Name: En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę wykrywania tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych DAF-2DA i DHE. Technika ta umożliwia badanie funkcji śródbłonka w modelach chorób sercowo-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (310030_141070/1), Szwajcarską Fundację Kardiologiczną oraz Narodowe Centrum Kompetencji w Badaniach (NCCR-Kidney.CH) w Szwajcarii. Yu Yi jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną.

Praca na zwierzętach została zatwierdzona przez Komisję Etyki Urzędu Weterynaryjnego we Fryburgu, Szwajcaria. Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i eksperymentów w naszej placówce.
1. Przygotowanie zestawu do inkubacji izolowanych tętnic
<ol>
	<li>Zbuduj system łaźni organowej, który może być podgrzewany do 37 °C i napowietrzany 95%O2 i 5% CO2 ze zbiornika na gaz węglowy.</li>
	<li>Przygotować tyle buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera, ile potrzeba, o stężeniu następującego składu: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 0,026 mM EDTA i 11,1 mM D-glukozy).</li>
	<li>Utrzymuj bufor zapasowy na lodzie i napowietrzaj bufor 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Włączyć system kąpieli organowej, ustawić temperaturę na 37 °C, dodać 5 ml gotowego do użycia buforu do każdej komory i kontynuować napowietrzanie buforu z 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Umyć komory raz buforem Krebs-Ringer przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu Krebsa-Ringera do każdej komory i przykryć komorę, aby uniknąć parowania.</li>
</ol>
2. Izolacja aort myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknąć pentobarbital, który rozpuszcza się w 0,9% NaCl dootrzewnowo w stężeniu 150 mg/kg w celu uśmiercenia myszy.</li>
	<li>Połóż mysz na wznak na desce chirurgicznej.</li>
	<li>Spryskaj sierść w okolicy klatki piersiowej 70% etanolem w celu odkażenia i nawilżenia.</li>
	<li>Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając żebro, aby odsłonić serce i płuca, a następnie usuń płuca.</li>
	<li>Delikatnie usuń krew z jamy klatki piersiowej za pomocą papierowej chusteczki higienicznej.</li>
	<li>Chwyć delikatnie serce kleszczami i odłącz aortę piersiową, przecinając okołonaczyniową tkankę tłuszczową między aortą a kręgosłupem nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Natychmiast zanurzyć całe tkanki w lodowatym (4 °C) buforze Krebsa-Ringera.</li>
	<li>Usuń serce i łuk aorty pod mikroskopem preparacyjnym i utrzymuj piersiowy odcinek aorty w buforze.</li>
	<li>Wypreparuj aortę wolną od przylegającej tkanki okołonaczyniowej pod mikroskopem za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.</li>
	<li>Chwyć końcową krawędź aorty kleszczami i wypłucz krew ze światła naczyniowego, delikatnie przepłukując bufor Krebsa-Ringera strzykawką 26 G × 1/2ʺ.</li>
	<li>Oczyszczone pierścienie aortalne pokrój na segmenty o długości 3 mm. 
	nuta: Na tym etapie zwróć uwagę, aby nie uszkodzić warstwy śródbłonka.</li>
</ol>
3. Barwienie DHE i DAF-2DA
<ol>
	<li>Oczyszczone segmenty aorty przenieść za pomocą kleszczyków do komór kąpieli narządowej wypełnionych buforem Krebsa-Ringera w temperaturze 37 °C, napowietrzonym 95%O2 i 5% CO2, 
	Uwaga: Dotykaj kleszczami tylko przybyszowej strony pierścieni aortalnych i nie zaciskaj naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Wyrównać tętnice w komorze do kąpieli narządowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać acetylocholinę (ACh) do kąpieli narządowej do końcowego stężenia 1 μM i inkubować tętnice przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu DHE/DAF-2DA (5 μM każdego barwnika, rozcieńczonego z 1 000× bulionu) ze wstępnie podgrzanym buforem Krebsa-Ringera w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Owiń probówkę mikrowirówki folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
	<li>Po stymulacji przenieść pierścienie aortalne z kąpieli narządowej do roztworu DHE/DAF-2DA w probówce mikrowirówkowej w temperaturze 37 °C napowietrzonej 95%O2 i 5% CO2 i inkubować pierścienie aortalne przez 30 min. 
