En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic
25 lutego 2016
W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.
Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne wykrywanie wewnątrzkomórkowych anionów tlenku azotu i ponadtlenkowego za pomocą barwnika fluorescencyjnego DAF-2DA i DHE w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach myszy. Ta metoda może pomóc w laboratoryjnym odzyskaniu przypadku badacza w dziedzinie fizjologii układu sercowo-naczyniowego, takiego jak dysfunkcja śródbłonka i rozprzęgnięcie eNOS. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej i precyzyjnej metody bezpośredniego wykrywania i wizualizacji ex vivo tlenku azotu i anionu ponadtlenkowego jednocześnie w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.
Na potrzeby tego protokołu należy zbudować system kąpieli organowych, który można podgrzać do 37 stopni Celsjusza i napowietrzyć 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla ze zbiornika na gaz węglowy. Na początek przygotuj wystarczającą ilość świeżego buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera, zgodnie z potrzebami, aby wykąpać interesujące Cię tkanki. Na przykład w jednym eksperymencie potrzeba 200 mililitrów na aorty.
Włącz system kąpieli organowej i ustaw regulację temperatury na 37 stopni Celsjusza. Po umyciu komór buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera, dodaj pięć mililitrów buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera do każdej komory i włącz gaz, aby napowietrzyć go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Utrzymuj komory pod przykryciem.
Przygotuj również butelkę lodowatego buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera z napowietrzaniem. Po wycięciu aorty piersiowej należy natychmiast zanurzyć całą tkankę w naczyniu z lodowatym buforem Krebsa-Ringera. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń serce i łuk aorty, pozostawiając piersiowy odcinek aorty w buforze.
Następnie należy wyciąć aortę z przylegającej tkanki okołonaczyniowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Następnie za pomocą kleszczy chwyć krawędź tkanki i delikatnie wypłukać krew ze światła naczyń za pomocą lodowatego buforu Krebsa-Ringera dostarczonego ze strzykawki. Skrzepy krwi w świetle naczyń krwionośnych muszą zostać wypłukane, ponieważ mogą powodować sztuczne sygnały i zakłócać sygnały fluorescencyjne, a jednocześnie należy kontrolować siłę spłukiwania, aby nie uszkodzić warstwy śródbłonka.
Teraz pokrój oczyszczone pierścienie aortalne na segmenty o długości trzech milimetrów. Po przygotowaniu oczyszczonych pierścieni aortalnych należy je poplamić. Dotykając kleszczami tylko przybyszowej strony pierścieni aorty, bez zaciskania naczyń krwionośnych, przenieś oczyszczone odcinki aorty do przygotowanych komór do kąpieli narządowej.
Pozwól tętnicom zrównoważyć się w buforze przez 30 minut. Po pół godzinie dodaj acetylocholinę do kąpieli narządowej, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowca i inkubuj tętnice przez 10 minut z acetylocholiną. W międzyczasie w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej przygotuj mililitr roztworu barwiącego ze wstępnie podgrzanym buforem Krebsa.
Następnie zawiń probówkę w folię, aby zminimalizować ekspozycję na światło i utrzymuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po stymulacji acetylocholiną przenieś pierścienie aorty z kąpieli narządowej do probówki z roztworem barwiącym i pozwól im inkubować przez 30 minut w ciemności z napowietrzaniem. Wszystkie kroki od tego momentu powinny być wykonywane przy minimalnej ekspozycji na światło.
Następnie przenieś pierścienie aortalne do nowej rurki wypełnionej buforem Krebsa na minutę. Wykonaj ten krok prania trzy razy. Następnie utrwal pierścienie aortalne w kąpieli z 4% roztworem paraformaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po etapie utrwalania przenieś pierścienie do roztworu DAPI na trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby nałożyć przeciwplamę. Następnie przemyj pierścienie aortalne PBS trzy razy przez jedną minutę na mycie. Zawsze bądź wrażliwy na kruchość tkanki śródbłonka podczas przesuwania pierścieni.
Pod mikroskopem przeciąć pierścienie aortalne wzdłużnie nożyczkami mikrochirurgicznymi na szkiełku. Następnie usuń nadmiar płynu z aorty, utrzymując ją mokrą. Przyciśnij zwinięte aorty płasko do szkiełka ze śródbłonkiem skierowanym w dół na szkiełku za pomocą dwóch kleszczy mikrochirurgicznych.
W tym procesie nie poruszaj aortami do przodu i do tyłu. Ten krok jest bardzo krytyczny, ale nie jest łatwy w obsłudze. Lepiej jest dobrze poćwiczyć przed formalnym eksperymentem.
