Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł
16 lutego 2016
Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.
Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie komórek odpornościowych dziąseł w celu dogłębnej charakterystyki odpowiedzi immunologicznych związanych z odpornością jamy ustnej i zapaleniem przyzębia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odporności jamy ustnej, takie jak to, jakie czynniki komórkowe są zaangażowane w patogenezę zapalenia przyzębia. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona ocenę sieci komórek odpornościowych jamy ustnej i izolację wystarczającej liczby żywotnych komórek do dalszych badań in vitro.
Pierwszym krokiem tego protokołu jest rozpoczęcie od umieszczenia szpilek w celu unieruchomienia ciała myszy i otwarcia jamy piersiowej i brzusznej, aby odsłonić serce i narządy wewnętrzne. Następnie wykonaj nacięcie w żyle głównej i użyj 3-mililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wylać 3 mililitry PBS przez lewą komorę. Kiedy cała krew zostanie spłukana, przypnij głowę myszy do podkładki preparcyjnej, z brzuchem skierowanym do góry.
Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć każde spoidło wargi w kierunku szyi, oddzielając skórę pokrywającą żuchwę i okolicę szyi oraz odsłaniając leżące poniżej tkanki i mięśnie. Przeciąć między dolnymi siekaczami, aby oddzielić obie strony żuchwy. Unieruchom każdą stronę oddzielonej żuchwy za pomocą igieł o rozmiarze 25, aby uzyskać dostęp do jamy ustnej.
Po zidentyfikowaniu podniebienia użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby wykonać pionowe nacięcia tuż przed pierwszym zębem trzonowym i z tyłu trzeciego zęba trzonowego. Następnie wypreparuj tkankę z dala od jamy nosowej, a także wypreparuj bloki z żuchwy. Następnie wyeliminuj nadmiar tkanki z granicy dziąsła i przenieś bloki szczęki i żuchwy do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 5 mililitrów kolagenazy i DNazy na lodzie.
Trawić tkankę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, dodając 50 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA w ciągu ostatnich pięciu minut. Następnie dodaj 5 mililitrów zimnej pożywki DNazy do tkanek i delikatnie wymieszaj zawartość probówki, mieszając. Następnie przenieś cztery bloki tkanki na szalkę Petriego.
I przykryj je 500 mikrolitrami świeżej pożywki DNazy. Użyj skalpela, aby usunąć dziąsło z każdego bloku tkanki. I przenieś całą zawartość naczynia do sitka o komórkach 70 mikronów na 50-mililitrowej probówce.
Umyj szalkę Petriego i sitko 3 do 5 mililitrami świeżej pożywki DNazy. A następnie użyj tłoka sterylnej, 3-mililitrowej strzykawki, aby zetrzeć tkankę dziąsła z siatką sitka. Przepłukać sitko 30 do 35 mililitrami zimnej pożywki DNazy i odwirować filtrat.
Następnie ponownie zawieś podniebienie w 1 mililitrze kompletnej pożywki i określ liczbę żywotnych komórek. Izolacja i przetwarzanie komórek odpornościowych, jak właśnie wykazano, daje wystarczającą liczbę komórek, aby przeprowadzić stymulację ex-vivo i scharakteryzować wzorce wydzielania cytokin w komórkach dziąseł zarówno u zwierząt typu dzikiego, jak i podatnych na zapalenie przyzębia. Rzeczywiście, skład mysich komórek odpornościowych dziąseł można analizować, jak wykazano na tych wykresach gęstości oceniających przedziały komórek t i komórek NK u myszy z nokautem LFA podatnych na zapalenie przyzębia.
Stosując odpowiednie strategie bramkowania, można również określić wewnątrzkomórkową produkcję cytokin TCR beta CD4 dodatnich, TCR beta CD8 dodatnich i TCR gamma delta dodatnich, a także NK i wrodzonych komórek limfoidalnych. Po opanowaniu komórki można wyizolować w ciągu trzech godzin w celu barwienia immunologicznego, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby wykonać wszystkie kroki sprawnie i szybko, utrzymując komórki na lodzie, gdy nie są manipulowane.
Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sortowanie komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z funkcją określonych podzbiorów komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono technikę izolacji i charakterystyki komórek odpornościowych z dziąseł myszy. Metoda ta ma na celu pogłębienie wiedzy na temat odporności jamy ustnej oraz zapalenia przyzębia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia jamy ustnej
- Periodontologia
Wstęp
- Zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w jamie ustnej jest kluczowe dla leczenia chorób periodontalnych.
