek w celu prawidłowej integracji tkanek, proliferacji i różnicowania1,2,3. Przeprowadzono wiele badań w celu zbadania zachowania komórek poprzez zastosowanie jednego warunku szczepu na raz przy użyciu wielu mechanicznych jednostek sterujących4,6,7,8,9. Na przykład powszechne jest stosowanie mechanicznych silników krokowych ściskanych lub rozciąganych na hydrożelu kolagenowym 3D otoczonym komórkami 3D7,10. Jednak takie urządzenia kontrolne wymagają dodatkowej przestrzeni i borykają się z problemem zanieczyszczenia w inkubatorze7,9,11,12. Ponadto duży instrument nie jest w stanie zapewnić precyzyjnego środowiska sterowania, aby zapewnić wysoką odtwarzalność13.
Biorąc pod uwagę, że hydrożele zawierające komórki są zwykle stosowane w mikroskali do zastosowań biomedycznych, korzystne jest połączenie technik MEMS w celu wygenerowania szeregu stymulacji szczepu/rozciągania w celu jednoczesnego badania zachowań komórek w konstruktach biomimetycznych 3D in vitro2,14,15,16,17,18. Na przykład użycie ciśnienia gazu do deformacji membrany PDMS w chipach mikroprzepływowych może spowodować powstanie różnych szczepów, napędzając różnicowanie komórek do różnych linii9,16. Istnieje jednak wiele wyzwań technicznych, takich jak skomplikowane procesy produkcji chipów w pomieszczeniu czystym oraz integracja oprogramowania sterującego silnikami, pompami, zaworami i sprężonymi gazami.
W tej pracy pokazujemy proste podejście do uzyskania samopodtrzymującego się gradientowego układu mikroprzepływowego o statycznym naprężeniu, wykorzystując koncentryczny okrągły wzór hydrożelu i elastyczną membranę PDMS. W przeciwieństwie do większości istniejących podejść, nasza platforma jest przenośnym i jednorazowym miniaturowym urządzeniem, które można wytworzyć poza żółtym pomieszczeniem i które posiada samogenerujące się szczepy gradientowe na koncentrycznych hydrożelach zamkniętych w komórkach, bez zewnętrznego sprzętu mechanicznego podczas inkubacji. Zachowanie komórek fibroblastów 3T3, na które wpływa kombinacja kształtu hydrożelu i różnych wskazówek dotyczących rozciągania przy rozciąganiu, wykazano podczas obserwacji wyrównania komórek w środowiskach 3D ECM-mimetycznych w chipie odkształcenia gradientowego przez 3 dni.

<table><tbody><tr><td>probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Argos Technologies&nbsp;</td><td>03-391-161</td><td>Ten można zastąpić neutralnym kolorem tubki 1,5 ml pokrytej folią aluminiową</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 falloidyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molekularna</td><td>Calcein</td><td>C1430</td><td>Do znakowania żywotnych komórek</td></tr><tr><td>CCD</td><td>PCO. Obrazowanie</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór przenikający przez błonę komórkową</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0,5% Triton X-100 do przenikania błony komórkowej</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Barwienie jądra komórkowego Membrana</td></tr><tr><td>dializowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Granica masy cząsteczkowej = 14 000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>żel o mocy 300, typ A, ze skóry świni</td></tr><tr><td>Elektroniczny generator koronowy wysokiej częstotliwości</td><td>Produkty elektrotechniczne</td><td>MODEL BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik metakrylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>50 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>IX71</td><td>Zawiera dwa zestawy filtrów: LF405/LP-B-000 i LF488/LP-C-000 firmy Semrock</td></tr><tr><td>Maszyna plazmowa</td><td>tlenowa Harrick plazma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Do mocowania komórki</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>Mieszanina do produkcji odlewów chipowych PDMS</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>penicylina/streptomycyna</td></tr><tr><td>Fotoinicjator</td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Do oznaczania martwych komórek</td></tr><tr><td>Sterylny kubek filtracyjny</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Do immobilizacji hydrożelu</td></tr><tr><td>Ultradźwięki</td><td>Delta</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>światło UV</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 (fibroblast)</td> <td>Instytut Badawczo-Rozwojowy Przemysłu Spożywczego (FIRDI)</td> <td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini automatyczny licznik komórek</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

