Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe określenie dynamiki aktyny korowej za pomocą spektroskopii korelacji obrazu po akwizycji przez całkowite odbicie wewnętrzne, obrazowanie oświetlenia strukturalnego lub symulację murawy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofizyki, takie jak rola przepływu aktyny w korze mózgowej w regulacji interakcji w synapsie immunologicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy rozdzielczość w skali nanometrowej z kompatybilnością ze stylem życia, umożliwiając obserwację i analizę procesów na mniejszą skalę w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikroskopii instancjowej.

Technikę tę zademonstruje George Ashdown, doktorant z mojego laboratorium. W przypadku próbki testowej należy dodać pięć mikrolitrów subdyfrakcyjnego roztworu podstawowego mikrosfery o średnicy 100 nanometrów na powierzchnię świeżego, niepowlekanego szkiełka nakrywkowego. Następnie rozprowadź roztwór mikrosfery na szkiełku nakrywkowym za pomocą końcówki pipety i pozostaw do wyschnięcia.

Dodaj 200 mikrolitrów podłoża montażowego do testowego szkiełka nakrywkowego, aby przygotować się do rozpoczęcia obrazowania, włącz inkubator dla grzałki scenicznej systemu SIM do murawy i napełnij zbiornik wodą destylowaną, aby całkowicie pokryć podstawę elementu grzejnego. Niech woda zrównoważy się do 37 stopni Celsjusza. Podłącz kołnierz grzewczy do soczewki obiektywu i ustaw go na 37 stopni Celsjusza.

Następnie zabezpiecz blok gradacyjny kompatybilny z Turf 4 88 na ścieżce światła mikroskopu, aby upewnić się, że właściwa ścieżka optyczna jest zaangażowana. Przełącz tryb kanału na stole laserowym na pozycję pojedynczą. Powtórz tę czynność dla światłowodowego na stoliku mikroskopu.

Spodziewaj się, że zobaczysz błąd w oknie oprogramowania, jeśli te kroki nie zostaną wykonane. Po ustawieniu trybu opuść obiektyw do najniższej płaszczyzny Z i umieść na nim kroplę oleju. Umieścić szkiełko nakrywkowe próbki testowej z mikrosferami fluorescencyjnymi na stoliku mikroskopu.

Następnie wybierz idealny system ustawiania ostrości lub funkcję PFS na korpusie mikroskopu. Przesuwaj obiektyw stopniowo w górę w płaszczyźnie Z i zatrzymaj się, gdy przycisk PFS przestanie migać, co oznacza, że płaszczyzna ogniskowej została osiągnięta w oprogramowaniu sterującym. Przełącz się na podgląd na żywo, aby wyświetlić obraz mikrosfer na ekranie.

Dokonaj precyzyjnej regulacji ostrości za pomocą pokrętła mikromanipulatora PFS. Obserwuj równomierne oświetlenie bez nieostrej fluorescencji powyżej fali zapachowej o długości 75 nanometrów. Na koniec potwierdź, że oświetlenie strukturalne uzyskuje się, obserwując zmienny wzór oświetlenia z próbki mikrosfery fluorescencyjnej do stymulacji komórek T w komorach ósemki.

szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami mieszaniny przeciwciał anty CD 3 i anty CD 28 i inkubować szkiełko nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu szkiełka nakrywkowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść go na stoliku mikroskopowym, a następnie znajdź płaszczyznę ogniskową murawy. Następnie delikatnie odpipetuj 200 mikrolitrów transfekowanych limfocytów T do jednego z dołków na szkiełku nakrywkowym.

Użyj fluorescencji epi, aby śledzić transfekowane komórki transfekowane aktyną GFP, gdy lądują na szkiełku nakrywkowym. Gdy komórki się uspokoją, przełącz się w tryb na żywo za pomocą N SimPad i sprawdź, czy komórki na monitorze są ostre. Aby zarejestrować przebieg czasowy, otwórz okno Akwizycja ND i wybierz zakładkę czasu.

