Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster
24 marca 2016
Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia. Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.
Ogólnym celem tego testu wysokoprzepustowego jest zapewnienie prostej, wydajnej i skalowalnej platformy do identyfikacji genów i neuronów kontrolujących proste zachowanie wyboru u Drosophila. Główną zaletą tej metody jest w rzeczywistości możliwość przeprowadzania infekcji jako wyboru w stadium jaja, a także analiza pojedynczego zwierzęcia w sposób wysoce odpowiedni. Aby rozpocząć eksperyment, umieść osiem samic i sześć samców w wąskiej fiolce z pożywką wypełnionej standardowym medium dla much.
Następnie wykorzystaj żeńskie potomstwo wyhodowane z tej fiolki do eksperymentów dotyczących składania jaj. Od dwóch do trzech dni po wykluciu się samic przygotuj świeżą pastę drożdżową, mieszając sześć gramów aktywnych drożdży z 10 mililitrami 0,5% kwasu propionowego. Za pomocą szpatułki nanieś pastę drożdżową na ściankę boczną fiolek z pożywką.
Następnie należy umieścić w fiolkach 30 wcześniej zebranych samic po wyjściu z poczwarki oraz 20 samców. Po czterech dniach należy sprawdzić powierzchnię pożywki. Jeśli powierzchnia jest wilgotna z powodu aktywnego drążenia tuneli w pożywce przez larwy, oznacza to, że samice much są gotowe do eksperymentów dotyczących składania jaj.
Kontynuuj eksperyment, przygotowując wcześniej wykonane akrylowe komory do składania jaj. Wsuń plastikowe arkusze do góry, umieszczając element komory tak, aby służył jako powierzchnia dna. Następnie poddaj samice anestezji na podkładce z dwutlenkiem węgla i przenieś je pojedynczo do każdej z aren do składania jaj.
Pozostaw muchy na 30 minut, aby mogły dojść do siebie po działaniu dwutlenku węgla i zaadaptować się do nowego środowiska. Podczas aklimatyzacji much wypełnij probówkę agarozą do poziomu 10 ml, a następnie przygotuj 150 ml podłoża sacharozowego, wlewając do probówki 750 µl dwumolowego roztworu sacharozy. Przechowuj butelkę z roztopioną 1% agarozą w kąpieli wodnej.
Przygotuj podłoże zwykłe w ten sam sposób, zastępując roztwór sacharozy wodą destylowaną. Następnie pobierz element podłoża komory i nawiń 1 000 µL podłoża agarozowego do każdej rynienki. Odstaw agarozę na 30 minut w celu zestalenia.
Po przygotowaniu podłoży agarowych i much, złóż wszystkie trzy elementy komory do składania jaj, a następnie wyjmij plastikowe arkusze. Umieść komory w inkubatorach dla much na noc. Znieczul samice, wstrzykując do komory dwutlenek węgla.
Zdemontuj komorę i usuń znieczulone muchy. Na koniec wykonaj zdjęcia jaj w celu prowadzenia dokumentacji. Wskaźnik preferencji (PI) obliczono jako liczbę jaj złożonych przez samice much, gdy miały wybór między podłożem zwykłym a podłożem zawierającym sacharozę.
Samice wyraźnie preferowały zwykłe podłoże do składania jaj. Po zastosowaniu tej procedury inne metody, takie jak rejestracja radiowa, dają możliwość przeprowadzenia badań genetycznych w celu odpowiedzi na inne pytania, na przykład dotyczące zachowania much przed złożeniem każdego jaja.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy test służący do badania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster z rozdzielczością pojedynczego osobnika. Test ten stanowi prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów oraz elementów obwodów neuronalnych, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Genetyka
Wstęp
- Drosophila melanogaster jest organizmem modelowym do badania genetyki i zachowania.
- Preferencje w składaniu jaj są prostym zachowaniem wyboru, które można poddać analizie.
- Zrozumienie genetycznych i neuronalnych podstaw procesów podejmowania decyzji jest kluczowe w neuronauce.
- Ten test umożliwia analizę wysokoprzepustową na poziomie poszczególnych osobników.
Cel badania
- Identyfikacja genów wpływających na preferencje składania jaj u Drosophila.
- Badanie obwodów neuronalnych zaangażowanych w zachowania decyzyjne.
- Opracowanie skalowalnej metody testów behawioralnych w badaniach genetycznych.
Zastosowane metody
- Umieszczenie much *Drosophila* w kontrolowanym środowisku w celu obserwacji.
- Przygotowanie fiolek z pożywką standardową dla muszek do składania jaj.
- Aplikacja pasty drożdżowej w celu stymulacji zachowań związanych ze składaniem jaj.
- Obserwacja indywidualnych preferencji w wyborze miejsca składania jaj w czasie.
