Name: Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy N-glikanów i białek z osocza przy użyciu LC-MS/MS. To wysokoprzepustowe podejście łączy glikomikę z proteomiką, poprawiając dokładność pomiarów i umożliwiając odkrywanie biomarkerów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało hojnie sfinansowane przez NIH NCI IMAT Program Grant R33 (CA147988-02), NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology at NC State Grant (T32GM008776), US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology at NC State Grant (P200A140020), Fundację W.M. Keck oraz North Carolina State University. Osocze kury uzyskano z pomocą dr Jamesa N. Petitte'a i Rebeki Wysocky z Wydziału Nauk o Drobiarstwie Uniwersytetu Stanowego NC.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Preston, R. J. S., Rawley, O., Gleeson, E. M., O'Donnell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+role+of+carbohydrate+determinants+in+regulating+hemostasis%3A+insights+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elucidating the role of carbohydrate determinants in regulating hemostasis: insights and opportunities.</a> Blood. 121, 3801-3810 (2013).</li>
<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
<li>Zaia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and glycomics.</a> Omics. 14, 401-418 (2010).</li>
<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glycopeptides+for+glycan+structure+and+attachment+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification.</a> Nat. Methods. 6, 809-811 (2009).</li>
<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
<li>Apweiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniProt%3A+the+Universal+Protein+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">UniProt: the Universal Protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 32, 115-119 (2004).</li>
<li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20, 3551-3567 (1999).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
<li>Kronewitter, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+retrosynthetic+glycan+libraries+to+profile+and+classify+the+human+serum+N-linked+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The development of retrosynthetic glycan libraries to profile and classify the human serum N-linked glycome.</a> Proteomics. 9, 2986-2994 (2009).</li>
<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

Współpracujemy z Cambridge Isotope Laboratories (CIL) w celu rozpowszechnienia odczynnika i technologii P2GPN wśród szerszej społeczności naukowej w postaci produktu (GTK-1000). Nie otrzymujemy jednak żadnych przychodów ze sprzedaży tego produktu.

Potrzebne są wysokoprzepustowe metody ilościowe, aby ułatwić rutynową analizę glikanów. Przez ostatnie trzydzieści lat analiza glikomiki była ograniczona do podzbioru grup badawczych, pomimo jej znaczenia w chorobach, zastosowaniach klinicznych i farmaceutykach. Metoda oczyszczania i znakowania FANGS-P2GPN dla glikomiki i proteomiki przeprowadza tę samą analizę na pojedynczej podwielokrotności próbki, zmniejszając koszty dostaw i ilość potrzebnego materiału (szczególnie ważne w badaniach na ludziach i myszach). Co więcej, wysiłki mające na celu zminimalizowanie zmienności w preparatach są niezwykle ważne, ponieważ każdy dodatkowy krok przyczynia się do błędu, potencjalnie maskując ważne, ale mało obfite zmiany w badaniach kliniczno-kontrolnych. Sprzężenie FANGS z hydrofobowym znakowaniem hydrazydowym umożliwia prowadzenie próbek białek i glikanów na tej samej kolumnie RPLC, zwiększa jonizację glikanów, zapewnia względną kwantyfikację i może być ilościowo stosowane do osocza.
Do analizy N-glikanów kluczowe znaczenie ma użycie sugerowanego poziomu PNGazy F, aby osiągnąć pełną deglikozylację. Chociaż glikany są narażone na działanie rozpuszczalników, denaturacja białek i nadmiar enzymu pomagają zapewnić skuteczne i całkowite rozszczepienie. W celu dokładnego określenia ilościowego glikanów konieczne jest upewnienie się, że są one całkowicie wysuszone po derywatyzacji, aby wygasić reakcję i zapobiec reakcjom krzyżowym podczas mieszania gatunków NAT i SIL. Wreszcie, przy rozszerzaniu przepływu pracy o analizę glikozytów, czas etapów ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania nieswoistej deamidacji. Zmodyfikowane protokoły przewidziane dla połączonej analizy glikomicznej i proteomicznej działają spójnie, gdy są odpowiednio wykonywane.
