Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ogólnym celem tego przepływu pracy opartego na jednym filtrze jest łatwe i ilościowe oczyszczanie N-glikanów i białek w tandemie z próbek biologicznych z analizy spektrometrii mas. Skalowalność, szybkość i powtarzalność analityczna tej metody sprawiają, że jest ona bezpośrednio dostępna pod względem zasobów i umiejętności dla laboratoriów biologicznej spektrometrii mas. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na jednoczesne badanie glikomiki, zajętości miejsc glikozylacji i kwestii proteomicznych w wielkoskalowych, wysokoprzepustowych badaniach biologicznych.

Pokonaliśmy wyzwania związane z pomiarami N-glikanów, łącząc tę metodę ze strategią derywatyzacji dostosowaną do spektrometrii mas, co skutkuje dokładną, względną kwantyfikacją między stanami nowotworowymi i kontrolnymi. Dzięki zmniejszonej zmienności analitycznej można wyjaśnić nowe interakcje biologiczne między glikunem a proteomem, dostarczając kluczowych informacji na temat stanów chorobowych i nowych możliwości odkrywania biomarkerów. Aby rozpocząć, załaduj 2,5 mikrolitra plazmy na filtr.

Następnie dodaj 2 mikrolitry 1M roztworu ditiotreitolu do każdej próbki w filtrze. Rozcieńczyć próbkę 200 mikrolitrami 100-mM buforu trawiennego PNGazy z wodorowęglanu amonu. Zakryj rurkę z próbką filtra i lekko przekręć wiry, uważając, aby nie zakłócić pracy filtra z jego gniazda.

Inkubować próbkę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu denaturacji białek i glikoprotein. Aby zalkilować próbki, dodaj 50 mikrolitrów 1M jodoacetamidu, aby uzyskać końcowe stężenie około 200 mM. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Zagęścić zdenaturowaną glikoproteinę na filtrze, odwirowując próbki przy 14 000 x g przez 40 minut przed odrzuceniem przepływu. Przemyć próbkę 100 mikrolitrami buforu do trawienia PNGazy. Skoncentruj glikoproteinę na filtrze i wyrzuć przepływ.

Powtórz etap płukania i koncentratu dwa razy, w sumie trzy razy, uzyskując koncentrat w martwej objętości filtra. Po zakończeniu płukania należy wyrzucić cały płyn i fiolkę do pobierania pokarmów. Następnie dodaj 2 mikrolitry peptydu bezglicerolowego N-glikozydazy F lub PNGazy F do filtra po przeniesieniu do świeżej fiolki zbiorczej.

Dodaj 98 mikrolitrów buforu mineralnego PNGazy, zwiększając całkowitą objętość do 100 mikrolitrów, i delikatnie pipetuj w górę iw dół na filtrze, aby wymieszać. W celu uzyskania protokołu skoku trawienia inkubuj próbki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 2 godziny. Pracując szybko, usuń próbki i dodaj dodatkowe 2 mikrolitry PNGazy F, bez glicerolu. Lekko wiruj próbki przez 1 do 2 sekund, aby wymieszać.

Próbki należy inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dodatkowe 2 godziny. Po uniknięciu glikanów poprzez odwirowanie próbki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, dodaj 100 mikrolitrów buforu trawiennego PNGazy do filtra i ponownie odwiruj. Zebrać płuczkę zawierającą pozostały glikan związany z N w tej samej fiolce zbiorczej co eluent.

Po dwukrotnym powtórzeniu wyjąć filtr i umieścić w nowej fiolce do pobierania w celu przygotowania proteomiki. Następnie inkubuj próbki glikanów w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, aż zostaną zamrożone. Następnie suszyć do końca w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym przez 4 do 6 godzin.

Przepłukać filtr zawierający pozbawione energii peptydy 400 mikrolitrami 8M buforu mocznikowego. Zakryć fiolkę zbiorczą i lekko wymieszać, aby wymieszać. Skoncentruj peptydy na filtrze przed wyrzuceniem całego przepływu.

Po dwukrotnym powtórzeniu płukania buforem mocznikowym, przepłukać filtr zawierający peptydy pozbawione energii buforem do trawienia trypsyny. Zakręć fiolkę do pobierania i lekko zmieszaj, aby wymieszać, a następnie ponownie skoncentruj się na filtrze, jak poprzednio. Wylej cały przepływ i powtórz 2 dodatkowe razy, co daje w sumie 3 płukania buforem trawiennym trypsyny.

Zbierz wszystkie przyszłe eluenty i płyny do płukania w nowej fiolce do zbierania. Następnie dodaj 50 mikrolitrów trypsyny modyfikowanej świniami w stosunku 1:50 trypsyny do białka w przypadku odkrycia proteomiki lub stosunku trypsyny do białka 1:5 w ilościowych eksperymentach proteomicznych. Zakryć fiolkę zbiorczą i lekko wymieszać, aby wymieszać.

Po inkubacji próbek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny, pracuj szybko, aby usunąć próbki i dodać dodatkowe 50 mikrolitrów trypsyny w odpowiednim stosunku trypsyny do białka. Lekko wirować próbki przez 1 do 2 sekund, aby wymieszać. Następnie inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dodatkowe 2 godziny.

