Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest immunolokalizacja białek, które są aktywowane w zarodku danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju i komórki, takie jak lokalizacja i aktywacja fosforylowanych białek w całym zarodku. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zlokalizować sygnalizację zależną od wapnia w całym zarodku poprzez białka immunobarwiące aktywowane przez wapń.

Po uzyskaniu zarodków typu dzikiego lub transgenicznego zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 0,003% PTU do zarodków w wodzie systemowej, aby zablokować pigmentację i inkubować do pożądanego etapu rozwoju. Gdy zarodki osiągną właściwy etap, dodaj MESAB do naczynia, aby znieczulić rybę. Po znieczuleniu ryb usuń jak najwięcej wody systemowej, a następnie dodaj świeże 4% PFA i PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech godzin.

Po inkubacji usuń PFA i użyj 100% metanolu, aby go zastąpić. Następnie przechowuj zarodki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 48 godzin. Aby przeprowadzić barwienie immunologiczne, umieść co najmniej 10 zarodków dla każdego warunku eksperymentalnego w oznakowanych 1,5-milimetrowych probówkach do mikrowirówek.

Gdy zarodki osiądą na dnie probówki, usuń i wyrzuć metanol i zastosuj stopniowe płukanie zmniejszających się stężeń etanolu w PBTx w celu ponownego nawodnienia zarodków. Usuń ostatnie płukanie PBTx i dodaj 0,5 mililitra 10% normalnej koziej surowicy lub NGS w PBTx. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę z delikatnym kołysaniem.

Następnie usuń roztwór i dodaj 0,2 do 0,5 mililitra rozcieńczenia 1 do 5 mysiego przeciwciała monoklonalnego antyacetylowanej tubuliny i 10% NGS i PBTx. Inkubuj zarodki, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez noc. Rano usuń i wyrzuć przeciwciało i wykonaj trzy płukania przy użyciu 0,5 mililitra 2%NGS i PBTx z delikatnym kołysaniem przez pięć minut każde.

Przyciemnij górne światła i dodaj 500 mikrolitrów do każdej próbki rozcieńczenia 1 do 500 fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego w 10% NGS i PBTx. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez cztery godziny z delikatnym kołysaniem. Po inkubacji umyj zarodki trzy razy.

Do koimmunobarwienia dodać rozcieńczenie 1 do 20 przeciwciała anty-fosfo CaMKII. Wysiaduj w ciemności z delikatnym kołysaniem przez noc. Następnego ranka, po trzykrotnym umyciu zarodków 2% NGS i PBTx, dodaj rozcieńczenie 1 do 5 czerwonej 568 fluorescencyjnej sprzężonej kozy anty-króliczej IgG oraz 10% NGS i PBTx.

Po inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez cztery godziny, umyj zarodki trzy razy i przechowuj w PBTx lub 50% glicerolu w PBS, w zależności od procedury obrazowania. Aby zamontować zarodki do obrazowania, umieść od jednego do pięciu zarodków na szklanym szkiełku. Użyj czterech ułożonych w stos fragmentów szkiełka nakrywkowego numer jeden po obu stronach ryby, aby stworzyć komorę.

I umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Dzięki soczewce immersyjnej 100X z olejkiem i światłu przechodzącemu skup się na pojedynczym zarodku. Wyłącz światło.

Włącz mikroskop konfokalny z odpowiednimi laserami i włącz zdalne ustawianie ostrości. Otwórz program konfokalny i na pasku pozyskiwania wybierz odpowiedni obiektyw. Następnie na pasku podstawowym XY kliknij przycisk 1024, aby ustawić rozmiar obrazu.

Na pasku lasera i detektora kliknij czerwone pola 488 i zielone 568, aby włączyć detektor laserowy dla każdego kanału i ustawić otwór na średni. Następnie na pasku wzmocnienia dostosuj wzmocnienie dla każdego kanału, aby je zwizualizować. Następnie na pasku ustawień pobierania kliknij na żywo, aby rozpocząć pobieranie obrazów.

Na pasku ustawień widoku usuń zaznaczenie pola Wymuś całkowite powiększenie do środka w oknie na żywo. Na pasku ustawień pobierania na karcie Z przejdź przez kolejne warstwy obrazu. Po wybraniu liczby warstw, które mają zostać włączone do obrazu, przejdź do pewnego punktu w środku płaszczyzny Z.

Na karcie Z kliknij małe czerwone pole odwołania. Spowoduje to wyzerowanie RFA w punkcie wybranym jako środek. W polu oznaczonym rozmiarem kroku wybierz grubość warstw.

Zwróć uwagę na pole rozmiaru pliku i spróbuj ograniczyć pliki do jednego gigabajta. Aby znaleźć górną krawędź obrazu, kliknij kółko obok góry i przejdź przez warstwy Z. Teraz kliknij kółko obok dołu, a komputer przeniesie obraz z powrotem do warstwy jako środka.

Następnie w polu ustawień pobierania ponownie kliknij na żywo, aby zatrzymać akwizycję lasera. W tym panelu kliknij czerwone pola oznaczone jako średnia i stos Z. Te pola zmienią kolor na zielony.

W polu ustawień pobierania kliknij pozycję pojedynczy, aby pobrać całą serię obrazów. Monitoruj postęp skanowania w obu kanałach i przez cały stos Z. Aby zapisać, kliknij okno woluminu i kliknij Zapisz jako i nazwij plik.

Aby renderować plik woluminowo, gdy stos Z jest nadal otwarty, wybierz menu rozwijane danych i kliknij renderowanie woluminu. Zapisz wyrenderowany plik jako plik z kropką. Ten rysunek przedstawia barwienie immunologiczne dla P-CaMKII i acetylowanej tubuliny, która jest standardowym markerem rzęsek w pęcherzyku Kuppfera lub KV danio pręgowanego. Karmienie rzęsek pierwotnych generuje okrężny przepływ płynu, co prowadzi do podniesienia poziomu wapnia w komórkach rzęskowych wyściełających KV i aktywacji CaMKII w dyskretnych lokalizacjach, jak widać tutaj.

Liczby te pokazują P-CaMKII tak, jak pojawia się na wierzchołkowej powierzchni komórek rzęskowych wyściełających określone obszary przewodów okołonerkowych między 24 a 72 godzinami po zapłodnieniu lub HPF. W ciągu jednego dnia rozwoju ucho embrionalne danio pręgowanego utrwalone PFA i metanolem zachowuje swoje struktury i umożliwia wykrycie barwienia CaMKII u podstawy i wzdłuż kinocilum. Przy 72 HPF ucho wewnętrzne zostało podbarwione faloidyną Alexa 488 i antyacetylowaną tubuliną Alexa 568.

Utrwalenie metanolu PFA zachowało zarówno F-aktynę, jak i tubulinę. Te 30 ryb HPF wykazywało ekspresję GFP ukierunkowanego na błonę, który zostałby utracony po utrwaleniu metanolu. Wiązanie PFA skutkowało zmniejszonym sygnałem P-CaMKII w porównaniu z fiksacją z PFA i metanolem.

Jednak na tym etapie rozwoju sygnał jest na tyle silny, że można go wykryć bez metanolu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu świeżych zarodków i świeżych wolnych środków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak lokalizować fosfoproteiny w zarodkach danio pręgowanego.