Przepływ pracy pozwala na dokładne względne oznaczanie ilościowe N-glikanów z osocza w porównaniu ze złotym standardem, metodą SPE. Nie ma widocznej stronniczości w rodzajach ekstrahowanych glikanów pod względem masy cząsteczkowej, hydrofilowości i struktury składowej. Chociaż nie zbadaliśmy analizy jakościowej glikanów związanych z O, spodziewamy się, że FANGS może pomieścić dodanie etapu eliminacji β po trawieniu PNGazy F glikanów związanych z N. Jednak procedury wymagałyby znacznych modyfikacji w celu oczyszczenia odczynnika przed spektrometrią mas, a analiza peptydów miałaby znaczący wpływ. W przypadku proteomiki uzyskuje się taką samą głębokość pokrycia proteomu w porównaniu z tradycyjnymi metodami FASP. Co ważne, metody te pozwalają na minimalny odsetek fałszywych wykryć deamidacji N-glikanów. Chociaż metoda jest zgodna z znakowaniem 18O Asn podczas etapu trawienia PNGazy22,23, niski wskaźnik fałszywego wykrywania miejsca glikozylacji sugeruje, że może to nie być konieczne, co jeszcze bardziej zmniejsza koszty i złożoność.
W tej metodzie proteom nie jest wzbogacony o glikoproteiny, co ma zarówno zalety, jak i wady. Niektóre glikoproteiny o niskiej obfitości mogą nie zostać wykryte w analizie. Jednak zajętość miejsc glikozylowanych na białko można porównać między próbkami biologicznymi. Dodatkowo eliminowany jest błąd i stronniczość wynikająca z oczyszczania powinowactwa do lektyn lub wzbogacania chemicznego. Podsumowując, sprzężenie FANGS z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanu skutkuje uproszczoną, ilościową, wysokoprzepustową metodą tandemowej analizy glimu i proteomu o dużym potencjale zastosowania w klinicznych badaniach kliniczno-kontrolnych.

W dziedzinie proteomiki, preparat próbek wspomagany filtrem (FASP) został szeroko przyjęty ze względu na jego zdolność do minimalizacji ilości materiału wyjściowego, zmniejszenia artefaktów przygotowania próbki i maksymalizacji przepustowości próbki1. Jednak taka metoda jeszcze się nie pojawiła i nie zyskała popularności w dziedzinie glikomiksu. Opracowanie wysokoprzepustowych, ilościowych przepływów pracy jest konieczne ze względu na integralną rolę glikozylacji w obronie biologicznej i jej modulacji przez raka lub choroby2,3. U ssaków N-glikany składają się z powtarzających się jednostek sacharydowych (heksozy (Hex), heksozaminy (HexNac), kwasy sjalowe (NeuAc) i fukozy (Fuc)), które zdobią strukturę rdzenia (Hex3HexNac2)4 kowalencyjnie związaną z asparaginą. Chociaż glikoprzestrzeń jest znacznie duża, gdy liczy się izomery (>1012), jest dość mała na podstawie składu, a masy cząsteczkowe zwykle wahają się od 1,000-8,000 Da5. Jednorodność składu klasy i hydrofilowość glikanów stanowią wyjątkowe wyzwanie dla procesów oczyszczania, separacji i spektrometrii mas (MS)6.
Tradycyjnie, N-glikany są trawione z białek lub peptydów przez peptyd-N-glikozydazę F (PNGase F), a następnie wzbogacane przez chromatografię powinowactwa lektyny7, wychwytywane przez kulki hydrazydowe8 lub oczyszczane przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE)9,10. Chociaż wszystkie te metody są bardzo skuteczne, wprowadzają dodatkowe etapy odsalania i ograniczają liczbę próbek przetwarzanych jednocześnie. W ciągu ostatniej dekady zaproponowano szereg wysokoprzepustowych platform dla glikomiksów. Kim i in. opublikowali półautomatyczną metodę wykorzystującą sterowaną próżniowo, SPE 96-dołkową płytkę11. Alternatywnie, grupa Manna opracowała metodę filtra powinowactwa (N-gliko-FASP), która wymagała wstępnej derywatyzacji filtra za pomocą kompozytu lektyn12. Wreszcie, grupa Thomasa-Oatesa zaproponowała metodę półilościową, Filter Aided N-Glycan Separation (FANGS), która wykorzystuje wąski rozmiar składu glikoprzestrzeni13. Opierając się na filtrach odcinających masę cząsteczkową, małe zanieczyszczenia zostały najpierw wypłukane na odpady, a następnie N-glikany zostały strawione i wymyte. Deglikozylowane białka pozostają na filtrze w tym protokole i mogą być poddane FASP in-line.