- Komórki odpornościowe dziąseł odgrywają istotną rolę w odporności jamy ustnej.
- Obecne metody mogą nie zapewniać wystarczającej liczby żywych komórek do szczegółowej analizy.
- Niniejsza technika ma na celu wypełnienie tej luki, umożliwiając przeprowadzenie pogłębionych badań funkcjonalnych.
Cel badania
- Wyizolowanie komórek odpornościowych dziąseł w celu ich charakterystyki.
- Zbadanie czynników komórkowych zaangażowanych w patogenezę zapalenia przyzębia.
- Ocena sieci komórek odpornościowych jamy ustnej.
Zastosowane metody
- Unieruchomienie myszy i odsłonięcie organów wewnętrznych.
- Nacięcie żyły głównej w celu wypłukania krwi.
- Użycie strzykawki do perfuzji PBS przez lewą komorę.
- Przygotowanie myszy do dalszych analiz.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja żywych komórek odpornościowych dziąseł.
- Charakterystyka odpowiedzi immunologicznych związanych ze zdrowiem jamy ustnej.
- Wgląd w patogenezę zapalenia przyzębia.
- Potencjał do dalszych badań in-vitro.
Wnioski
- Technika ta stanowi cenne narzędzie do badania odporności jamy ustnej.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych w tkankach dziąseł.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do pogłębienia wiedzy na temat chorób przyzębia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna izolacja i profilowanie funkcjonalne komórek odpornościowych dziąseł umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w immunologii jamy ustnej oraz wspiera walidację celów w badaniach nad chorobami zapalnymi. Niniejszy schemat postępowania pozwala na uzyskanie populacji komórek o wysokiej żywotności do ilościowego fenotypowania i funkcjonalnych testów ex vivo, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych badaniach odkrywczych i translacyjnych. Podejście to ma na celu wsparcie decyzji dotyczących portfolio w obszarze B+R w immunologii i zdrowiu jamy ustnej poprzez umożliwienie rzetelnej analizy tkankowych sieci odpornościowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę subpopulacji komórek odpornościowych zaangażowanych w patogenezę stanów zapalnych jamy ustnej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez testy wydzielania cytokin ex vivo.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w modelach chorobowych.
- Dostarcza danych ilościowych niezbędnych do selekcji projektów w portfolio w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Dostarcza żywe, scharakteryzowane fenotypowo komórki odpornościowe do dalszego opracowywania testów.
- Wspiera powtarzalne przygotowanie próbek biologicznych dla zstandaryzowanych procesów screeningu.
- Umożliwia ilościowe odczyty funkcji odpornościowej w celu oceny związków.
- Poprawia skalowalność i gotowość testów dla platform screeningu wysokiej treści (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica profilowanie komórek odpornościowych z modelami jamy ustnej istotnymi dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia odkrywanie funkcjonalnych biomarkerów w przedklinicznych badaniach nad immunopatologią jamy ustnej.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie strategii immunomodulacyjnych celujących w tkanki jamy ustnej.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy w celu wsparcia wyboru kandydatów przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, dostarczając wysokiej jakości preparatów komórek odpornościowych do badań mechanistycznych oraz przesiewowych badań funkcjonalnych w modelach chorób jamy ustnej.
- Biologia odkrywcza: Udoskonala testowanie hipotez dotyczących roli komórek odpornościowych w homeostazie i patologii tkanek jamy ustnej.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, żywe populacje komórek do opracowywania testów i badania związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wydzielania cytokin i fenotypów komórek odpornościowych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w modelach jamy ustnej istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do różnych programów badawczych w zakresie immunologii jamy ustnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odpornością jamy ustnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną i skalowalną izolację komórek odpornościowych w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie zasobów w dziedzinie immunologii jamy ustnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i podejść w ramach potoków badawczych immunologii jamy ustnej i błon śluzowych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu sekcji myszy oraz obchodzenia się z komórkami układu odpornościowego.
- Wymagany jest dostęp do cytometrii przepływowej oraz infrastruktury do analiz funkcjonalnych ex vivo.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności izolacji i analizy komórek.
- Adaptacja do innych tkanek śluzowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Żywotność i wydajność komórek są wrażliwe na czas trwania procedur oraz kontrolę temperatury.
