Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie wyzwalaczy interferencji RNA u Anopheles gambiae w celu zainicjowania wyciszenia genów, które rozpoczyna się w stadium poczwarki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii wektorów i odkryciu genów odgrywających rolę podczas przeddorosłych lub wczesnych dorosłych etapów rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie badaczom możliwości przeprowadzenia szybkich studiów genomicznych funkcjonalnych, rozpoczynając wyciszanie genów w przedziale rozwojkowym, jakim jest stadium poczwarki, w którym w przeszłości nie wdrożono protokołów wstrzykiwania interferencji RNA.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy iniekcji mogą być trudne do opanowania ze względu na wymaganą precyzję oraz delikatną naturę poczek w tym stadium rozwojowym. Po wyborze interesującego genu należy zidentyfikować region o długości od 200 do 800 par zasad, w którym nie przewiduje się efektów poza celowych, a następnie przeprowadzić standardową amplifikację PCR w celu otrzymania matrycy do syntezy dwuniciowego RNA, flankowanej sekwencją promotora T7. Następnie należy zsyntezować dwuniciowe RNA i oczyścić produkty za pomocą komercyjnego zestawu do transkrypcji in vitro.

Dostosuj końcowe stężenie RNA do 3 µg/µL. Następnie, używając standardowego żelu agarozowego 2%, porównaj 0,5 µL dwuniciowego RNA z matrycowym DNA oraz markerami standardowymi. Po przeprowadzeniu elektroforezy sprawdź jakość i długość prążka dwuniciowego RNA.

Nie powinny być widoczne żadne niespecyficzne produkty. Dwuniciowy RNA będzie migrował wolniej niż DNA matrycowe. Do przechowywania należy przygotować alikwoty dwuniciowego RNA i przechowywać je w temperaturze -20 °C.

Zacznij od przygotowania barwnika Fast Green FCF. Najpierw rozcieńcz barwnik do stężenia 0,1% obj. w wodzie wolnej od RNaz. Następnie przenieś objętości jednego mikrolitra przygotowanego roztworu do probówek do wirówek o pojemności 1,5 mililitra.

Podgrzewaj wypełnione probówki w temperaturze 65°C przez około trzy godziny, aby odparować wodę. Następnie chłodź probówki przez co najmniej 30 minut przed użyciem stałych barwników. Następnie przygotuj szklane igły do iniekcji z rurek borokrzemianowych.

Ustaw wyciągacz igieł na średnicę końcówki od 10 do 30 mikronów. W przypadku wyciągacza kapilar NARISHIGE ustaw pierwszy grzałkę na 100, a drugą na 70. Następnie zamocuj igłę kapilarną w zaciskach i przystąp do wyciągania.

Teraz należy przygotować stanowisko do iniekcji. Wybierz platformę, którą można łatwo manewrować pod mikroskopem. Na platformie przyklej najpierw taśmą gruby papier filtracyjny.

Następnie na gruby papier filtracyjny przyklej taśmą jeden cienki papier filtracyjny. Dalej, do probówek z ciałem barwnika dodaj 10 µL każdego dwuniciowego RNA przeznaczonego do wstrzyknięcia i ponownie zawieś barwnik. Przechowuj te probówki w lodzie.

Następnie należy zebrać poczwarki do wstrzyknięcia. Napełnij 60 mm szalkę Petriego 10 ml wody zdejonizowanej i przenieś do niej około 50 blado ubarwionych poczwarek za pomocą plastikowej pipety transferowej. Używaj wyłącznie słabo pigmentowanych poczwarek, ponieważ osobniki, które osiągnęły już średni lub ciemny stopień garbowania, ulegną uszkodzeniu kutykuli i wykażą niską przeżywalność.

Pierwszym krokiem mikroiniekcji jest otwarcie igły. Pod mikroskopem odłam bardzo dystalny czubek igły, używając precyzyjnej pęsety. Następnie wypełnij igłę od tyłu olejem mineralnym, używając strzykawki z igłą o rozmiarze 30 G.

Po napełnieniu usunąć nadmiar oleju za pomocą mikroinjektora. Ustawić mikroinjektor na pobieranie objętości 69 nanoliter. Następnie napełnić igłę od przodu przygotowanym RNA do iniekcji.

Przeprowadź test dozowania dwuniciowego RNA w celu wykrycia ewentualnych problemów. Głównymi źródłami problemów są zatory w końcówce oraz niewłaściwie zamocowane igły. Po przygotowaniu injektora wybierz od jednej do trzech poczek i przenieś je na etap z papierem filtracyjnym.

Używając pędzla, ustaw poczwarkę tak, aby kutykula grzbietowa była dostępna. Poprzez docisk do papieru nadmiar wody na poczwarkach zostanie wchłonięty. Trzymając poczwarkę nieruchomo za pomocą mokrego pędzla, wykonaj ruch od przedniej do tylnej części ciała, aby wprowadzić igłę w kutykulę grzbietową pomiędzy odwłokiem a klatką piersiową, pod kątem około 30 stopni.