	Uwaga: Od tego kroku utrzymuj aorty zawsze w ciemności.</li>
	<li>Przenieść pierścienie aortalne do nowej probówki mikrowirówkowej z buforem Krebsa-Ringera do płukania i powtórzyć płukanie trzy razy w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Przenieś pierścienie aorty do 4% roztworu paraformaldehydu w celu utrwalenia przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (300 nM, rozcieńczonego z 1 000× bulionu) z buforem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przeciwbarwione aorty przez 3 min.</li>
	<li>Przenieść aorty do nowej probówki mikrowirówkowej z buforem PBS do płukania przez 1 min. Powtórzyć mycie trzy razy. 
	Uwaga: Zwróć uwagę, aby nie zacisnąć pierścieni aortalnych ani nie uszkodzić warstwy śródbłonka.</li>
</ol>
4. Montaż En Face
<ol>
	<li>Dodaj kroplę podłoża montażowego do szkiełka.</li>
	<li>Przeciąć pierścienie aorty wzdłużnie nożyczkami mikrochirurgicznymi pod mikroskopem, spłaszczyć zwinięte aorty i zamontować je twarzą na podłożu montażowym ze śródbłonkiem skierowanym w dół na szkiełku podstawowym. Nie poruszaj aortami do przodu i do tyłu.</li>
	<li>Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci.</li>
	<li>Po wyschnięciu na powietrzu w osłonie świetlnej można użyć szkiełek do obrazowania bezpośrednio w ciągu kilku godzin lub przechowywać je w temperaturze -20 °C przez kilka następnych dni.</li>
</ol>
5. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego, aby wykryć sygnały fluorescencyjne. Włącz maszynę i zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak powiększenie, prędkość skanowania, rozdzielczość, stos Z.
	<ol>
		<li>W przypadku tego protokołu należy użyć prędkości skanowania 200 Hz, rozdzielczości 1,024 × 1,024 pikseli i rozmiaru kroku Z 0,25 μm. Wzbudzić fluorescencję z DAF-2DA za pomocą lasera argonowego 488 nm i wykryć przy 515 nm, podczas gdy wzbudzić fluorescencję z DHE przy 514 nm i wykryć przy emisji 605 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj 10-krotnych powiększeń, aby ustawić ostrość na próbce, aż sygnał DAPI będzie czysty za pomocą promieni ultrafioletowych, a następnie dostosuj obiektyw do 40-krotnych powiększeń.</li>
	<li>Zdefiniuj zakres warstwy śródbłonka, dostosowując położenie Z na panelu sterowania. Sygnałami jąder barwionych DAPI są owalne lub okrągłe kropki w warstwie śródbłonka.</li>
	<li>Zeskanuj od góry (warstwa śródbłonka na granicy światła) próbki przez pełną grubość sygnału śródbłonka i zarejestruj obrazy. Wybierz co najmniej 3 różne pola do skanowania każdej próbki.</li>
</ol>
6. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania, aby otworzyć dane zeskanowane przez mikroskop konfokalny. Wybierz trzy kolejne obrazy z każdego pola do analizy i oceń co najmniej 3 różne pola na próbkę. Wyeksportuj wybrane obrazy i zapisz je jako pliki JPEG.</li>
	<li>Określ ilościowo obrazy z barwienia DAF-2DA, DHE i DAPI za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Aby uzyskać obraz z barwienia DAPI, wybierz "Wtyczki"→"Analizuj"→"Licznik komórek", aby policzyć liczbę dodatnich jąder DAPI.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazów z barwienia DAF-2DA i DHE wybierz "Analizuj" → "Zmierz", aby przeanalizować intensywność sygnałów i przyjmij wartość "Średnia" jako względną intensywność sygnału. Następnie przedstaw wyniki jako stosunek jąder dodatnich DAF-2DA do DAPI lub stosunek DHE do DAPI. Dla każdej próbki należy wziąć średnią wartość każdego obrazu i pola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel wynik każdej próbki przez średnią z grupy kontrolnej, aby uzyskać zmianę krotności. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu Studenta t lub ANOVA z posttestem Dunnetta lub Bonferroniego. Podaj dane jako średnią±SEM. Rozważ różnice w średnich wartościach jako znaczące przy p<0,0514.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase%3A+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149(2013).</li>
<li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthases%3A+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+endothelial+dysfunction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis.</a> Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).</li>
<li>Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+endothelial+dysfunction+by+modulating+NOS+uncoupling%3A+new+insights+into+its+pathogenesis+and+therapeutic+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).</li>
<li>Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nitrate%2C+nitrite%2C+and+%5B15N%5Dnitrate+in+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids.</a> Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).</li>
<li>Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+nitric+oxide+from+L-arginine+in+the+central+nervous+system%3A+a+transduction+mechanism+for+stimulation+of+the+soluble+guanylate+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).</li>
<li>Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+bioassay+method+for+detection+of+EDRF+with+RFL-6+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).</li>
<li>Guo, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+C-type+natriuretic+peptide+on+spontaneous+contraction+in+gastric+antral+circular+smooth+muscle+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat.</a> Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).</li>