Identyfikacja i kwantyfikacja glikanów metodą jonizacji elektrorozpylania (ESI) MS wymaga separacji off-line dla (częściowej) rozdzielczości izomerów i derywatyzacji w celu wykrycia gatunków o niskiej liczebności. Znakowanie w indywidualności podczas normalizacji za pomocą strategii znaczników hydrazydu glikanu zapewnia zgodność z chromatografią cieczową z odwróconymi fazami (RPLC)14,15. Znacznik hydrofobowy 4-fenetylobenzohydrazydu (P2PGN) pośredniczy w hydrofilowości glikanów, zwiększając jonizację średnio czterokrotnie16. Chociaż inne techniki, takie jak permetylacja17 lub chemia znakowania reagującego na aminy18, oferują podobne korzyści, w reakcji hydrazydowej glikany reagują stechiometrycznie 1:1 w łatwych warunkach. Względną kwantyfikację uzyskuje się przez analizę tandemową próbek derywatyzowanych za pomocą natywnych (NAT) lub 13znaczników izotopów stabilnych C6 (SIL).
Poniższa metoda rozwija FANGS do zastosowań plazmowych i łączy je ze znacznikiem hydrofobowym P2GPN w celu dokładnej względnej kwantyfikacji. Co więcej, zaprojektowano go do przeprowadzania proteomiki metodą shotgun, profilowania deamidacyjnego i ilościowego glikomika na pojedynczej podwielokrotności próbki, bez naruszania integralności analiz.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy (50%)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>B6916</td><td>Alternatywa: Zestaw kwasu bicunchoninowego (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Alternatywne wirówki, które osiągają 14 000 x g są odpowiednie</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp; M w roztworze</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Alternatywne nano lub ultra wysokociśnieniowe ciekły LC generują podobne dane, takie jak: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Uniewinnienie UPLC (wody).</td></tr><tr><td>Pływający stojak</td> na <td>rurki TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Standardowe piece laboratoryjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Alternatywne inkubatory osiągające 56&nbsp; &deg; C są odpowiednie</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE Kuchenka mikrofalowa</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Każda kuchenka mikrofalowa z regulowanymi ustawieniami mocy jest odpowiednia</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania INLIGHT Glycan&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>Zestaw INLIGHT zawiera wersje NAT i SIL odczynnika P2GPN.</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18 masowa faza stacjonarna</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>Alternatywa dla nośników masowych</td><td>: Dowolna C18 faza stacjonarna 5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon Software i Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternative: Oprogramowanie Proteome Discoverer (Thermo Scientific)</td></tr> <tr><td>Metanol, klasa HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Kolumna do samodzielnego pakowania: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m ID, 15&nbsp; &#956; m końcówka, niepowlekana, 5 w opakowaniu, 50 cm</td><td>Nowy Obiektyw</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (bez glicerolu), 75 000&nbsp; jednostek/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrydowy spektrometr masowy kwadrupolowo-orbitrapowy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Alternatywna wysoka dokładność masy (5&nbsp; ppm) spektrometry mas dostarczą podobnych danych</td></tr><tr><td>RNaza B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniSavant SPD131DDA Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Alternatywne koncentratory próżniowe są odpowiednie Filtry</td></tr><tr><td>Vivacon 500 30 kDa&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>Alternatywa: Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 z Ultracel-10&nbsp; Membrana kDa (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Woda, klasa HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>Dodanie 18O w kroku trawienia PNGazy F jest opcjonalne i może nie być konieczne w przypadku badań deamidacji zakończonych z 95% pewnością</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Zwittergent Merck</td><td>Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

