Name: Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia lokalizację aktywowanych białek w strukturach rzęskowych oraz badanie kinetyki sygnałowania wapniowo-zależnego w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Nauki IOS-0817658.

Procedury dotyczące danio pręgowanego w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Virginia Commonwealth University.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>4% PFA/PBS. Odważyć 8 g paraformaldehydu (PFA) w dygestorium. Pozostając jeszcze w dygestorium, rozpuścić suchy PFA w ~80 ml destylowanegoH2O, mieszając i podgrzewając do 50 °C. Mieszając, dodać 3 - 10 kropli świeżego 1N NaOH, aż PFA całkowicie się rozpuści i roztwór się sklaruje. Zdjąć z ognia i dodać 100 ml 2x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS). Doprowadzić objętość do 200 ml za pomocą destylowanegoH2O. Przed użyciem schłodzić do temperatury RT i potwierdzić pH 7,4. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, ale zużyć w ciągu tygodnia.</li>
	<li>Używaj 100% metanolu bez żadnych suplementów. Używaj 95% etanolu bez żadnych suplementów.</li>
	<li>Przygotuj animację buforowaną fosforanami (PBT). Uzupełnij sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 0,1% Tween-20. Dodać 0,5 ml 20% roztworu podstawowego Tween-20 do 100 ml 1x PBS. Sklep w RT.</li>
	<li>Przygotować buforowany fosforanami Triton-X (PBTx). Uzupełnij PBS o 0,1% Triton X-100. Dodać 0,5 ml bulionu 20% Triton X-100 do 100 ml PBS. Sklep w RT.</li>
	<li>Przygotuj 10% NGS/PBTx. Normalna surowica kozia (NGS) blokuje niespecyficzne miejsca wiązania. Przechowywać NGS w porcjach w temperaturze -20 °C. Aby użyć, dodaj 1 ml do 9 ml PBTx.</li>
	<li>Przygotować 50% glicerolu/PBS. Wymieszaj dokładnie równe części 2x PBS i 100% glicerolu. Sklep w RT.</li>
</ol>
2. Utrwalenie zarodka
<ol>
	<li>hodowla.Uzyskanie zarodków typu dzikiego (AB i WIK) lub transgenicznego (np. β-aktyna:CAAX-GFP) poprzez naturalne krzyżowanie. W razie potrzeby wstrzyknąć zarodki z konstruktami lub morfolinami, zgodnie z opisem. 15,16</li>
	<li>Hoduj zarodki.Pobrać zarodki i inkubować w temperaturze 28,5 °C w obecności 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w celu zablokowania pigmentacji zgodnie z opisem. 17</li>
	<li>naprawiać.Gdy zarodki osiągną pożądany etap rozwoju,18 należy znieczulić zarodki za pomocą MESAB, usunąć jak najwięcej wody systemowej i dodać świeże 4% PFA/PBS przez 3 - 4 godziny w temperaturze pokojowej. UWAGA: Czasami mniej niż 20 godzin po zapłodnieniu (hpf), należy utrwalić przed dechorionacją. Czasami po 20 hpf dechorionate przed utrwaleniem za pomocą dwóch par cienkich kleszczy punktowych pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Zmieniające się rozwiązania.Przenieść zarodki za pomocą pipety o szerokim otworze, zgodnie z opisem. 17 Zmień roztwory w probówkach do mikrowirówek z nakrętką o pojemności 1,5 ml, po prostu pozwalając zarodkom osiąść grawitacyjnie bez wirowania.</li>
	<li>Po utrwaleniu.Po 3 - 4 godzinach usuń PFA/PBS, zastąp 100% metanolem i przechowuj w temperaturze -20 °C przez co najmniej 48 godzin. UWAGA: Aby uzyskać maksymalną immunoreaktywność P-CaMK-II, ogranicz całkowity czas przechowywania metanolu do jednego tygodnia.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne całych zarodków
<ol>
	<li>Umieścić co najmniej 10 zarodków dla każdego warunku doświadczalnego w zakręconej 1,5 ml probówce do mikrowirówki i oznaczyć je.</li>
	<li>Pozwól zarodkom się uspokoić. Usuń i wyrzuć metanol i ponownie nawodnij za pomocą płynów do płukania progresywnego zawierających 0,5 ml alkoholu etylowego o malejących stężeniach, jak wskazano w następnym kroku. Każdy krok to 5 minutowe mycie z bujaniem.</li>
	<li>Stopniowo nawadniaj za pomocą tych 5 roztworów: 66% etanol/33% PBTx, 33% etanol/66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (jest to pierwsze powtórzenie PBTx), 100% PBTx (jest to drugie powtórzenie PBTx).</li>