Następnie kliknij dodaj i ustaw interwał na brak opóźnienia. Ustaw czas trwania na 10 minut. Na koniec rozpocznij rejestrowanie danych, wybierając pozycję Uruchom teraz w oknie Pozyskiwanie ND.

Aby zrekonstruować obrazy, najpierw otwórz oprogramowanie analityczne zawierające odpowiedni moduł analizy. Kliknij aplikacje, a następnie wybierz okno pokaż koniec karty SIM. Ustaw modulację oświetlenia, kontrast i tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości na jeden, a następnie zrekonstruuj zestaw danych karty SIM murawy, aby utworzyć pełny obraz karty SIM z paska stanu obrazu.

Upewnij się, że rozmiar piksela wynosi 30 nanometrów, a następnie wyeksportuj dane jako pliki TIF do analizy patyczków. Po pobraniu i rozpakowaniu pakietu oprogramowania MATLAB w patyczkach otwórz skrypt. Następnie zdefiniuj parametry wejściowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym dla filtru usuwania nieruchomego.

W wierszu 23 ustaw parametr filtrowania na średnią ruchomą, a w wierszu 24 użyj 21 jako parametru średniej ruchu, aby wygenerować jedną mapę wektorową. Ustaw podregion czasowy w wierszu 31 na maksymalną liczbę klatek, w tym przypadku 63. Następnie w wierszu 32 ustaw przesunięcie czasowe na jeden w wierszach od 33 do 35.

Wprowadź nazwy plików wyjściowych, tytuły wyjściowych map wektorowych i ścieżkę katalogu wyjściowego. Następnie zdefiniuj format, w jakim mają być zapisywane obrazy map wektorowych. W tym przypadku png.

W oknie edytora MATLAB otwórz skrypt. Uruchom drążki jednokanałowe i załaduj serię obrazów, uruchamiając wiersze od pierwszego do 23 skryptu. Następnie uruchom linie od 29 do 35 drążków z jednym kanałem.

Aby rozpocząć analizę drążka, postępuj zgodnie z instrukcjami i wybierz wielokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania lub ROI, jeśli jest to wymagane. Aby wyświetlić mapy wektorowe, należy poprowadzić linie od 38 do 52. Następnie uruchom linie od 53 do 72, aby wykreślić histogram wielkości prędkości, pokazany tutaj to komórka T OT wyrażająca GFP oznaczona aktyną F, która została zobrazowana za pomocą protokołu symulacji murawy.

Omówione w tekście pięć minut po wprowadzeniu tej komórki na szkiełko nakrywkowe pokryte przeciwciałami anty CD 3 i anty CD 28 mającymi stymulować tworzenie synaps immunologicznych. Przeprowadzono bieg w czasie, aby można było zobrazować przepływ molekularny f aktyny. Późniejsza analiza tych danych za pomocą tego programu do patyczków umożliwiła ilościowe określenie przepływu molekularnego aktyny F, jak pokazano na tej mapie wektorowej odpowiadającej pudełkowemu obszarowi komórki po lewej stronie, który reprezentuje część peryferii synaps

Dalsze powiększenie tej mapy i podregionu limfocytów T wyjaśnia kierunkowość i prędkość przepływu aktyny, które można określić na podstawie długości wektora, a także kodu kolorystycznego Dane prędkości można również wykreślić na histogramie, co pozwala na analizę statystyczną. Podsumowując, wyniki te pokazują, że w synapsie immunologicznej aktyna F przepływa w symetryczny sposób z obwodu w kierunku centrum komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak pozyskiwać dane i analizować dynamikę aktyny korowej za pomocą spektroskopii korelacji obrazu.

Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w przepływ aktyny podczas migracji komórek T, może być również stosowana w innych systemach, w których przepływ molekularny jest uważany za ważny, takich jak migracja komórek.