W naukach biologicznych i klinicznych rośnie pragnienie integracji i korelacji wielu klas biomolekuł, aby rozwikłać biologię, zdefiniować ścieżki, poprawić leczenie, zrozumieć choroby i pomóc w odkrywaniu biomarkerów. Glikozylacja sprzężona z azotem jest jedną z najważniejszych i najbardziej niezawodnych modyfikacji potranslacyjnych białek i reguluje krytyczne funkcje komórki, takie jak sygnalizacja, adhezja i funkcja enzymatyczna. Techniki analityczne do oczyszczania i analizy N-glikanów pozostały stosunkowo statyczne w ciągu ostatniej dekady. Chociaż są dokładne i skuteczne, zwykle wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i zasobów. Chociaż opracowano pewne wysokoprzepustowe schematy oczyszczania, nie znalazły one jeszcze powszechnego zastosowania i często opierają się na wzbogacaniu glikopeptydów. Jedna z obiecujących metod, opracowana przez Thomasa-Oatesa i wsp., Filter Aided N-glycan separation (FANGS), została jakościowo zademonstrowana na tkankach. W tym miejscu dostosowaliśmy FANGS do osocza i połączyliśmy je z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanu, aby osiągnąć dokładną względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej spektrometrii mas i wzmocnionej jonizacji elektronrozpylania. Ponadto zaprojektowaliśmy nową funkcjonalność protokołu, uzyskując tandem, proteomikę typu shotgun i analizę miejsca glikozylacji na osoczu kury. Wykazaliśmy, że N-glikany oczyszczone na filtrze i derywatyzowane za pomocą hydrofobowych znaczników hydrazydowych były porównywalne pod względem obfitości i klasy do tych przez ekstrakcję do fazy stałej (SPE); Ten ostatni jest uważany za złoty standard w tej dziedzinie. Co ważne, zmienność w obu protokołach nie różniła się statystycznie. Dane proteomiczne, które zostały zebrane zgodnie z danymi glikomicznymi, miały taką samą głębokość w porównaniu ze standardowym trawieniem trypsyny. Deamidacja peptydów jest zminimalizowana w protokole, ograniczając niespecyficzną deamidację wykrywaną na motywach glikozylacji. Pozwoliło to na bezpośrednią analizę miejsca glikozylacji, chociaż protokół może również uwzględniać znakowanie miejsca 18O. Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowaliśmy nowy, wysokoprzepustowy, bezstronny, oparty na filtrach protokół do ilościowej analizy glikomicznej i proteomicznej.

<img alt="Schemat przetwarzania próbek biologicznych w badaniu przypadku-kontrolnym, przebieg analizy glikomicznej/proteomicznej z trawieniem za pomocą PNGazy F." src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przedstawiono schemat metody FANGS-P2GPN z zastosowaniem znaczników hydrofobowych (Metoda A) do połączonej analizy proteomicznej i glikomicznej. Wyróżniono etapy, które różnią się w przypadku przetwarzania wyłącznie glikomicznego oraz analizy tandemowej glikomicznej i proteomicznej, obejmującej identyfikację miejsc glikozylacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Metoda znakowania hydrofobowego P2GPN oparta na filtracji, stosowana w zintegrowanej proteomice i glikomice (Metoda A), została zwalidowana pod kątem identyfikacji, oznaczania ilościowego oraz błędu związanego z masą cząsteczkową przy użyciu połączonych próbek osocza kurczego (Rysunek 1). W eksperymentach dotyczących wyłącznie glikomiki przeprowadzono porównania zawartości N-glikanów wyekstrahowanych Metodą A z wynikami uzyskanymi za pomocą SPE na węglach (standard złoty, Metoda B) (Rysunek 2). Nie stwierdzono istotnych różnic w zawartości glikanów pomiędzy obiema metodami. Zmienność wewnątrzmetodową oceniono poprzez pomiar stosunku SIL:NAT glikanów wyekstrahowanych tą samą metodą. Rozkłady log2 dla obu metod miały charakter gaussowski, były centryczne wokół zera i nie różniły się istotnie (Rysunek 3A-B). Zakresy mas cząsteczkowych dla obu protokołów całkowicie się pokrywały, co sugeruje, że filtr nie różnicował N-glikanów ze względu na zakres masy cząsteczkowej i hydrofilowość (Rysunek 4).