<li>Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cells+synthesize+nitric+oxide+from+L-arginine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine.</a> Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).</li>
<li>Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+L-arginine+and+its+significance+for+the+biosynthesis+of+endothelium-derived+relaxing+factor%3A+cultured+endothelial+cells+recycle+L-citrulline+to+L-arginine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).</li>
<li>Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nitric+oxide+production+from+a+perfused+organ+by+a+luminol-H2O2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system.</a> Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).</li>
<li>Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+nitric+oxide+generation+in+the+ischemic+heart+using+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).</li>
<li>Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurement+using+electrochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurement using electrochemical methods.</a> Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).</li>
<li>Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+mitogen-activated+protein+kinase+is+involved+in+arginase-II-mediated+eNOS-Uncoupling+in+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity.</a> Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113(2014).</li>
<li>Nakatsubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+nitric+oxide+production+from+bovine+aortic+endothelial+cells+using+new+fluorescence+indicators%3A+diaminofluoresceins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins.</a> FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).</li>
<li>Hink, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+endothelial+dysfunction+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus.</a> Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).</li>
<li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glutaredoxin+in+human+coronary+arteries%3A+its+potential+role+in+antioxidant+protection+against+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).</li>
<li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+red+blood+cells+at+work%3A+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li>
<li>Nunez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+between+nitroglycerin+and+NO-releasing+drugs+on+mitochondrial+oxygen+consumption%2C+vasoactivity%2C+and+the+release+of+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO.</a> Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).</li>
<li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus%3A+role+of+NAD%28P%29H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li>
<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling%3A+the+molecular+interface+connecting+metabolic+stress%2C+aging+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases.</a> Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).</li>
<li>Yepuri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+crosstalk+between+arginase-II+and+S6K1+in+vascular+endothelial+inflammation+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging.</a> Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).</li>
<li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox1+is+involved+in+angiotensin+II-mediated+hypertension%3A+a+study+in+Nox1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice.</a> Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wykrywanie NO lub O2.− za pomocą barwników fluorescencyjnych było często stosowane w wielu badaniach na hodowanych komórkach śródbłonka, a także w kriosekcjach tkanek23. Tutaj rozszerzyliśmy tę metodę na nienaruszone żywe naczynia krwionośne, tj. wykrywanie en face poziomów NO iO2. − w warstwie śródbłonka odpowiednio za pomocą DAF-2DA i DHE, co jest skuteczne, stosunkowo proste i intuicyjne. W porównaniu z metodą kriosekcji naczyniowych, metoda ta w...

Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych utrzymują funkcjonalną i strukturalną integralność naczyń krwionośnych poprzez uwalnianie czynników wazoaktywnych1. Wśród tych czynników tlenek azotu (NO) pochodzący ze śródbłonka wytwarzany z L-argininy za pośrednictwem śródbłonkowej syntazy NO (eNOS) jest najważniejszym i najlepiej scharakteryzowanym czynnikiem w fizjologii układu sercowo-naczyniowego2. NO powoduje rozluźnienie mięśni gładkich i hamuje proliferację komórek, hamuje agregację płytek krwi oraz adhezję i infiltrację komórek zapalnych do przestrzeni podśródbłonkowej, chroniąc w ten sposób przed rozwojem chorób naczyniowych3. W wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, w tym starzeniu się, nadciśnieniu, cukrzycy, hiperlipidemii itp., Występuje dysfunkcja śródbłonka charakteryzująca się zmniejszoną biodostępnością NO i zwiększoną produkcjąO2.- i sprzyja patogenezie miażdżycy2. Badania z ostatnich lat pokazują, że rozprzęganie eNOS jest ważnym mechanizmem dysfunkcji śródbłonka, w którym enzym eNOS wytwarza O2.- zamiast NO, w różnych wyżej wymienionych warunkach1,4. Dlatego analiza funkcji śródbłonka, w szczególności śródbłonkowej produkcji NO i generacjiO2.- ma kluczowe znaczenie dla badań eksperymentalnych nad chorobami sercowo-naczyniowymi i powikłaniami.