Następnie upuść podłoże montażowe na aortę. Przykryj szkiełko i uszczelnij je lakierem do paznokci. Po wysuszeniu na powietrzu w ciemności zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Użyj prędkości skanowania 200 Hz, rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli i rozmiaru stosu z wynoszącego ćwierć mikrona. Aby obserwować DAF-2DA, użyj lasera argonowego, ustaw fluorescencję wzbudzenia na 488 nanometrów, a detekcję emisji na 515 nanometrów. Aby zaobserwować DHE, ustaw fluorescencję wzbudzenia na 514 nanometrów i ustaw detekcję na 605 nanometrów.
Po ustawieniu ostrości za pomocą 10-krotnych powiększeń ustaw obiektyw na 40-krotne powiększenia. Teraz zdefiniuj zakres warstwy śródbłonka, dostosowując pozycję z na panelu sterowania, używając jąder barwionych DAPI jako punktów orientacyjnych. Następnie skanuj od warstwy śródbłonka na granicy światła przez całą grubość warstwy śródbłonka i rejestruj obrazy.
Zeskanuj co najmniej trzy różne pola widzenia dla każdej próbki. Młode myszy C57 Black 6 stały się otyłe poprzez karmienie dietą wysokotłuszczową przez 14 tygodni. Osoby kontrolne były karmione normalną karmą.
Po 14 tygodniach zbadano ich tętnice piersiowe. Przed barwieniem tkanki poddano działaniu inhibitora eNOS L-NAME przez godzinę w jednym nanomolu. Sygnał z DAF-2T, widoczny na zielono, jest przekształcany z niefluorescencyjnego DAF-2 przez tlenek azotu.
Tak więc barwienie sugeruje obecność tlenku azotu w komórce. Podobnie, po utlenieniu przez ponadtlenek, DHE wydziela czerwony sygnał fluorescencyjny. Tak więc próbki wykazujące bardziej czerwony kolor mają więcej ponadtlenku w komórkach.
Ilościowe określenie obrazów fluorescencji konfokalnej ujawniło spadek produkcji tlenku azotu i wzrost wrażliwego na L-NAME wytwarzania ponadtlenków w śródbłonku aorty myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Dane te potwierdzają pogląd, że rozprzęganie eNOS występuje w przypadku otyłości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać tlenek azotu i aniony ponadtlenkowe oraz stosowanie barwników fluorescencyjnych w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o zachowaniu pełnej powierzchni warstwy śródbłonka podczas całego zabiegu operacji. I zawsze zanurzaj naczynia krwionośne w buforze Krebsa-Ringera, aby utrzymać komórki śródbłonka przy życiu przed etapem fiksacji.
Łącząc tę procedurę, można wykonać inne pomiary, takie jak analiza reakcji naczynioruchowych naczyń krwionośnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak fizjologiczna funkcja komórek śródbłonka w regulacji napięcia naczyniowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół jednoczesnej detekcji i wizualizacji wewnątrzkomórkowego tlenku azotu (NO) oraz anionu ponadtlenkowego (O2−) w świeżo izolowanych, nienaruszonych aortach myszy z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych DAF-2DA i DHE. Metoda ta jest stosowana do badania funkcji i dysfunkcji śródbłonka, szczególnie w kontekście naczyniowych zmian indukowanych przez otyłość, zapewniając prosty i precyzyjny sposób analizy stanu oksydacyjnego naczyń ex vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Biologia naczyniowa
- Badania nad komórkami śródbłonka
Wprowadzenie
- Tlenek azotu (NO) pochodzenia śródbłonkowego jest kluczową cząsteczką wazoprotekcyjną produkowaną przeztlenkazy azotu śródbłonkowe (eNOS).
- Dysfunkcyjna eNOS, na przykład w wyniku rozsprzęgania, prowadzi do zmniejszenia poziomu NO i zwiększenia ilości anionu ponadtlenku (O2−), co przyczynia się do rozwoju chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Bezpośredni pomiar NO i O2− w naczyniach krwionośnych jest trudny ze względu na ich niestabilną naturę.
- Istniejące metody detekcji są często mało czułe, nieswoiste lub wymagające pod względem technicznym.
Cel badania
- Zapewnienie prostej, bezpośredniej i jednoczesnej metody wykrywania i wizualizacji NO oraz O2− w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.
- Ocena funkcji śródbłonka i stresu oksydacyjnego w modelu mysim dysfunkcji naczyniowej indukowanej otyłością.