<img alt="Wykres porównawczy stosunku metody B do A; analiza danych w zakresie wariancji statystycznej z paskami błędów." src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Równomolowa mieszanina NAT i SIL N-glikany wyekstrahowane metodą A lub metodą B zostały przygotowane z 2.5 μl osocza kurzej (N = 4). Próbki analizowano metodą UPLC-MS zgodnie z zalecanymi parametrami opisanymi w sekcji 6. Zawartość każdego glikanu w każdym kanale NAT/SIL obliczono poprzez całkowanie pola pod chromatogramem jonów wyekstrahowanych (MMA = 3 ppm), korygując wynik o nakładanie się mas cząsteczkowych oraz dostosowując go do TGNF. Stosunki te przedstawiono wraz z błędami standardowymi. Zawartość Metody B : Metody A N-glikany nie różniły się istotnie (p &gt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie histogramów rozkładów Log2(SIL:NAT); górny szary, dolny niebieski, przedstawiające liczność względem częstotliwości skumulowanej." src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: zmienność wewnątrzobiektowa w (A) Metoda A (N = 13) lub (B) porównano strategie metody B (N = 123). Równomolowe mieszaniny NAT i SIL z N-glikany, pochodzące z tego samego schematu ekstrakcji, analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. Log2Rozkłady były skoncentrowane wokół zera i nie wykazano istotnych różnic między dwoma schematami pracy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela porównawcza masy cząsteczkowej glikanów; Metoda A vs B; analiza trendu wzrostowego." src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Porównano zakresy masy cząsteczkowej glikanów uzyskanych z każdej ze strategii. Oba schematy pracy pozwoliły na uzyskanie glikanów obejmujących ten sam zakres masy cząsteczkowej. N-glikany wykryte w jednym protokole w porównaniu z drugim znajdowały się tuż powyżej granicy wykrywalności (1 × 105 obfitość) i nie odzwierciedlają systematycznego błędu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Zatrzymanie odglikozylowanych białek przez filtr masy cząsteczkowej umożliwiło analizę całego proteomu w układzie on-line oraz identyfikację miejsc glikozylacji. Porównano wiele protokołów połączonego oczyszczania glikanów i białek z tradycyjnym przygotowaniem metodą FASP bez odglikozylowania (Tabela 5). Nasze typowe 18-godzinne trawienie PNGazą F na filtrze, po którym następowało trawienie trypsyną metodą FASP (protokół Std), prowadziło do znacznego poziomu niespecyficznej deamidacji, co może utrudniać identyfikację miejsc glikozylacji. Dlatego też, w celu zminimalizowania niespecyficznej deamidacji, jako alternatywę zbadano metodę wykorzystującą krótszy czas inkubacji w podwyższonej temperaturze (50 °C) oraz etap dodania PNGazy F (protokół SPI), a także protokół trawienia mikrofalowego (protokół MD). Glikany zaobserwowane w nowych metodach trawienia nie różniły się znacząco pod względem składu ani liczebności od standardowego 18-godzinnego trawienia PNGazą F na filtrze w 37 °C (Rycina 5). W połączeniu z krótką inkubacją z trypsyną, niespecyficzna deamidacja została znacznie ograniczona, a odsetek wyników fałszywie dodatnich dla miejsc glikozylacji wyniósł &lt;5% (Tabela 5).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="4">Białka</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">Peptydy</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">Peptydy deamidowane</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">Glikozyty</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">Glikoproteiny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">+</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FASP</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">249</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">3083</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">795</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">5</td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">18 godz.</td>
			<td colspan="2">217</td>
			<td colspan="2">304</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">6013</td>
			<td colspan="2">5086</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">1029</td>
			<td colspan="2">733</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">257</td>
			<td colspan="2">24</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">112</td>
			<td colspan="2">18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MD</td>
			<td colspan="2">270</td>
			<td colspan="2">266</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">5190</td>
			<td colspan="2">5125</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">465</td>
			<td colspan="2">455</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">254</td>
			<td colspan="2">8</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">102</td>
			<td colspan="2">7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SPI</td>
			<td colspan="2">281</td>
			<td colspan="2">288</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">4729</td>
			<td colspan="2">4482</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">602</td>
			<td colspan="2">573</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">232</td>
			<td colspan="2">10</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145</td>
			<td colspan="2">8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Przeprowadzono porównanie danych proteomicznych uzyskanych po standardowym trawieniu trypsyną oraz z zastosowaniem metody znakowania in-line FANGS-P2GPN. Próbki przygotowano z dodatkiem (+) i bez (-) PNGazy F, aby określić poziom tła niespecyficznej deamidacji oraz oszacować odsetek wyników fałszywie dodatnich dla miejsc glikozylacji. Białka zidentyfikowano przy zastosowaniu 1% wskaźnika fałszywych odkryć (FDR); peptydy odfiltrowano na podstawie „wysokiej” pewności identyfikacji peptydów w programie Proteome Discoverer 1.4 (q &lt;0,01); miejsca glikozylacji zidentyfikowano na podstawie unikalnych sekwencji zawierających deamidację konserwowanego motywu glikozylacji (N-X-S/T); białka glikozylowane zdefiniowano jako zidentyfikowane białka zawierające co najmniej jedno zidentyfikowane miejsce glikozylacji.