Po elucji peptydów przez odwirowanie jak poprzednio przez 20 minut, wypłukać pozostałe peptydy z filtra buforem gaszącym. Wypłukać filtr przez odwirowanie jak poprzednio przez 15 minut. Po ilościowym określeniu stężenia peptydów w próbkach, próbki peptydów należy inkubować w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu zamrożenia.

Następnie suszyć do końca w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym przez 4 do 6 godzin. Następnie białka tryptyczne tuż przed chromatografią cieczową, spektrometrią mas lub analizą LCMS w fazie ruchomej A do pożądanego stężenia. Stężenia peptydów tryptycznych od 2,5 mikrolitra osocza wahają się od 100 do 300 nanogramów na mikrolitr.

Przed analizą glikanów należy rozpuścić wysuszone stabilne odczynniki 4-fenylobenzohydrazydowe znakowane izotopem, a także natywne odczynniki P2GPN w jednym mililitrze roztworu dechityzacyjnego do uzyskania końcowego stężenia 0,25 miligrama na mililitr. Pełna rozpuszczalność odczynników zajmie do 10 minut. Intensywnie wiruj, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.

Oznacz wysuszone N-glikany 200 mikrolitrami odczynnika znakowanego stabilnym izotopem lub natywnego odczynnika P2GPN. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić wysuszone glikany. Następnie należy zwirować próbki i wirować przez około 5 sekund w wirówce stołowej.

Reaguj glikany z odczynnikiem przez 3 godziny w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Natychmiast przenieś glikany z inkubatora do koncentratora próżniowego i wysusz do końca w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 3 do 5 godzin. Ponownie zawiesić oznaczony N-glikan w 25 do 50 mikrolitrach wody tuż przed chromatografią cieczową i analizą spektrometrii mas.

Pipetuj w górę i w dół, aby upewnić się, że N-glikany są w pełni rozpuszczone. Po odwirowaniu próbek jak poprzednio przez 5 minut, usunąć supernatant, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła dna probówki wirówkowej. Połącz parę próbek natywnych i znakowanych stabilnymi izotopami w stosunku 1:1 w celu względnej analizy ilościowej w tandemie.

Przygotuj 2 różne metody LCMS dla przepływów pracy związanych z proteomiką i glikomiką. W celu analizy białka wstrzyknąć około 400 nanogramów białka do kolumny w NPA. Uruchom próbkę z prędkością 300 nanolitrów na minutę, z równowagą 1 mikrolitra przed kolumną i równowagą 5 mikrolitrów kolumny analitycznej.

Zjonizuj białka w warunkach MS przewidzianych w protokole tekstowym. W celu analizy glikanów wstrzyknij do kolumny 5 mikrolitrów ponownie zawieszonych próbek P2GPN oznaczonych natywnymi i znakowanymi stabilnymi izotopami equi-M. Uruchom próbkę z prędkością 300 nanolitrów na minutę z równowagą 2 mikrolitrów przed kolumną i 5 mikrolitrami równowagi kolumny analitycznej.

Następnie zjonizuj glikany w warunkach MS przewidzianych w protokole tekstowym. Protokół oczyszczania oparty na filtrze porównano ze standardową metodą ekstrakcji do fazy stałej, a obfitość glikanów w osoczu wykrytych między tymi 2 protokołami nie różniła się znacząco. W obu metodach te same glikany znajdowały się w pobliżu granicy wykrywalności, gdzie zmienność wzrasta.

Oceniono współzmienność dla równowagowych mieszanek osocza oczyszczonego za pomocą protokołu ekstrakcji opartej na filtrze lub standardowej fazy stałej. Oba protokoły miały rozkłady Gaussa, których średnie nie różniły się znacząco od zera. 80 procent glikanów znalazło się w obrębie podwójnej zmiany.

Rozkłady masy cząsteczkowej glikanów wykrytych w nowym i tradycyjnym protokole oczyszczania nie różniły się znacząco i obejmowały ten sam zakres. Jakościowo nie zaobserwowano błędu systematycznego między glikanami. Białka osocza przygotowano za pomocą standardowego przygotowania próbki wspomaganego filtrem i wielu protokołów in-line.

Liczba zidentyfikowanych białek była podobna dla różnych protokołów. Nieswoista deamidacja była kontrolowana w protokołach trawienia mikrofalowego i kolców niestrawności do mniej niż 10 procent. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dokładne zajęcie miejsca glikozylacji zależy od zminimalizowania ekspozycji na ciepło i czas.

Po opanowaniu, oczyszczanie N-glikanu pekurikene w linii produkcyjnej można zakończyć w ciągu 2 dni. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zintegrować i modelować dokładną kwantyfikację N-glikanów białkowych i zajęcie miejsca glikozylacji przy użyciu technik statystycznych wyższego rzędu. Technika ta umożliwia szybkie odczytanie złożonego języka, którym posługuje się biologia nowotworów, ilościowe porównanie różnic w terapiach białkowych i prawdziwe ujawnienie znaczenia glikozylacji w kontekście biologicznym.