gradient strain chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Sztuczne prowadzenie do wyrównania komórek to gorący temat w dziedzinie inżynierii tkankowej. Większość wcześniejszych badań dotyczyła wyrównania komórkowego wywołanego pojedynczym szczepem na hydrożelu obciążonym komórkami przy użyciu złożonych procesów eksperymentalnych i systemów kontroli masy, które zwykle wiążą się z problemami z zanieczyszczeniem. Dlatego w tym artykule proponujemy proste podejście do budowy gradientowego odkształcenia statycznego przy użyciu chipa fluidycznego z plastikową osłoną PDMS i przezroczystym szklanym podłożem UV do stymulacji zachowania komórkowego w hydrożelu 3D. Przeciążenie fotowzorcowego prepolimeru komórkowego w komorze fluidalnej może wytworzyć wypukłą, zakrzywioną membranę PDMS na pokrywie. Po usieciowaniu UV, poprzez koncentryczny kołowy mikrowzór pod zakrzywioną membraną PDMS i mycie bufora, mikrośrodowisko do badania zachowań komórek pod różnymi szczepami gradientowymi jest ustalane w pojedynczym chipie fluidycznym, bez zewnętrznych instrumentów. Komórki NIH3T3 wykazano po zaobserwowaniu zmiany trendu wyrównania komórek pod kierunkiem geometrii, we współpracy ze stymulacją szczepów, która wahała się od 15 do 65% na hydrożelach. Po 3-dniowej inkubacji geometria hydrożelu zdominowała ułożenie komórek pod obciążeniem o niskiej kompresji, gdzie komórki ustawiały się wzdłuż kierunku wydłużania hydrożelu pod wpływem silnego odkształcenia ściskającego. Pomiędzy nimi komórki wykazywały losowe wyrównanie ze względu na rozproszenie radykalnego kierowania wydłużeniem hydrożelu i przewodnictwa geometrycznego wzorzystego hydrożelu.

Aby porównać zmienność mechaniczną każdego okrągłego hydrożelu w ukończonym chipie do stymulacji gradientowym odkształceniem, zmierzono szerokości linii każdego okrągłego hydrożelu w dwóch takich samych chipach, odpowiednio przy objętościach wtrysku 0 µL (Rycina 4a) i 40 µL (Rycina 4b). Procentowe wydłużenie dla każdego okręgu obliczono poprzez podzielenie wydłużeń w chipie z wtryskiem 40 µL przez szerokości linii odpowiadających...

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Ogólnym celem tego gradientowego chipa odkształcającego jest zapewnienie prostego podejścia do generowania nieciągłych gradientowych odkształceń statycznych na hydrożelu 3D w celu zbadania zachowań komórek w szeregu warunków odkształcenia. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie bioinżynierii, takie jak stymulacja różnicowania komórek macierzystych i regulacja wyrównania komórkowego w celu rozwoju sztucznych narządów tkankowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że różne szczepy mogą być nakładane na warstwę komórkową i hydrożele w tym samym mikrośrodowisku w celu porównania zachowania komórek.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania chipa są trudne do nauczenia, ponieważ światło powinno być gotowe w ciągu trzech do czterech godzin, aby zapewnić dużą zmienność komórek. Zważ 10 gramów żelatyny w proszku i dodaj ją do szklanej kolby ze 100 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco lub DPBS. Włożyć mieszadło magnetyczne do kolby i umieścić kolbę na mieszającej płycie grzejnej.Przykryj kolbę folią aluminiową, aby uniknąć parowania wody. Ustaw temperaturę płyty grzejnej na 50 do 60 stopni, a mieszadło na 100 obr./min na godzinę, aby rozpuścić żelatynę w proszku. Po rozpuszczeniu żelatyny bardzo powoli dodawać osiem mililitrów bezwodnika metakrylowego za pomocą pipety.Pozwól mu reagować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie dodać podgrzany DPBS do kolby do końcowej objętości 500 mililitrów. Pozostaw roztwór do dobrego wymieszania przez 15 minut, aby zatrzymać reakcję.W międzyczasie przetnij membranę dializacyjną na kilka rurek o długości 25 milimetrów. Zanurz je w wodzie dejonizowanej na 15 minut. I zawiąż węzeł, aby zamknąć jeden koniec rurek dializacyjnych.Załadować odpowiednią ilość roztworu polimeru do rurek dializacyjnych i zamknąć drugi koniec. Następnie umieść napełnione probówki w pięciolitrowej plastikowej zlewce z wodą dejonizowaną na tydzień. Wodę dejonizowaną należy odnawiać dwa razy dziennie i utrzymywać roztwór w temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza podczas procesu dializy.Po dializie zebrać roztwór z probówek do szklanej butelki o pojemności 500 mililitrów. Wlej około 450 do 500 mililitrów roztworu do 500-mililitrowego kubka filtrującego. I zastosuj próżnię, aby wymusić przejście roztworu przez membranę filtracyjną w celu sterylizacji.Następnie przenieś wysterylizowany polimer do kilku 50-mililitrowych wysterylizowanych probówek. Przenieś wysterylizowany polimer do kilku 50-mililitrowych wysterylizowanych probówek i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni. Liofilizuj polimer o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez tydzień za pomocą liofilizatora, aby uzyskać GelMA, który można następnie przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Do produkcji chipów najpierw przygotuj polimetakrylan lub PMMA, graj i formuj zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przygotuj osłonę PTMS i zatyczkę PTMS, odpowiednio mieszając 30 gramów elastomeru PTMS i trzy gramy utwardzacza PTMS. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej na jedną godzinę.Wlej od 1,8 do dwóch gramów mieszanki do formy PMMA na osłonę PTMS. Użyj również odpowiedniej ilości, aby wypełnić każdą wnękę dla formy PMMA dla wtyczki PTMS. Dodatkowo odlać 10 gramów nieutwardzonej mieszaniny PTMS w pustej 10-centymetrowej plastikowej płytce.Umieść te foremki w komorze próżniowej, aby odgazować przez 30 minut. Utwardzaj PTMS przez dwie godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu utwardzonego PTMS na formie, należy zdjąć osłony PTMS i zaślepki PTMS z form PMMA.Następnie przebij dwa otwory o średnicy około trzech milimetrów na końcach kanałów przepływowych pokryw PTMS. Wytnij arkusz PTMS uformowany z 10-centymetrowej plastikowej płytki na wiele sześcianów o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. I wybij trzymilimetrowy otwór w każdej kostce PTMS.Przyklej dwie nieutwardzone kostki PTMS o wymiarach centymetr na jeden centymetr do otworów pokrywy PTMS, aby służyły jako zbiorniki medium i pomagały w procesie utwardzania gradientowych okrągłych wzorów hydrożelowych. Następnie utwardzaj przez godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie przymocuj pokrywy PTMS do dwóch zbiorników PTMS na szkiełku pokrytym TMSPMA.W tym celu należy wstępnie przygotować stronę łączącą pokrywę PTMS i szkiełko pokryte TMSPMA pod maszyną do plazmy tlenowej przez 90 sekund obróbki plazmą tlenową. Skontaktuj się z plazmową powierzchnią osłon PTMS i suwaka TMSPMA i mocno je dociśnij w celu trwałego połączenia poprzez utworzenie wiązania krzemowo-tlenowego. Wydrukuj fotomaskę, drukując ustalony układ na przezroczystej folii.Następnie przytnij wydrukowaną fotomaskę do rozmiaru 25 milimetrów na 37,5 milimetra. Zważyć 25 miligramów liofilizowanego GelMA w 0,3 mililitra podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych w 1,5 mililitrowej czarnej probówce do mikrowirówek. Umieść probówkę mikrowirówki na mieszadle laboratoryjnym na płycie grzejnej, aż GelMA rozpuści się w pożywce.Dodaj 50 miligramów fotoinicjatora do jednego mililitra DPBS w probówce do mikrowirówki. I umieść go w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 15 minut lub do momentu, gdy fotoinicjator się rozpuści. Dodać 25 mikrolitrów 10% fotoinicjatora do probówki mikrowirówkowej.Odpipetować kilka razy, aby dobrze wymieszać. Następnie policz trzy miliony