<img alt="Histogram porównujący liczbę glikanów w MD w stosunku do SPI, przedstawiający rozkład Log2(stosunku 18Hr/Metoda)." src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Opracowano skrócone protokoły analizy glikanów w celu zminimalizowania deaminacji w próbkach, a następnie porównano je z 18-godzinnym trawieniem PNGazą F metodą FANGS. Średnie różnice w zawartości wynosiły odpowiednio 10% dla protokołu MD (2.2.3) oraz 5% dla protokołu SPI (2.2.2). Spośród 48 zidentyfikowanych glikanów 90% wykazało wariację mniejszą niż 1,5-krotność.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Ogólnym celem tego przepływu pracy opartego na jednym filtrze jest łatwe i ilościowe oczyszczanie N-glikanów oraz białek tandemowo z próbek biologicznych do analizy spektrometrią mas. Skalowalność, szybkość i analityczna powtarzalność tej metody sprawiają, że jest ona bezpośrednio dostępna dla laboratoriów biologicznej spektrometrii mas pod względem zasobów i wymaganych umiejętności. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie badaczom jednoczesnego analizowania kwestii glikomiki, stopnia zajętości miejsc glikozylacji oraz proteomiki w dużych, wysokoprzepustowych badaniach biologicznych.Pokonaliśmy trudności związane z pomiarami N-glikanów, łącząc tę metodę ze strategią pochodniowania dostosowaną do spektrometrii mas, co pozwoliło na dokładną, względną kwantyfikację pomiędzy stanami nowotworowymi a kontrolnymi. Dzięki zmniejszonej zmienności analitycznej możliwe będzie wyjaśnienie nowych interakcji biologicznych między glikomem a proteomem, co dostarczy kluczowych informacji na temat stanów chorobowych i otworzy nowe możliwości odkrywania biomarkerów. Aby rozpocząć, nanieś 2,5 µL osocza na filtr.Następnie do każdej próbki w filtrze należy dodać 2 µL roztworu ditiotreitolu 1M. Próbkę należy rozcieńczyć 200 µL buforu do trawienia PNGazą w wodorowęglanie amonu 100-mM. Probówkę z filtrem należy zamknąć i lekko wymieszać w wibratorze (vortex), uważając, aby nie przesunąć filtra z jego gniazda.Inkubuj próbkę w temperaturze 56°C przez 30 minut, aby zdenaturować białka i glikoproteiny. W celu alkilacji próbek dodaj 50 µL 1M jodoacetamidu, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące około 200 mM. Następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez 60 minut.Skoncentrować zdenaturowaną glikoproteinę na filtrze, odwirowując próbki przy 14 000 x g przez 40 minut, a następnie usunąć przelew. Przemyć próbkę 100 µL buforu do trawienia PNGase. Skoncentrować glikoproteinę na filtrze i usunąć przelew.Powtórz etap płukania i zagęszczania dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić go trzy razy, aż do uzyskania koncentratu w objętości martwej filtra. Po zakończeniu płukania odrzuć cały filtrat oraz probówkę zbiorczą. Następnie, po przeniesieniu filtra do nowej probówki zbiorczej, dodaj do filtra 2 µL wolnej od glicerolu peptydowej N-glikozydazy F lub PNGase F.Dodać 98 µL buforu do trawienia PNGase, tak aby objętość końcowa wyniosła 100 µL, a następnie delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół na filtr w celu wymieszania. W przypadku protokołu z dodatkiem enzymu (spike-in), inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 2 godziny. Szybko wyjąć próbki i dodać dodatkowe 2 µL PNGase F bez glicerolu. Próbki lekko wymieszać w wodotryskach (vortex) przez 1 do 2 sekund.Inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez kolejne 2 godziny. Po elowaniu glikanów poprzez wirowanie próbki w temperaturze 20 °C, dodać 100 µL buforu trawiennego PNGazy do filtra i ponownie wirować. Zebrać płuczynkę zawierającą pozostałe glikany N-społoczone