Istnieje wiele metod metodologicznych, które zostały opracowane do analizy i pomiaru produkcji NO w próbkach biologicznych. Ze względu na niezwykle labilną naturę NO, który łatwo utlenia się do NO2- i NO3- o okresie półtrwania od 3 do 6 sekund, trudno jest zmierzyć NO bezpośrednio. W związku z tym oznaczenie NO2-/NO3- w próbkach płynów zastosowano jako wskaźnik NO uwalnianego z komórek lub tkanek5. Chociaż procedura jest stosunkowo łatwa, na metodę łatwo wpływa wysokie tło stabilnego NO2-/NO3- zawartego w roztworze. Ponieważ NO stymuluje rozpuszczalną cyklazę guanylanową do wytwarzania cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP)6, określono również komórkowy poziom cGMP w celu oszacowania uwalniania NO7. Ponownie, jest to pośrednie oszacowanie i może nie być specyficzne, ponieważ niektóre czynniki pochodzące ze śródbłonka, takie jak peptyd natriuretyczny typu C (CNP), mogą również zwiększać poziomy cGMP poprzez aktywację cyklazy guanylanowej w cząstkachstałych 8. NO jest wytwarzany z L-argininy z wytwarzaniem L-cytruliny jako produktu ubocznego9, pomiar produkcji L-cytruliny jest zatem również stosowany jako pośrednia metoda szacowania produkcji NO. Głównymi wadami tej metody jest to, że jest ona radioaktywna i nie mierzy bioaktywnych poziomów NO, ponieważ uwolniony NO może zostać szybko dezaktywowany przez O2.−; Co więcej, L-cytrulina może być przetworzona do L-argininy10. Inne metody chemiczne, takie jak detekcja chemiluminescencji11, elektronowy rezonans spinowy12 lub elektrochemiczny porfirowy czujnik NO13, są stosowane przez kilku badaczy. Metody te zwykle nie są łatwe w obsłudze, procedurach wykrywania i wymagają specjalnego sprzętu. Należy również wspomnieć, że w wielu badaniach stosuje się eksperymenty z kąpielą narządową z izolowanymi naczyniami krwionośnymi ze śródbłonkiem lub bez niego w celu oceny funkcji śródbłonka i pośredniego pomiaru relaksacji naczyń krwionośnych za pośrednictwem śródbłonka. Jednak ta metoda, chociaż jest w większości zbliżona do sytuacji fizjologicznej, ale ściśle mówiąc, nie mierzy funkcji NO, raczej ocenia ogólne reakcje naczynioruchowe za pośrednictwem śródbłonka, które odzwierciedlają efekty netto funkcji eNOS, produkcji innych czynników relaksacyjnych pochodzących ze śródbłonka i czynników kurczących się pochodzących ze śródbłonka, produkcji O2., a także reakcje komórek mięśni gładkich na te czynniki. Zwykle wymagana jest szczegółowa analiza funkcji eNOS lub produkcji NO3.
Wiele grup badawczych, w tym nasza, w ostatnich latach używało metody barwnika fluorescencyjnego do wykrywania wewnątrzkomórkowej produkcji NO14-19. W metodzie tej do pomiaru funkcji wolnego NO i NOS w żywych komórkach i tkankach in vitro lub ex vivo wykorzystano przepuszczalny dla komórek dioctan diaminofluoresceiny-2 (DAF-2DA). Zasada jest taka, że w żywych komórkach DAF-2DA jest deacetylowany przez wewnątrzkomórkową esterazy do niefluorescencyjnej 4,5-diaminofluoresceiny (DAF-2), która następnie została przekształcona w fluorescencyjną triazol DAF-2 (DAF-2T) w reakcji z NO. Fluorescencję z DAF-2T można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym lub fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym 14. Intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej odzwierciedla zatem wewnątrzkomórkową produkcję NO w komórkach lub śródbłonku w nienaruszonym naczyniu krwionośnym. W połączeniu ze specyficznym barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak dihydroethidium (DHE), można jednocześnie ocenić wewnątrzkomórkowe wytwarzanie NO iO2. − w komórkach lub naczyniach krwionośnych14. Podobnie, DHE jest również związkiem przepuszczalnym dla komórek, który jest utleniany przez O2. - wewnątrz komórek, a produkt utleniania następnie interkaluje z kwasami nukleinowymi, wydzielając jaskrawoczerwony kolor wykrywalny ilościowo przez mikroskop fluorescencyjny lub fluorescencyjny mikroskop konfokalny. DHE jest bardzo specyficznym barwnikiem do wykrywania O2. - z próbek biologicznych, ponieważ wykrywa zasadniczo rodniki ponadtlenkowe, jest dobrze zatrzymywany przez komórki i może nawet tolerować łagodne wiązanie20. Jedną z zalet tej metody barwnika fluorescencyjnego jest to, że wykrywa i wizualizuje NO i/lub O2 − en face bezpośrednio na nienaruszonej warstwie śródbłonka żywego naczynia krwionośnego.