	<li>Usuń ostatnie pranie PBTx. Dodać 0,5 ml 10% NGS/PBTx. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem, a następnie wyjąć i wyrzucić roztwór.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając go w 10% NGS/PBTx. W przypadku barwienia koimmunologicznego należy najpierw użyć przeciwciała o wyższym powinowactwie. W tym badaniu należy inkubować z mysim przeciwciałem monoklonalnym antyacetylowanej tubuliny rozcieńczonym w stosunku 1:500. Na przykład, jeśli jest 10 próbek, połącz 6 μl podstawowego roztworu przeciwciała z 3 ml 10% NGS/PBTx, a następnie rozprowadź 0,3 ml tego roztworu do każdej probówki.</li>
	<li>Dodać 0,2 - 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej probówki, aby zanurzyć wszystkie zarodki. Inkubować z delikatnym kołysaniem O/N przy RT.</li>
	<li>Rano usuń i wyrzuć roztwór przeciwciał. Dodać 0,5 ml 2% NGS/PBTx, aby zmyć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Delikatnie kołysz przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Przyciemnij górne światła i rozcieńcz odpowiednie fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało drugorzędowe w 10% NGS/PBTx, tak aby każdy warunek zawierał co najmniej 0,5 ml. Z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko acetylowanej tubulinie użyj zielono-fluorescencyjnego barwnika koziego anty-mysiego IgG w rozcieńczeniu 1: 500.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 4 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej w ciemności. Od teraz przetwarzaj próbki pod przyciemnionym światłem i inkubuj w ciemnym pojemniku lub zawijając w folię aluminiową.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji należy usunąć i wyrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała. Dodaj 0,5 ml 2% NGS/PBTx do przemycia. Delikatnie kołysz przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>W przypadku współbarwienia immunologicznego należy uzyskać drugie przeciwciało pierwszorzędowe od innego gatunku niż pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe. W tych badaniach po królickim przeciwciałie anty-fosfo CaMK-II należy zastosować kozie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem.</li>
	<li>Rozcieńczyć królicze przeciwciało anty-fosfo CaMK-II w stosunku 1:20. Dla każdej probówki z zarodkami zawiesić w 0,3 ml 10% NGS/PBTx, a następnie dodać 15 μl podstawowego roztworu przeciwciała.</li>
	<li>Upewnij się, że zarodki są zanurzone, a światła przyciemnione. Inkubuj z delikatnym kołysaniem O/N przy RT w ciemności.</li>
	<li>Rano, przy przyćmionym świetle, wyjmij i wyrzuć roztwór przeciwciał. Dodać 0,5 ml 2% NGS/PBTx. Delikatnie kołysać przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Utrzymuj światła górne przyciemnione i wystarczająco rozcieńczone odpowiednim fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym, tak aby każdy warunek zawierał co najmniej 0,5 ml. W tym badaniu rozcieńczyć sprzężone z czerwonym barwnikiem kozie przeciwciało anty-królicze IgG (kanał czerwony) w stosunku 1:500 w 10% NGS / PBTx.</li>
	<li>Inkubować drugie przeciwciało drugorzędowe przez 4 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Pod koniec tej inkubacji i przy słabym oświetleniu usunąć i wyrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała. Dodać 0,5 ml PBTx. Delikatnie kołysać przez 5 min. Usuń i wyrzuć roztwór. Powtórz dwa razy. Przechowywać w PBTx lub 50% glicerolu/PBS, w zależności od procedury obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i przetwarzanie konfokalne
<ol>
	<li>Zamontuj zarodki do obrazowania. Umieść 1 - 5 zarodków na szklanym szkiełku. Stwórz komorę między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym, używając fragmentów szkiełka nakrywkowego po obu stronach komory. Zazwyczaj cztery szkiełka nakrywkowe #1 są używane do wykonania tych stosów dystansowych bez uszczelniania. 