do tej samej probówki, w której znajduje się eluent.Po dwukrotnym powtórzeniu należy wyjąć filtr i umieścić go w nowej probówce zbiorczej w celu przygotowania do analiz proteomicznej. Następnie próbki glikanów należy inkubować w zamrażarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, aż do zamrożenia. Następnie należy je całkowicie wysuszyć w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym przez 4 do 6 godzin.Przepłucz filtr zawierającyydeaminowane peptydy 400 µL buforu z 8M mocznikiem. Zamknij probówkę z cieczą i lekko wymieszaj na wortexie. Skoncentruj peptydy na filtrze przed odrzuceniem całego przesączu.Po dwukrotnym powtórzeniu płukania buforem mocznikiem, przemyj filtr zawierający odaminowane peptydy buforem do trawienia trypsyną. Zakręć probówkę zbiorczą i lekko wymieszaj na wirówce typu vortex przed ponownym zagęszczeniem na filtrze w sposób opisany wcześniej. Odrzuć cały przesącz i powtórz tę czynność jeszcze 2 razy, aby łącznie przeprowadzić 3 płukania buforem do trawienia trypsyną.Wszystkie przyszłe eluenty i roztwory płuczące należy zbierać do nowej probówki zbiorczej. Następnie dodać 50 µL modyfikowanej trypsyny wieprzowej w stosunku trypsyny do białka 1:50 dla proteomiki odkrywczej lub w stosunku 1:5 dla eksperymentów z proteomiki ilościowej. Zakręcić probówkę zbiorczą i lekko wymieszać na wortexie.Po inkubowaniu próbek w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, należy szybko wyjąć próbki i dodać dodatkowe 50 µL trypsyny w odpowiednim stosunku trypsyny do białka. Próbki należy lekko wymieszać na wortexie przez 1 do 2 sekund. Następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez kolejne 2 godziny.Po elucji peptydów poprzez wirowanie przez 20 minut, w taki sam sposób jak poprzednio, wypłucz pozostałe peptydy z filtra buforem Quench. Eluuj je z filtra, wirując przez 15 minut w taki sam sposób jak poprzednio. Po określeniu stężenia peptydów w próbkach, inkubuj próbki peptydów w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu ich zamrożenia.Następnie suszyć do całkowitego odparowania w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym przez 4 do 6 godzin. Przed analizą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas (LCMS) rozpuścić białka tryptyczne w fazie ruchomej A do pożądanego stężenia. Stężenia peptydów tryptycznych z 2,5 µL osocza mieszczą się w zakresie od 100 do 300 ng/µL.Przed analizą glikanów należy zrekonstytuować wysuszone odczynniki 4-fenetylobenzohydrazydy znakowane stabilnymi izotopami, a także natywne odczynniki P2GPN w jednym mililitrze roztworu do derywatyzacji, aby uzyskać końcowe stężenie 0,25 mg/ml. Odczynniki będą rozpuszczać się do 10 minut. Należy intensywnie mieszać na wortexie, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.Oznakuj wysuszone N-glikany za pomocą 200 µL odczynnika P2GPN znakowanego izotopem stabilnym lub natywnego. Pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić wysuszone glikany. Następnie wymieszaj próbki w wirówce typu vortex i odwiruj przez około 5 sekund w wirówce stołowej.Poddać glikany reakcji z odczynnikiem przez 3 godziny w temperaturze 56°C. Bezzwłocznie przenieść glikany z inkubatora do koncentratora próżniowego i suszyć do całkowitego odparowania w temperaturze 55°C przez 3 do 5 godzin. Przed analizą metodą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas resuspender oznakowane N-glikany w 25 do 50 µL wody.Pipetuj próbkę w górę i w dół, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie N-glikanów. Po odwirowaniu próbek w ten sam sposób przez 5 minut, usuń nadsącz, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła dna probówki