W tym artykule opisujemy tę metodę barwnika fluorescencyjnego do wykrywania NO i O2.− którą dostosowaliśmy do wykrywania en face NO i O2.− w nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości wywołanej przez karmienie dietą wysokotłuszczową (HFD). Wykazaliśmy, że ta metoda może z powodzeniem i wiarygodnie mierzyć poziomy NO iO2. − oraz oceniać funkcję (dys) eNOS w warstwie śródbłonka świeżo izolowanych nienaruszonych aort myszy w otyłości.

<table><tbody><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>rozpuścić w DMSO do 5&nbsp; mmol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Diaminofluoresceina-2 Dioctan (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>rozpuścić w DMSO do 5&nbsp; mmol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>rozpuścić w wodzie do 300&nbsp; &mikro; mol/L jako 1 000x zapas, przechowywany w temperaturze 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Vector robocizna. (REACTOLAB)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&#969; Chlorowodorek estru metylowego -nitro-L-argininy (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&nbsp;</td><td>Duński mikroskop Myo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr> Mikroskop konfokalny <tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DM6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td><td>S& T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki mikrochirurgiczne&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>S& T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe o średnicy okrągłej 15&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wskazówki 200 &#956; l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>Chlorek acetylocholiny</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Tlenek azotu (NO) pochodzący ze śródbłonka wytwarzany z śródbłonkowej syntazy NO (eNOS) jest jedną z najważniejszych cząsteczek wazoprotekcyjnych w fizjologii układu krążenia. Dysfunkcyjne eNOS, takie jak rozprzęganie eNOS, prowadzi do zmniejszenia biodostępności NO i wzrostu produkcji anionów ponadtlenkowych (O2.−), a to z kolei sprzyja chorobom sercowo-naczyniowym. Dlatego odpowiedni pomiar poziomów NO iO2.− w komórkach śródbłonka ma kluczowe znaczenie dla badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi i powikłaniami. Ze względu na niezwykle labilną naturę NO i O2 − trudno jest zmierzyć NO i O2 − bezpośrednio w naczyniu krwionośnym. Opracowano wiele metod pomiaru produkcji NO iO2. Jest jednak albo niewrażliwy, albo niespecyficzny, albo wymagający technicznie i wymaga specjalnego sprzętu. Tutaj opisujemy adaptację metody barwnika fluorescencyjnego do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji en face wewnątrzkomórkowych NO iO2. − przy użyciu przepuszczalnego dla komórek dioctanu diaminofluoresceiny-2 (DAF-2DA) i dihydroetydydy (DHE), odpowiednio, w nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości wywołanej karmieniem dietą wysokotłuszczową. Mogliśmy wykazać zmniejszone wewnątrzkomórkowe poziomy NO i zwiększone O2. − w świeżo izolowanych nienaruszonych aortach myszy otyłej w porównaniu z kontrolną szczupłą myszą. Wykazaliśmy, że metoda ta jest łatwą techniką bezpośredniego wykrywania i wizualizacji NO iO2. − w nienaruszonych naczyniach krwionośnych i może być szeroko stosowana do badania (dys)funkcji śródbłonka w warunkach (fizjo)patologicznych.

Otyłość jest istotnym czynnikiem ryzyka niedokrwiennej choroby wieńcowej i wiąże się ze zmniejszoną biodostępnością endotelialnego NO, co jest cechą charakterystyczną dla miażdżycowej choroby naczyń21. Wykazano, że rozsprzęganie eNOS jest istotnym mechanizmem dysfunkcji śródbłonka w wielu warunkach fizjologicznych i patologicznych, w tym podczas starzenia się organizmu2, w miażdżycy oraz otyłości14. W związku z tym, w niniejszej pracy porównujemy myszy szc...