Główne wyniki
- Analiza ta pozwala na skuteczne zidentyfikowanie indywidualnych preferencji w składaniu jaj.
- Wariacje genetyczne mogą być powiązane z różnicami w zachowaniu.
- Można zmapować komponenty neuronalne zaangażowane w proces podejmowania decyzji.
- Metoda ta jest skalowalna dla większych badań genetycznych.
Wnioski
- Ten test wysokoprzepustowy jest skuteczny w badaniu zachowania Drosophila.
- Dostarcza on informacji na temat genetycznych i neuronalnych podstaw podejmowania decyzji.
- Podejście to można zastosować w różnych badaniach genetycznych i behawioralnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten wysokoprzepustowy test umożliwia systematyczny screening genetyczny zachowań decyzyjnych z rozdzielczością na poziomie pojedynczego zwierzęcia, rozwiązując kluczowy problem wąskiego gardła w walidacji celów w neurofarmakologii. Zapewniając skalowalne, ilościowe odczyty preferencji w składaniu jaj, wspiera on mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów neuronalnych i zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć. Platforma ta usprawnia ciągłość translacyjną od odkrycia genów po funkcję obwodów, bezpośrednio wpływając na selekcję projektów w rozwoju leków ukierunkowanych na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych łączących geny z prostymi zachowaniami wyboru w systemie podatnym na manipulacje genetyczne.
- Wartość operacyjna: Wspiera wysokoprzepustowe przesiewanie pojedynczych much, zwiększając efektywność kampaniiB visant do ograniczania ryzyka związanego z celami terapeutycznymi.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące indeksu preferencji (PI), które korelują wybór podłoża z zaburzeniami genetycznymi lub neuronalnymi, pomagając w ocenie pewności wyboru celu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych podłoży (zwyczajne vs. sacharozowe), które zapewniają mierzalne wyniki składania jaj, co umożliwia wiarygodny screening związków lub genotypów.
- Skalowalność: Komory mieszczą do trzydziestu poszczególnych much w jednym cyklu, co pozwala na równoległe testowanie bibliotek genetycznych.
- Powtarzalność: Spójne wyniki w powtórzeniach wspierają standaryzację analizy i międzyfunkcyjne udostępnianie danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje proste procesy podejmowania decyzji istotne dla endofenotypów zaburzeń neuropsychiatrycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ułatwia mapowanie obwodów neuronalnych zaangażowanych w zachowanie, zmniejszając niepewność co do docelowego mechanizmu działania.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia genetyczne z walidacją na poziomie obwodów, wspierając decyzje o dalszym rozwoju w procesach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację lidera, w szczególności w programach dotyczących OUN, w których fenotypy behawioralne determinują wybór celu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie manipulacji genetycznych lub neuronalnych z mierzalnymi zmianami w preferencjach składania jaj.
- Przesiewanie: Umożliwia wstępny screening modyfikatorów genetycznych z wykorzystaniem ilościowych wyników wskaźnika preferencji.
- Analityka: Obliczenie wskaźnika preferencji (PI) dostarcza znormalizowaną miarę do porównywania warunków w różnych eksperymentach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z funkcją obwodów neuronalnych, wspierając walidację celów zgodnych z biomarkerami.
- Powtarzalność w zastosowaniach: Konstrukcja komory pozwala na ponowne wykorzystanie w różnych badaniach dzięki dodatkom do optogenetyki lub rejestracji wideo, co sprzyja zrównoważonemu wykorzystaniu platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ścieżkach podejmowania decyzji dzięki rozdzielczości na poziomie pojedynczego zwierzęcia.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania muszek oraz montażu komory poprawia powtarzalność procesu pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w walidacji celów poprzez zwiększenie przepustowości fenotypowania behawioralnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko w oparciu o zbieżne dowody genetyczne i behawioralne.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w pracy z muszkami *Drosophila*, konfiguracji testów behawioralnych oraz podstawowej mikroskopii w celu ilościowego określenia liczby jaj.
- Metoda zależy od dostępu do narzędzi warsztatowych do wykonania komór akrylowych oraz systemów kontroli środowiskowej do inkubacji much i krzepnięcia agarozy.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania pasty drożdżowej oraz wylewania podłoża, aby zapewnić spójną motywację do składania jaj w kolejnych próbach.
- Kwestie adaptacyjne obejmują rodzaj podłoża (np. awersyjne vs. apetyczne) oraz modyfikacje komór w celu integracji z optogenetyką lub obrazowaniem.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ręcznego liczenia jaj, chyba że zastosuje się zautomatyzowaną analizę obrazu, co wynika z oparcia dokumentacji protokołu na rejestracji fotograficznej.