	UWAGA: Nie jest wymagane żadne medium montażowe.</li>
	<li>Użyj obiektywu zanurzającego się w olejku 100X, aby ustawić ostrość pojedynczego zarodka za pomocą światła przechodzącego. Wyłącz światło. Włącz mikroskop konfokalny. Upewnij się, że odpowiednie lasery (zielony i/lub czerwony) są włączone i włączone jest akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Włącz program konfokalny. Na pasku "Zdobywanie" wybierz odpowiedni cel. Na pasku "XY Basic" ustaw rozmiar obrazu na 1,024, klikając przycisk 1,024.</li>
	<li>Na pasku "Laser i detektor" kliknij czerwone pole 488 i zielone pole 568, aby włączyć laser i detektor dla każdego kanału. Ustaw otwór na średni i dostosuj wzmocnienie na pasku "Wzmocnienie" każdego kanału, aby uzyskać wizualizację.</li>
	<li>Na pasku "Ustawienia pobierania" kliknij "Na żywo", aby rozpocząć pobieranie obrazów. Na pasku "Ustawienia widoku" odznacz pole "Wymuś integralne powiększenie", aby wyśrodkować okno "Na żywo".</li>
	<li>Na pasku "Uzyskaj ustawienia", w zakładce "Z", przejdź przez warstwy obrazu. Po wybraniu liczby sekcji optycznych do włączenia do obrazu, przejdź do pewnego punktu w "środku" płaszczyzny z.</li>
	<li>Na karcie "Z" kliknij małe czerwone pole "Odniesienie". Spowoduje to wyzerowanie RFA w punkcie wybranym jako "środek". W polu oznaczonym "Rozmiar kroku" wybierz grubość warstw (idealna jest od 0,25 μm do 2,0 μm). Zwróć uwagę na pole "Rozmiar pliku" i spróbuj ograniczyć do 1 GB. 
	UWAGA: Zazwyczaj uzyskuje się do 40 przekrojów optycznych o wielkości 0,5 - 1,0 μm, ale liczbę przekrojów można określić empirycznie.</li>
	<li>Aby znaleźć górną krawędź obrazu, kliknij kółko obok "Góra" i przejdź przez warstwy z. Teraz kliknij kółko obok "Na dole", komputer przeniesie obraz z powrotem do warstwy jako środka. Ponownie przejdź przez warstwy, aby znaleźć dolną krawędź obrazu.</li>
	<li>Kliknij ponownie "Na żywo" w polu "Ustawienia pozyskiwania", aby zatrzymać akwizycję lasera. W tym panelu kliknij czerwone pola oznaczone jako Średnia i Stos Z. Te pola zmienią kolor na zielony.</li>
	<li>W polu "Acquire Settings" (Ustawienia pobierania) kliknij "Pojedyncze", aby pobrać całą serię obrazów. Możesz monitorować postęp skanowania w obu kanałach i przez cały stos z.</li>
	<li>Aby zapisać, kliknij okno woluminu i kliknij "zapisz jako" i nazwij plik. Zapisz jako plik ".ids". Aby renderować plik woluminowo, gdy stos z jest nadal otwarty, wybierz menu rozwijane Dane i kliknij "renderowanie woluminu". Zapisz renderowany plik jako plik TIFF. Jest to wyświetlany obraz, który jest pokazany w tej publikacji.</li>
</ol>

<ol><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li>
<li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells%3A+anaphase+onset+is+calcium+modulated%2C+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li>