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne wykrywanie wewnątrzkomórkowego tlenku azotu i anionów ponadtlenkowych przy użyciu barwników fluorescencyjnych DAF-2DA oraz DHE w świeżo wyizolowanych, nienaruszonych aortach myszy. Metoda ta może być pomocna dla badaczy z zakresu fizjologii układu sercowo-naczyniowego w przypadkach takich jak dysfunkcja śródbłonka i rozsprzęganie eNOS. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej i precyzyjnej metody bezpośredniego wykrywania i wizualizacji tlenku azotu oraz anionu ponadtlenkowego ex vivo jednocześnie w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.W celu realizacji niniejszego protokołu należy skonstruować układ kąpieli organowej, który może być podgrzewany do 37 °C i napowietrzany mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla z butli z gazem. Na początku należy przygotować odpowiednią ilość świeżego buforu Krebsa-Ringera z wodorowęglanami, niezbędną do kąpieli badanych tkanek. Przykładowo, w jednym eksperymencie z użyciem aorty wymagane jest 200 ml.Włącz system kąpieli organowej i ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Po wypłukaniu komór buforem Krebsa-Ringera z wodorowęglanami, dodaj pięć mililitrów buforu Krebsa-Ringera z wodorowęglanami do każdej komory i włącz dopływ gazu, aby napowietrzać roztwór mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Pozostaw komory przykryte.Należy również przygotować butelkę lodowatego buforu Krebsa-Ringera z wodorowęglanem i napowietrzaniem. Po wycięciu aorty piersiowej należy natychmiast zanurzyć całą tkankę w naczyniu z lodowatym buforem Krebsa-Ringera. Pod mikroskopem stereoskopowym należy usunąć serce oraz łuk aorty, utrzymując odcinek aorty piersiowej w buforze.Następnie, za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety, wypreparuj aortę, usuwając przylegającą tkankę okołonaczyniową. Dalej, chwyć krawędź tkanki pęsetą i delikatnie wypłucz krew z światła naczynia, używając lodowatego buforu Krebsa-Ringera podawanego za pomocą strzykawki. Skrzepy krwi w świetle naczynia muszą zostać usunięte, ponieważ mogą one generować sztuczne sygnały i zakłócać sygnały fluorescencyjne; jednocześnie należy kontrolować siłę płukania, aby nie uszkodzić warstwy śródbłonka.Następnie należy pociąć oczyszczone pierścienie aorty na segmenty o długości trzech milimetrów. Po przygotowaniu oczyszczonych pierścieni aorty należy je zabarwić. Chwytając pęsetą wyłącznie stronę błony zewnętrznej pierścieni aorty, bez zaciskania naczyń krwionośnych, przenieść oczyszczone segmenty aorty do przygotowanych komór kąpieli organowej.Pozostaw tętnice do równowagi w buforze na 30 minut. Po pół godzinie dodaj do kąpieli organowej acetylocholinę, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM, i inkubuj tętnice z acetylocholiną przez 10 minut. W tym czasie w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml przygotuj 1 ml roztworu barwiącego z uprzednio ogrzanym buforem Krebsa.Następnie owiń probówkę folią, aby zminimalizować ekspozycję na światło, i inkubuj ją w temperaturze 37°C. Po stymulacji acetylocholiną przenieś pierścienie aorty z kąpieli organowej do probówki z roztworem barwiącym i inkubuj je przez 30 minut w ciemności z napowietrzaniem. Wszystkie kolejne etapy powinny być przeprowadzane przy minimalnej ekspozycji na światło.Następnie przenieś pierścienie aorty do nowej probówki wypełnionej buforem Krebsa na jedną minutę. Powtórz ten etap płukania trzy razy. Następnie utrwal pierścienie aorty w kąpieli z 4% roztworu paraformaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po etapie fixacji przenieś pierścienie do roztworu DAPI na trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby zastosować przeciwbarwienie. Następnie przemyj pierścienie aorty w PBS trzy razy po jednej minucie każdego płukania. Podczas przemieszczania pierścieni zawsze zachowaj ostrożność ze względu na delikatność tkanki śródbłonka.Pod mikroskopem, za pomocą nożyczek mikrosurgicalnych, przetnij pierścienie aorty wzdłużnie na szkiełku przedmiotowym. Następnie usuń