komórek NIH3T3 za pomocą automatycznego licznika komórek. Po odwirowaniu zawiesiny o sile 200 G przez pięć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 175 mikrolitrach pożywki do hodowli komórkowych.Dodaj roztwór komórkowy do probówki mikrowirówki, aby uzyskać wstępny roztwór komórek polimerowych o stężeniu 5% GelMA, 0,5% fotoinicjatora i około sześciu milionów komórek 3T3 na mililitr. Po wymieszaniu załaduj 100 mikrolitrów prepolimeru komórkowego do mikrostrzykawki o pojemności 100 mikrolitrów. Ręcznie wyrównaj kawałek fotomaski na dolnym slajdzie wysterylizowanego gradientowego chipa odkształceniowego.I po prostu ustal pozycję, używając małej kropli wody dejonizowanej pomiędzy nimi. Podłącz mikrostrzykawkę o pojemności 100 mikrolitrów, wypełnioną roztworem ogniw prepolimerowych, do wlotu chipa. Następnie umieść 50 mikrolitrów roztworu komórek prepolimerowych w kanale przepływowym za pomocą mikrostrzykawki i zatkaj wylot za pomocą wtyczki PTMS.Wstrzyknąć dodatkowe 40 mikrolitrów roztworu, aby utworzyć wypukłe wybrzuszenie w okrągłej membranie PTMS. Przenieś chip z fotomaską, mikrostrzykawką i zatyczką PTMS pod lampę UV. I wystawiaj go na działanie promieni słonecznych przez 30 do 45 sekund, aby usieciować koncentryczny okrągły hydrożel w komorze fluidycznej.Po usieciowaniu wyjmij zatyczkę PTMS i mikrostrzykawkę, aby uwolnić ciśnienie cieczy. Użyj jednomililitrowej strzykawki wypełnionej wstępnie podgrzanym DPBS, aby trzykrotnie wypłukać nieusieciowane żywice, spłukując je od wlotu do wylotu. Następnie napełnij kanał przepływowy około 100 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych.Umieść chip w wysterylizowanym naczyniu hodowlanym i posiew w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na tydzień. Odświeżaj podłoże każdego dnia. Zrób zdjęcia trzech chipów w dniu zero po czterech godzinach inkubacji jako grupy kontrolnej.I trzy chipy w trzecim dniu jako zestaw eksperymentalny przy użyciu mikroskopu z obiektywem 20 razy. Zmierz szerokość linii każdego hydrożelu od linii pierwszej do linii 12 za pomocą oprogramowania do obliczenia plam kompresu. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki wzorów hydrożelowych z zerowym mikrolitrem i 40 mikrolitrami nad wstrzyknięciem, po sieciowaniu UV i czterogodzinnej inkubacji.Szerokość linii hydrożelu 3D w kontroli bez nadmiernego wtrysku wygląda jednolicie zgodnie z oczekiwaniami. Jednak wzory hydrożelowe z 40 mikrolitrami nad wstrzyknięciem dają gradientową szerokość linii hydrożeli zmniejszającą się od linii pierwszej do linii 12. Po trzech dniach inkubacji komórki w hydrożelu rozciągają się w różnych kierunkach.Komórki w linii pierwszej wyrównują się wzdłuż kierunku promieniowego dzięki stymulacji wydłużania hydrożelu. Wręcz przeciwnie, komórki w linii 12 wyrównują się wzdłuż kształtu hydrożelu, gdzie wskazówka geometryczna dominuje w wyrównaniu komórkowym. W wierszu 7 nie ma określonego wyrównania komórek, w którym dwie wskazówki wyrównania komórkowego linii pierwszej i linii 12 równoważą się nawzajem.Po zmierzeniu mikrośrodowiska odkształceń gradientowych na hydrożelu 3D można to zrobić za pomocą chipa odkształcenia gradientowego w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas próby tej procedury należy pamiętać o wysterylizowaniu gradientowego chipa odkształcenia przed załadowaniem roztworu prepolimeru ogniwa. Należy również dokładnie przetrzeć powierzchnię chipa 75% etanolem przed umieszczeniem chipów w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak wygenerować gradientowy chip odkształceniowy, aby zbadać zachowanie komórek pod różnymi szczepami imperialnymi.

gradient-strain-chip-for-stimulating-cellular-behaviors-cell-laden

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Poznaj metodę generowania gradientowych naprężeń statycznych w hydrożelu z komórkami do badania zachowań komórkowych. Ta technika umożliwia kontrolowane badanie wpływu mechanicznego na komórki w inżynierii tkanek.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Przeglądaj więcej filmów