<li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Ca2%2B%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II%3A+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li>
<li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2%2B%2FCaM-dependent+Protein+Kinase+%28CaMK-II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li>
<li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifunctional+Calcium%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase%3A+From+Form+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li>
<li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5-mediated+expression+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li>
<li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li>
<li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li>
<li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. (1993).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644(2013).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metoda PFA/metanol została opracowana w tym laboratorium, a jej głównym celem była optymalizacja immunolokalizacji epitopu fosfo-T287-CaMK-II podczas rozwoju danio pręgowanego. Metoda ta z powodzeniem zlokalizowała P-CaMK-II podczas tworzenia kilku narządów rzęskowych, w tym danio pręgowanego KV,12 ucha wewnętrznego14 i nerki. 13 Technika ta była konieczna, zwłaszcza na etapie KW. Sukces tej metody wynika prawdopodobnie z połączenia a) minimalizacji autofluorescencji, b) zachow...

Techniki opisane tutaj są wynikiem badań, które miały na celu zdefiniowanie dalszych celów sygnałów Ca2+ podczas zdarzeń zachodzących we wczesnym okresie rozwoju, w tym zapłodnienia, gastrulacji, somitogenezy i formowania tułowia, oka, mózgu i narządów. 1-3 Pierwotne odkrycia embrionalnej sygnalizacji Ca2 + zależały od zastosowania naturalnych i zmodyfikowanych wskaźników Ca2 +, takich jak aequorin4 i fura-2. 5 Nawet przy obecnej technologii wykrywanie przejściowych wzrostów Ca2+ wymaga kłopotliwych narzędzi analitycznych i nie ujawnia celów takich sygnałów Ca2+. 
To laboratorium bada sygnały Ca2+, które działają poprzez zależne od Ca2+/kalmoduliny (wielofunkcyjne) kinazę białkową znaną jako CaMK-II, enzym wzbogacony w ośrodkowy układ nerwowy i pierwotnie zidentyfikowany jako regulator długotrwałego wzmocnienia. 6 CaMK-II nie jest specyficzny dla mózgu, jest szeroko eksprymowany i wysoce konserwatywny przez cały okres życia i ciała gatunków w całym królestwie zwierząt, w tym bezkręgowców. 7,8 CaMK-II ma unikalną zdolność do podtrzymywania własnej aktywności nawet po obniżeniu poziomu Ca2+ ze względu na zdolność do autofosforylacji w Thr287. W tym stanie autofosforylacji CaMK-II pozostaje aktywny w sposób niezależny odCa2+/CaM, aż do defosforylacji. 6 Tak więc lokalizacja fosforylowanego CaMK-II (Thr287) może zidentyfikować komórki, w których wystąpiły naturalne, istotne podwyższenia Ca2 +. 
