Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł
February 16th, 2016
Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.
Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie komórek odpornościowych dziąseł w celu dogłębnej charakterystyki odpowiedzi immunologicznych związanych z odpornością jamy ustnej i zapaleniem przyzębia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności jamy ustnej, takie jak to, jakie czynniki komórkowe są zaangażowane w patogenezę zapalenia przyzębia. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona ocenę sieci komórek odpornościowych jamy ustnej i izolację wystarczającej liczby żywotnych komórek do dalszych badań in vitro.
Pierwszym krokiem tego protokołu jest rozpoczęcie od umieszczenia szpilek w celu unieruchomienia ciała myszy i otwarcia jamy piersiowej i brzusznej, aby odsłonić serce i narządy wewnętrzne. Następnie wykonaj nacięcie w żyle głównej i użyj 3-mililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wylać 3 mililitry PBS przez lewą komorę. Kiedy cała krew zostanie spłukana, przypnij głowę myszy do podkładki preparcyjnej, z brzuchem skierowanym do góry.
Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć każde spoidło wargi w kierunku szyi, oddzielając skórę pokrywającą żuchwę i okolicę szyi oraz odsłaniając leżące poniżej tkanki i mięśnie. Przeciąć między dolnymi siekaczami, aby oddzielić obie strony żuchwy. Unieruchom każdą stronę oddzielonej żuchwy za pomocą igieł o rozmiarze 25, aby uzyskać dostęp do jamy ustnej.
Po zidentyfikowaniu podniebienia użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby wykonać pionowe nacięcia tuż przed pierwszym zębem trzonowym i z tyłu trzeciego zęba trzonowego. Następnie wypreparuj tkankę z dala od jamy nosowej, a także wypreparuj bloki z żuchwy. Następnie wyeliminuj nadmiar tkanki z granicy dziąsła i przenieś bloki szczęki i żuchwy do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 5 mililitrów kolagenazy i DNazy na lodzie.
Trawić tkankę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, dodając 50 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA w ciągu ostatnich pięciu minut. Następnie dodaj 5 mililitrów zimnej pożywki DNazy do tkanek i delikatnie wymieszaj zawartość probówki, mieszając. Następnie przenieś cztery bloki tkanki na szalkę Petriego.
I przykryj je 500 mikrolitrami świeżej pożywki DNazy. Użyj skalpela, aby usunąć dziąsło z każdego bloku tkanki. I przenieś całą zawartość naczynia do sitka o komórkach 70 mikronów na 50-mililitrowej probówce.
Umyj szalkę Petriego i sitko 3 do 5 mililitrami świeżej pożywki DNazy. A następnie użyj tłoka sterylnej, 3-mililitrowej strzykawki, aby zetrzeć tkankę dziąsła z siatką sitka. Przepłukać sitko 30 do 35 mililitrami zimnej pożywki DNazy i odwirować filtrat.
Następnie ponownie zawieś podniebienie w 1 mililitrze kompletnej pożywki i określ liczbę żywotnych komórek. Izolacja i przetwarzanie komórek odpornościowych, jak właśnie wykazano, daje wystarczającą liczbę komórek, aby przeprowadzić stymulację ex-vivo i scharakteryzować wzorce wydzielania cytokin w komórkach dziąseł zarówno u zwierząt typu dzikiego, jak i podatnych na zapalenie przyzębia. Rzeczywiście, skład mysich komórek odpornościowych dziąseł można analizować, jak wykazano na tych wykresach gęstości oceniających przedziały komórek t i komórek NK u myszy z nokautem LFA podatnych na zapalenie przyzębia.
Stosując odpowiednie strategie bramkowania, można również określić wewnątrzkomórkową produkcję cytokin TCR beta CD4 dodatnich, TCR beta CD8 dodatnich i TCR gamma delta dodatnich, a także NK i wrodzonych komórek limfoidalnych. Po opanowaniu komórki można wyizolować w ciągu trzech godzin w celu barwienia immunologicznego, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby wykonać wszystkie kroki sprawnie i szybko, utrzymując komórki na lodzie, gdy nie są manipulowane.
Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sortowanie komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z funkcją określonych podzbiorów komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia technikę izolowywania i charakteryzacji komórek odpornościowych z dziąseł mysich. Metoda ma na celu zwiększenie zrozumienia odporności jamy ustnej i zapalenia przyzębia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia jamy ustnej
- Parodontologia
Tło
- Zrozumienie reakcji odpornościowych w jamie ustnej jest kluczowe dla radzenia sobie z chorobami przyzębia.
- Komórki odpornościowe dziąseł odgrywają istotną rolę w odporności jamy ustnej.
- Obecne metody mogą nie zapewniać wystarczającej liczby żywych komórek do szczegółowej analizy.
- Ta technika ma na celu wypełnienie tej luki, umożliwiając głębokie badania funkcjonalne.
Cel badania
- Izolować komórki odpornościowe dziąseł w celu charakteryzacji.
- Zbadać czynniki komórkowe zaangażowane w patogenezę zapalenia przyzębia.
- Ocenić sieć komórek odpornościowych jamy ustnej.
Stosowane metody
- Unieruchomienie myszy i ekspozycja narządów wewnętrznych.
- Narcięcie żyły głównej w celu spłukania krwi.
- Użycie strzykawki do obfitego wlewu PBS przez lewej komory serca.
- Przygotowanie myszy do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Udane izolowywanie żywych komórek odpornościowych dziąseł.
- Charakteryzacja reakcji odpornościowych związanych ze zdrowiem jamy ustnej.
- Wgląd w patogenezę zapalenia przyzębia.
- Możliwość dalszych badań in vitro.
Wnioski
- Ta technika dostarcza cennego narzędzia do badania odporności jamy ustnej.
- Poprawia zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych w tkankach dziąseł.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do głębszego zrozumienia chorób przyzębia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise isolation and functional profiling of gingival immune cells enables mechanistic de-risking in oral immunology and supports target validation for inflammatory disease research. This workflow provides high-viability cell populations for quantitative phenotyping and ex vivo functional assays, strengthening predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions in immunology and oral health R&D by enabling robust interrogation of tissue-resident immune networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell subsets implicated in oral inflammatory pathogenesis.
- Supports functional target validation through ex vivo cytokine secretion assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune cell contributions to disease models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers viable, phenotypically characterized immune cells for downstream assay development.
- Supports reproducible preparation of biological samples for standardized screening workflows.
- Enables quantitative readouts of immune function for compound evaluation.
- Improves scalability and assay readiness for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant oral models for translational continuity.
- Enables functional biomarker discovery in preclinical oral immunopathology studies.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting oral tissues.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality immune cell preparations for both mechanistic studies and functional screening in oral disease models.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on immune cell roles in oral tissue homeostasis and pathology.
- Screening: Supplies reproducible, viable cell populations for assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine secretion and immune cell phenotypes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant oral models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse oral immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oral immune research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune cell isolation for cross-study comparability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of oral immunology assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and approaches in oral and mucosal immunology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and immune cell handling.
- Demands access to flow cytometry and ex vivo functional assay infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible cell isolation and analysis.
- Adaptation to other mucosal tissues may require protocol optimization.
- Cell viability and yield are sensitive to procedural timing and temperature control.