wirówkowej. Połącz parę próbek natywnych i znakowanych izotopami stabilnymi w stosunku 1:1 w celu przeprowadzenia tandemowej analizy ilościowej względnej.Przygotuj dwie różne metody LCMS dla workflow proteomicznego i glikomicznego. Do analizy białek wstrzyknij na kolumnę około 400 nanogramów białka w NPA. Analizuj próbkę przy przepływie 300 nanolitrów na minutę, z równoważeniem prekolumny 1 mikrolitrem i równoważeniem kolumny analitycznej 5 mikrolitrami.Zjonizuj białka zgodnie z warunkami MS podanymi w protokole tekstowym. W przypadku analizy glikanów wstrzyknij na kolumnę 5 µL resuspendowanych próbek P2GPN o równych ilościach, natywnych oraz znakowanych stabilnymi izotopami. Próbkę analizuj przy przepływie 300 nL/min, przy 2 µL ekwilibracji prekolumny i 5 µL ekwilibracji kolumny analitycznej.Następnie zjonizuj glikany zgodnie z warunkami MS podanymi w protokole tekstowym. Protokół oczyszczania oparty na filtracji porównano ze standardową metodą ekstrakcji w fazie stałej i stwierdzono, że zawartość glikanów osocza wykryta za pomocą obu protokołów nie różniła się znacząco. W obu metodach te same glikany znaleziono w pobliżu granicy wykrywalności, gdzie wzrasta zmienność.Oceniono zmienność międzypróbkową dla mieszanin equiM plazmy oczyszczonej za pomocą protokołu ekstrakcji w fazie stałej opartego na filtrze lub standardowego protokołu ekstrakcji w fazie stałej. Oba protokoły wykazały rozkłady Gaussa, których średnie nie różniły się znacząco od zera. 80 procent glikanów mieściło się w zakresie dwukrotnej zmiany.Rozkłady mas cząsteczkowych glikanów wykrytych w nowym i tradycyjnym protokole oczyszczania nie różniły się znacząco i obejmowały ten sam zakres. Jakościowo nie zaobserwowano stronniczości w odniesieniu do glikanów. Białka osocza przygotowano za pomocą standardowego przygotowania próbek z użyciem filtrów oraz wielu protokołów liniowych.Liczba zidentyfikowanych białek była zbliżona dla poszczególnych protokołów. Nieswoista deamidacja w protokołach trawienia mikrofalowego oraz trawienia z dodatkiem wzorca była kontrolowana na poziomie poniżej 10 procent. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że dokładne określenie stopnia zajętości miejsc glikozylacji zależy od zminimalizowania czasu ekspozycji oraz temperatury.Po opanowaniu metody, oczyszczanie glikanów N-zależnych pecurikene w układzie inline może zostać ukończone w ciągu 2 dni. Postępując zgodnie z tą procedurą, dokładne ilościowe oznaczenie glikanów N-zależnych białek oraz stopień zajętości miejsc glikozylacji mogą zostać zintegrowane i zamodelowane przy użyciu statystycznych technik wyższego rzędu. Metoda ta umożliwia szybką interpretację złożonego języka biologii nowotworów, ilościowe porównanie różnic w terapeutykach białkowych oraz rzeczywiste ujawnienie znaczenia glikozylacji w kontekście biologicznym.

a-quantitative-glycomics-and-proteomics-combined-purification-strategy

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Niniejszy protokół opisuje wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika w kontrolowanych warunkach, co zapewnia solidne i szybkie odzyskiwanie oraz oczyszczanie próbek proteomu przed spektrometrią mas.

Wytrącanie białek na bazie rozpuszczalnika organicznego do solidnej oczyszczania proteomu przed spektrometrią mas

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Poznaj metodę ilościowej analizy N-glikanów i białek z osocza przy użyciu LC-MS/MS. To wysokoprzepustowe podejście łączy glikomikę z proteomiką, poprawiając dokładność pomiarów i umożliwiając odkrywanie biomarkerów chorób.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Przeglądaj więcej filmów