Przeciwciało przeciwko autofosforylowanemu (P-Thr287) ssakowi CaMK-II zostało dobrze scharakteryzowane i początkowo było używane do lokalizacji aktywowanego CaMK-II w tkance mózgowej. 9 Danio pręgowany (Danio rerio) ma siedem genów CaMK-II10,11, których produkty białkowe zawierają sekwencję MHRQE[pT287]VECLK w tym regionie. 10,11 Ta sekwencja jest bardzo podobna do antygenu fosfopeptydowego użytego do wytworzenia tego króliczego przeciwciała poliklonalnego (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) i dlatego nie było całkowitą niespodzianką, że to przeciwciało zareagowało krzyżowo z danio pręgowanym CaMK-II. To laboratorium wykazało, że przeciwciało to reaguje z danio pręgowanym CaMK-II proporcjonalnie do autofosforylacji i aktywności niezależnej odCa2+/CaM. 12 Wykazano również, że dodatkowe panspecyficzne przeciwciała CaMK-II reagują krzyżowo z danio pręgowanym CaMK-II. 13
To przeciwciało zostało użyte do wykazania, że CaMK-II danio pręgowanego jest preferencyjnie aktywowany w komórkach po jednej stronie pęcherzyka Kupffera (KV), narządu rzęskowego niezbędnego do ustalenia asymetrii lewo/prawo. 12 Przeciwciało to wykorzystano do wykazania, że CaMK-II jest przejściowo aktywowany w czterech sąsiednich komórkach po lewej stronie KV podczas dokładnie tej samej fazy rozwojowej, w której określa się położenie narządu. 12 Oprócz pęcherzyka Kupffera (KV), autofosforylowany (P-T287) znajdował się również w określonych miejscach wewnątrzkomórkowych w innych tkankach rzęskowych, w tym w nerkach, nerkach, neuromastach i uchu wewnętrznym. 12,13 W nerce danio pręgowanego P-T287-CaMK-II jest wzbogacony wzdłuż wierzchołkowej granicy rzęskowych komórek przewodowych oraz w obrębie rzęsek kloaki, gdzie wpływa na ich składanie. 13 Wreszcie, w rozwijającym się uchu wewnętrznym, P-T287-CaMK-II jest intensywnie skoncentrowany u podstawy rzęsek i wpływa na różnicowanie komórek poprzez szlak sygnałowy Delta-Notch. 14 Podsumowując, wykrycie aktywowanego CaMK-II wskazało miejsca wewnątrzkomórkowego uwalniania Ca2 + i rzuciło światło na potencjalne nowe szlaki sygnałowe.
Te odkrycia były całkowicie zależne od opracowania czułej i dokładnej metody lokalizacji aktywowanego (P-T 287-autofosforylowanego) CaMK-II. Opisano metody utrwalania i barwienia immunologicznego danio pręgowanego, nerki i ucha wewnętrznego. Opisano również ograniczenia tej techniki. Techniki te powinny być przydatne dla każdego badacza, który chce uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości w dwóch kanałach fluorescencyjnych nie tylko fosfo-epitopów, ale dowolnego epitopu, podczas wczesnego rozwoju kręgowców.

<table><tbody><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P-7629</td><td>0,12% roztwór podstawowy. Rozcieńczyć w stosunku 1:40 w wodzie systemowej</td></tr><tr><td>Alexa488 anty-mysia IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Koza poliklonalna, stosować w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 anty-królicza IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Koza poliklonalna, stosować w stosunku 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 falloidyna</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Ppreferencyjnie wiąże się z F-aktyną</td></tr><tr><td>Alexa568 anty-mysia IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>Koza poliklonalna, stosować w 1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 anty-królicza IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Koza poliklonalna, stosować w 1:500</td></tr><tr><td>anty-acetylowana &#945;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>Mysi monoklonalny, stosować w 1:500</td></tr><tr><td>anty-fosfo-T287 CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>Królik poliklonalny, stosować w 1:20</td></tr><tr><td>anty-total CaMK-II</td><td>BD Biosciences</td><td>611292</td><td>Mysz monoklonalna, stosować w stosunku 1:20</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>S96857</td><td>Klasa laboratoryjna, 95% denaturacja</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&nbsp; grubość</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>Szkiełka standardowe</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A411</td><td>Przechowywać w zamrażarce</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>20170-038</td> z <td>nakrętką, niesterylne</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>Probówki z podwielokrotnością 1 ml, przechowywać w zamrażarce</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>Klasa odczynnika, krystaliczna</td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>119-069-131</td><td>10x roztwór podstawowy lub wyprodukowany w laboratorium</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>10% roztwór w wodzie, przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>10% roztwór w wodzie, przechowywać w mikroskopie</td></tr><tr><td>RT Compound</td><td>Nikon</td><td>E-600</td><td>Montaż na stole bez wibracji</td></tr><tr><td>C1 Plus dwulaserowy skaningowy konfokalny</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td><td>Uruchamiany przez program EZ-C1, ale aktualizacje używają " Elementy"</td></tr></tbody></table>

immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

Szybka proliferacja komórek, specyficzna dla tkanek ekspresja genów i pojawienie się sieci sygnałowych charakteryzują wczesny rozwój embrionalny wszystkich kręgowców. Kinetyka i lokalizacja sygnałów - nawet w obrębie pojedynczych komórek - w rozwijającym się zarodku uzupełnia identyfikację ważnych genów rozwojowych. Opisano techniki barwienia immunologicznego, które, jak wykazano, definiują kinetykę sygnałów wewnątrzkomórkowych i całych zwierząt w strukturach tak małych, jak rzęski pierwotne. Techniki utrwalania, obrazowania i przetwarzania obrazów za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego ze skaningiem mogą być wykonane w ciągu zaledwie 36 godzin.