- Umożliwienie szerszego zastosowania tej techniki w badaniach nad (dys)funkcją śródbłonka w różnych warunkach (fizjo)patologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie układu kąpieli organowej z kontrolą temperatury i gazów do utrzymania tkanek ex vivo.
- Disekcja i oczyszczanie aorty piersiowej myszy, a następnie przygotowanie pierścieni aortalnych.
- Barwienie segmentów aorty barwnikami DAF-2DA (dla NO) i DHE (dla anionów ponadtlenkowych), z wykorzystaniem stymulacji acetylocholiną i hamowania za pomocą L-NAME jako kontroli.
- Fixacja, przeciwbarwienie DAPI oraz montaż tkanki do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
- Ilościowa analiza sygnałów fluorescencji w celu oceny poziomu NO i anionów ponadtlenkowych w warstwie śródbłonka.
Główne wyniki
- Myszy otyłe (dieta wysokotłuszczowa) wykazały zmniejszoną produkcję NO i zwiększoną generację anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach śródbłonka aorty w porównaniu z chudymi grupami kontrolnymi.
- Obrazowanie fluorescencyjne umożliwiło wyraźną wizualizację i kwantyfikację sygnałów NO (zielony, DAF-2T) oraz anionorodnika ponadtlenkowego (czerwony, DHE).
- Metoda wykazała czułość na inhibicję eNOS (L-NAME), co potwierdziło specyficzność detekcji NO i anionorodnika ponadtlenkowego.
- Protokół pozwolił na zachowanie integralności i żywotności śródbłonka przez cały czas trwania procedury.
Wnioski
- Ta technika oparta na fluorescencji umożliwia bezpośrednią, jednoczesną detekcję NO i anionów ponadtlenkowych w nienaruszonych naczyniach krwionośnych.
- Metoda ta jest przystępna, powtarzalna i odpowiednia do badań funkcji śródbłonka w różnych modelach chorobowych.
- Można ją łączyć z innymi testami funkcjonalnymi w celu dalszego badania fizjologii i patologii naczyniowej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Jednoczesna detekcja en face tlenku azotu i anionu ponadtlenkowego w nienaruszonym śródbłonku tętniczym odpowiada na krytyczną potrzebę bezpośredniej, ilościowej oceny stanu oksydacyjnego naczyń w wczesnych badaniach sercowo-naczyniowych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i minimalizacji ryzyka mechanistycznego dla modeli dysfunkcji naczyniowej, wspierając decyzje portfelowe skorygowane o ryzyko w procesie odkrywania leków kardiometabolicznych. Powtarzalność i swoistość tej metody umożliwiają solidne porównania między badaniami oraz ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Bezpośrednie oznaczanie ilości NO i anionorodnika supertlenkowego umożliwia analizę mechanistyczną dysfunkcji śródbłonka oraz rozprzęgania eNOS.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnianie wkładu stresu oksydacyjnego w modelach naczyniowych istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie angażowania celu i walidacji funkcjonalnej w programach kardiologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, ilościowe odczyty biomarkerów oksydacyjnych w nienaruszonych systemach tkankowych.
- Umożliwia standaryzację i powtarzalność testu dla późniejszych etapów procesów przesiewowych związków.
- Zapewnia skalowalną platformę do oceny farmakologicznej modulacji równowagi oksydacyjnej śródbłonka.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając bezpośrednią ocenę stanu utlenienia naczyń w kontekście otyłości i zespołu metabolicznego.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć po przedkliniczną ocenę skuteczności i walidację biomarkerów.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez dostarczanie fizjologicznie istotnych, ilościowych punktów końcowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda detekcji oparta na fluorescencji integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjnym rozwojem biomarkerów w badaniach naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji eNOS oraz szlaków stresu oksydacyjnego w nienaruszonym śródbłonku.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza pomiary oparte na obrazowaniu konfokalnym, pozwalające na wiarygodne porównanie poziomów NO i anionów ponadtlenkowych w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do przedklinicznych modeli chorób układu sercowo-naczyniowego i dysfunkcji metabolicznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę do oceny naczyniowych biomarkerów oksydacyjnych w wielu modelach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wykrywanie biomarkerów oksydacyjnych za pomocą powtarzalnych i skalowalnych protokołów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących chorób układu krążenia i chorób metabolicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkanką naczyniową oraz w mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga dostępu do systemów kąpieli organowych, barwników fluorescencyjnych oraz infrastruktury obrazowania.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych łożysk naczyniowych i modeli chorobowych poprzez optymalizację protokołu.
- Kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników jest zachowanie integralności śródbłonka i minimalizacja ekspozycji na światło.
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