Następnie wstrzyknij jeden lub dwa impulsy dwuniciowego RNA do hemolimfy. Jeśli wstrzykiwanie przebiegło pomyślnie, widoczne powinno być rozprzestrzenianie się barwnika w całym ciele. Podczas wstrzykiwania do poczwarki kluczowe jest, aby igła przebiła wyłącznie kutykulę grzbietową.

Jeśli nakłucie igłą przejdzie przez brzuszną część kutykuli, na zewnętrznej stronie poczwarki pojawi się widoczny wyciek cieczy z barwnikiem lub barwnik przeniknie na papier filtracyjny. W takich przypadkach poczwarka musi zostać odrzucona. Jeśli barwnik nie rozprowadzi się w całej hemolimfie, prawdopodobnie doszło do zapchania końcówki.

Przesuń lekko końcówkę i sprawdź, czy doszło do uwolnienia RNA oraz barwnika. Jeśli nie ma oznak uwolnienia barwnika, usuń poczwarkę. Następnie oceń końcówkę igły i wykonaj kolejną iniekcję w nowej poczwarce.

Po pomyślnym wstrzyknięciu substancji do poczwarki, należy użyć zwilżonego pędzla, aby delikatnie odseparować ją od igły i przenieść do naczynia z wodą, w którym poczwarka dokończy rozwój. Naczynie z wstrzykniętymi poczwarkami należy umieścić w klatce dla komarów lub pojemniku w standardowych warunkach hodowlanych. Jako źródło pożywienia dla dorosłych osobników należy zapewnić roztwór glukozy o stężeniu 10% masy w objętości, nasączony w kulce waty.

Po wyjściu osobników dorosłych należy porównać je z grupą kontrolną. Na przykład owadów z podwójnie znokautowanym genem SRPN2 należy codziennie badać pod kątem tworzenia pseudoguzów. Aby to zrobić, należy schłodzić osobniki dorosłe przez dwie do trzech minut w temperaturze -20 °C, a następnie przenieść je na płytkę chłodzącą o temperaturze 2 °C w celu obserwacji.

Po obejrzeniu osobników dorosłych, należy przenieść je z powrotem do obszaru hodowli w insekarium. Po opanowaniu techniki, poczki z wstrzykniętym preparatem wykluwały się z częstotliwością około 70%. W podgrupie wstrzykniętych poczek wystąpiło częściowe wyjście z poczki, co prowadziło do powstania niewykonalnych życiowo komarów. Nie odnotowano opóźnień w tempie wykluwania się między komarami wstrzykniętymi a niewstrzykniętymi, a wpływ wstrzyknięcia nie różnił się w zależności od płci.

Dziesięć dni po wyjściu z poczwarki nie stwierdzono istotnych zmian w przeżywalności zainfekowanych komarów w porównaniu z nieiniekcyjnymi grupami kontrolnymi. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano inhibitor serynowej proteazy, SRPN2, natomiast jako kontrolę negatywną dla iniekcji dwuniciowego RNA zastosowano dwuniciowe LacZ. Trzy dni po wyjściu z poczwarki w dorosłych osobnikach po iniekcji dwuniciowego SRPN2 zaobserwowano pseudoguzy za pomocą mikroskopii świetlnej.

Po ośmiu dniach pseudoguzy były bardzo wyraźne. U komarów w stadium dorosłym melanotyczne pseudoguzy były widoczne przez kutykulę u większości zwierząt wstrzykniętych dwuniciowym SRPN2, podczas gdy w grupach kontrolnych nie zaobserwowano żadnych pseudoguzów. Pięć dni po wstrzyknięciu poziomy białka SRPN2 były znacznie niższe u komarów wstrzykniętych dwuniciowym SRPN2 w porównaniu do kontroli wstrzykniętych dwuniciowym LacZ oraz kontroli niewstrzykniętych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić dostarczenie wyzwalacza interferencji RNA do poczwarek Anopheles gambiae, korzystając z tego nowo opracowanego protokołu wstrzykiwania. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na nieprzewidywalne ruchy poczwarki. Jednakże ćwiczenie prawidłowego pozycjonowania i stabilizacji poczwarki znacznie zwiększa odsetek udanych wstrzyknięć, a także poprawia ich jakość.

Po opanowaniu techniki, wstrzyknięcia te wymagają około 30 sekund na jedną poczwarkę. Dzięki opracowaniu tej metody utorowaliśmy drogę badaczom z dziedziny biologii wektorów do badania i oceny funkcji genów podczas stadiów rozwojowych przedimago oraz wczesnego imago u wektora malarii Anopheles gambiae. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza Western blot lub ilościowe PCR, aby określić zakres wyciszenia genu docelowego odpowiednio na poziomie ekspresji białka lub transkryptu.

Ostatecznie technika ta może pomóc w identyfikacji genów kluczowych dla przenoszenia pasożytów przez komary, a takie podejście pozwoli nam zidentyfikować nowe cele i dostarczy nowej wiedzy na temat tego, jak możemy tworzyć skuteczniejsze strategie kontroli wektorów.