Danio rerio) jest pożądanym organizmem dla badaczy, którzy chcą prowadzić badania na gatunku kręgowców, który jest przystępny cenowo i istotny dla chorób ludzkich. Genetyczne nokauty lub nokauty muszą być potwierdzone przez utratę rzeczywistego produktu białkowego. Takie potwierdzenie utraty białka można uzyskać za pomocą opisanych tutaj technik. Wskazówki dotyczące szlaków sygnałowych można również rozszyfrować za pomocą przeciwciał, które reagują z białkami, które zostały zmodyfikowane potranslacyjnie przez fosforylację. Zachowanie i optymalizacja stanu fosforylacji epitopu ma zatem kluczowe znaczenie dla tego oznaczania i jest osiągane przez ten protokół.
To badanie opisuje techniki utrwalania zarodków w ciągu pierwszych 72 godzin rozwoju i kolokalizacji różnych istotnych epitopów z rzęskami w pęcherzyku Kupffera (KV), nerce i uchu wewnętrznym. Techniki te są proste, nie wymagają preparacji i można je wykonać w stosunkowo krótkim czasie. Rzutowanie konfokalnych stosów obrazów na pojedynczy obraz jest użytecznym sposobem prezentowania tych danych.

Optymalne warunki wizualizacji fosfoepitopów
Metody opisujące immunolokalizację epitopów białkowych w embrionach danio pręgowanego są stosunkowo nieliczne w porównaniu z metodami lokalizacji mRNA za pomocą hybrydyzacji in situ. Utrwalacze stosowane w lokalizacji epitopów białkowych w komórkach rzęskowych embrionów danio pręgowanego obejmowały 4% PFA/PBS oraz utrwalacz Denta, będący mieszaniną metanolu i...