nadmiar płynu z aorty, dbając o to, aby pozostała ona wilgotna. Za pomocą dwóch pęset mikrosurgicalnych dociśnij zwinięte aorty do szkiełka przedmiotowego tak, aby śródbłonek był skierowany w stronę szkła.W tym procesie nie należy przesuwać aorty w przód i w tył. Ten krok jest bardzo krytyczny, ale trudny do wykonania. Zaleca się odpowiednie przećwiczenie go przed przystąpieniem do właściwego eksperymentu.Następnie nanieś medium montażowe na aortę. Przykryj preparat i uszczelnij go lakierem do paznokci. Po wysuszeniu na powietrzu w ciemności, wykonaj obrazy preparatów przy użyciu mikroskopii konfokalnej.Należy zastosować prędkość skanowania 200 hertz, rozdzielczość 1024 x 1024 pikseli oraz rozmiar stosu z (z-stack) wynoszący ćwierć mikrona. Aby zaobserwować DAF-2DA, należy użyć lasera argonowego, ustawiając fluorescencję wzbudzenia na 488 nanometrów, a detekcję emisji na 515 nanometrów. Aby zaobserwować DHE, należy ustawić fluorescencję wzbudzenia na 514 nanometrów oraz detekcję na 605 nanometrów.Po ustawieniu ostrości przy powiększeniu 10x, zmień obiektyw na powiększenie 40x. Następnie, wykorzystując jako punkty orientacyjne jądra barwione DAPI, określ zakres warstwy endotelialnej poprzez regulację pozycji z w panelu sterowania. Następnie wykonaj skan od warstwy endotelialnej na granicy światła naczynia przez pełną grubość warstwy endotelialnej i zarejestruj obrazy.Zeskanuj co najmniej trzy różne pola widzenia dla każdej próbki. Młode myszy C57 black 6 stały się otyłe w wyniku podawania diety wysokotłuszczowej przez 14 tygodni. Grupie kontrolnej podawano standardową karmę.Po 14 tygodniach zbadano ich tętnice klatki piersiowej. Przed barwieniem tkanki eksponowano na inhibitor eNOS L-NAME przez godzinę w stężeniu 1 nM. Sygnał z DAF-2T, widoczny w kolorze zielonym, powstaje w wyniku konwersji niefluorescencyjnego DAF-2 przez tlenek azotu.Zatem barwienie sugeruje obecność tlenku azotu w komórce. Podobnie, w wyniku utlenienia przez anion ponadtlenkowy, DHE emituje czerwony sygnał fluorescencyjny. Zatem próbki wykazujące intensywniejszy czerwony kolor zawierają więcej anionów ponadtlenkowych w komórkach.Ilościowa analiza obrazów fluorescencyjnych uzyskanych za pomocą mikroskopu konfokalnego wykazała spadek produkcji tlenku azotu oraz wzrost generowania anionorodnika ponadtlenkowego wrażliwego na L-NAME w warstwie śródbłonka aorty myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Dane te wspierają tezę, że otyłość prowadzi do rozprzęgania eNOS. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat metod wykrywania tlenku azotu i anionów ponadtlenkowych oraz zastosowania barwników fluorescencyjnych w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje sześć godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu nienaruszonej warstwy śródbłonka przez cały czas trwania operacji. Należy również zawsze zanurzać naczynia krwionośne w buforze Krebsa-Ringera, aby utrzymać żywotność komórek śródbłonka przed etapem utrwalania.Łącząc tę procedurę z innymi metodami, takimi jak analiza odpowiedzi naczynioruchowych naczyń krwionośnych, można odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące funkcji fizjologicznej komórek śródbłonka w regulacji napięcia naczyniowego.

en-face-detection-nitric-oxide-superoxide-endothelial-layer-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.

Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Test NU-ELISA (Nucleosome ELISA) jest czułą i ilościową metodą wykrywania ogólnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylacje, acetylacje i fosforylacje w konkretnych resztach aminokwasowych histonów, dzięki czemu NU-ELISA stanowi globalny test proteomiczny ogólnego stanu modyfikacji chromatyny w określonych typach komórek.

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Poznaj metodę wykrywania tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych DAF-2DA i DHE. Technika ta umożliwia badanie funkcji śródbłonka w modelach chorób sercowo-naczyniowych.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Przeglądaj więcej filmów