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Ogólnym celem tej procedury jest immunolokalizacja białek aktywowanych w zarodku danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i biologii komórki, takie jak lokalizacja i aktywacja białek fosforylowanych w całym zarodku. Główną zaletą tej techniki jest możliwość lokalizacji sygnalizacji zależnej od wapnia w całym zarodku poprzez immunobarwienie białek aktywowanych przez wapń.Po uzyskaniu embrionów typu dzikiego lub transgenicznych zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać do embrionów w wodzie systemowej 0,003% PTU w celu zablokowania pigmentacji i inkubować do pożądanego stadium rozwojowego. Gdy embriony osiągną odpowiedni etap, należy dodać do naczynia MESAB, aby znieczulić ryby. Po znieczuleniu ryb należy usunąć jak najwięcej wody systemowej, a następnie dodać świeże 4% PFA oraz PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech godzin.Po inkubacji usunąć PFA i zastąpić go 100% metanolem. Następnie przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 48 godzin. W celu przeprowadzenia immunobarwienia umieścić minimum 10 zarodków dla każdego warunku eksperymentalnego w oznakowanych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mm.Po opadnięciu zarodków na dno probówki usunąć i wylać metanol, a następnie przeprowadzić progresywne przemycia w roztworach etanolu o malejących stężeniach w buforze PBTx w celu rehydratacji zarodków. Usunąć ostatnią porcję PBTx i dodać 0,5 mililitra 10% normal goat serum (NGS) w PBTx. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę, delikatnie kołysząc probówką.Następnie należy usunąć roztwór i dodać od 0,2 do 0,5 mililitra przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciwko acetylowanej tubulinie w rozcieńczeniu 1:5 w 10% NGS i PBTx. Zarodki należy inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc naczyniem. Rano należy usunąć i odrzucić przeciwciała, a następnie przeprowadzić trzy etapy płukania, używając za każdym razem 0,5 mililitra 2% NGS i PBTx przez pięć minut przy delikatnym kołysaniu.Przyciemnić światła górne i dodać do każdej próbki 500 µL roztworu przeciwciała wtórnego sprzężonego z fluoresceincją w rozcieńczeniu 1:500 w 10% NGS i PBTx. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez cztery godziny przy łagodnym kołysaniu. Po inkubacji przemyć embriony trzykrotnie.Aby przeprowadzić barwienie współodpornościowe, należy dodać przeciwciało anty-fosfo CaMKII w rozcieńczeniu 1:20. Inkubować w ciemności podczas delikatnego kołysania przez noc. Następnego ranka, po trzykrotnym przemyciu zarodków roztworem 2% NGS i PBTx, dodać przeciwciało kozie anty-królicze IgG sprzężone z czerwonym fluorescejnym barwnikiem 568 w rozcieńczeniu 1:5 oraz 10% NGS i PBTx.Po czterogodzinnej inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej, przemyć embriony trzykrotnie i przechowywać w PBTx lub 50% glicerolu w PBS, w zależności od procedury obrazowania. Aby zamocować embriony do obrazowania, umieść od jednego do pięciu embrionów na szkiełku przedmiotowym. Użyj czterech fragmentów nakrywek szkiełek nr 1, układając je stosami po obu stronach ryby, aby stworzyć komorę.Następnie na górze należy umieścić szkiełko nakrywkowe. Korzystając z obiektywu imersyjnego 100X i światła przechodzącego, należy ustawić ostrość na pojedynczym embrionie. Następnie należy wyłączyć światło.Włącz mikroskop konfokalny z odpowiednimi laserami i uruchom zdalne ostrzenie. Otwórz program do mikroskopii konfokalnej i w pasku akwizycji wybierz odpowiedni obiektyw. Następnie, w pasku podstawowym XY, kliknij przycisk 1024, aby ustawić rozmiar obrazu.W pasku laserów i detektorów kliknij czerwone pole 488 oraz zielone pole 568, aby włączyć detektor lasera dla każdego kanału, i ustaw otwór wprzepustowy (pinhole) na wartość medium. Następnie w pasku wzmocnienia (gain) dostosuj wzmocnienie dla każdego kanału, aby uzyskać widoczność obrazu. W kolejnym kroku, w pasku ustawień akwizycji, kliknij live, aby rozpocząć pozyskiwanie obrazów.W pasku ustawień widoku odznacz pole wymuś przybliżenie całki (force integral zoom), aby wycentrować obraz w oknie podglądu na żywo. W pasku ustawień akwizycji, w zakładce Z, przejrzyj poszczególne warstwy obrazu. Po wybraniu liczby warstw do uwzględnienia w obrazie, przesuń się do punktu znajdującego się w centrum płaszczyzny Z.W karcie Z kliknij małe czerwone pole referencyjne. Pozwoli to wyzerować RFA w punkcie wybranym jako środek. W polu oznaczonym jako rozmiar kroku wybierz grubość warstw.Zwróć uwagę na pole rozmiaru pliku i staraj się ograniczyć pliki do jednego gigabajta. Aby znaleźć górną krawędź obrazu, kliknij okrąg obok napisu „top” i przemieszczaj się przez warstwy Z. Teraz kliknij okrąg obok napisu „bottom”, a komputer przywróci obraz do warstwy środkowej.Następnie w oknie ustawień akwizycji ponownie kliknij przycisk live, aby zatrzymać akwizycję laserową. W tym panelu kliknij czerwone pola oznaczone jako average oraz Z stack. Pola te zmienią kolor na zielony.W oknie ustawień akwizycji kliknij „single”, aby pozyskać całą serię obrazów. Monitoruj postęp skanowania w obu kanałach oraz przez cały stos Z. Aby zapisać dane, kliknij okno wolumetryczne, wybierz „save as” i nazwij plik.Aby przeprowadzić renderowanie wolumetryczne pliku, gdy stos Z (Z stack) jest nadal otwarty, wybierz rozwijane menu danych i kliknij opcję renderowania wolumetrycznego. Zapisz wyrenderowany plik w formacie .tif. Rysunek ten przedstawia immunohistochemię dla P-CaMKII i acetylowanej tubuliny, która jest standardowym markerem rzęsek w pęcherzyku Kupffera (Kuppfer's vesicle lub KV) u danio pręgowanego. Ruch rzęsek pierwotnych generuje kolisty przepływ płynu, co prowadzi do wzrostu poziomu wapnia w urzęsionych komórkach wyścielających KV oraz do aktywacji CaMKII w określonych miejscach, jak pokazano tutaj.Ryciny te przedstawiają P-CaMKII w postaci występującej na powierzchni apikalnej rzęskowych komórek wyściełających określone obszary przewodów okołonerkowych między 24 a 72 godzinami po zapłodnieniu (HPF). W pierwszym dniu rozwoju embrionalne ucho danio prążkowanego, utrwalone za pomocą PFA i metanolu, zachowuje swoje struktury, co umożliwia wykrycie barwienia CaMKII u podstawy oraz wzdłuż całej długości kinocilium. W 72 HPF ucho wewnętrzne poddano przeciwbarwieniu falloidyną Alexa 488 oraz przeciwciałem przeciwko tubulinie acetylowanej z Alexa 568.Fiksacja PFA i metanolem pozwoliła zachować zarówno F-aktynę, jak i tubulinę. Ryba w stadium 30 HPF wykazywała ekspresję GFP skierowanego na błonę, która zostałaby utracona przy fiksacji samym metanolem. Fiksacja PFA skutkowała osłabionym sygnałem P-CaMKII w porównaniu do fiksacji PFA i metanolem.Jednak na tym etapie rozwoju sygnał jest wystarczająco silny, aby można go było wykryć bez użycia metanolu. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch dni, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zastosowaniu świeżych embrionów i świeżych czynników wolnych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób lokalizacji fosfoprotein w embrionach ryb zebrafish.

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Przedstawione są tutaj protokoły immunohistochemicznej charakterystyki i lokalizacji peptydu oreksyny, receptorów oreksyny i receptorów endokannabinoidowych w jelitach i mózgach dorosłych dorosłych ryb pręgowanych z normalną i indukowaną dietą (DIO) przy użyciu metod immunoperyxidazy i podwójnej immunofluorescencji.

Identyfikacja oreksyny i receptorów endokannabinoidowych u dorosłych danio pręgowanego przy użyciu metod immunoperoksydazy i immunofluorescencji

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Prezentujemy technikę pomiaru z dużą precyzją proporcji izotopów w narządach myszy.

Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

Poznaj metodę immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach Danio rerio. Technika ta umożliwia lokalizację aktywowanych białek w strukturach rzęskowych oraz badanie kinetyki sygnałowania wapniowo-zależnego w biologii rozwoju.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów