Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ilościowe określenie dynamiki aktyny korowej za pomocą spektroskopii korelacyjnej obrazów po akwizycji obrazu techniką całkowitego wewnętrznego odbicia, obrazowania z iluminacją strukturalną lub turf sim. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki, takie jak rola przepływu aktyny korowej w regulacji oddziaływań w synapsie immunologicznej. Główną zaletą tej techniki jest połączenie rozdzielczości w skali nanometrów z kompatybilnością z warunkami życiowymi, co pozwala na obserwację i analizę procesów w mniejszej skali w porównaniu do konwencjonalnych technik mikroskopii fluorescencyjnej.

Technikę tę zademonstruje George Ashdown, doktorant z mojego laboratorium. W ramach próbki testowej nanieś pięć mikrolitrów roztworu stokowego fluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 100 nanometrów, znajdujących się poniżej granicy dyfrakcyjnej, na powierzchnię świeżego, niepowlekanego szkiełka podstawowego. Następnie rozprowadź roztwór mikrosfer po szkiełku za pomocą końcówki pipety i pozostaw do wyschnięcia.

Nanieś 200 µL medium montażowego na szkiełko nakrywki z próbką w celu przygotowania do obrazowania. Włącz inkubator dla grzałki stołu systemu turf SIM i napełnij zbiornik wodą destylowaną tak, aby całkowicie przykryć podstawę elementu grzejnego. Pozostaw wodę do czasu osiągnięcia temperatury 37 °C. Podłącz opaskę grzewczą do obiektywu i ustaw jej temperaturę na 37 °C.

Następnie zamocuj blok stopniujący Turf 4 88 w torze optycznym mikroskopu, aby upewnić się, że zaangażowano właściwą drogę optyczną. Przełącz tryb kanału w podstawie laserowej na pozycję pojedynczą. Powtórz tę czynność dla kabla światłowodowego na stoliku mikroskopu.

W przypadku pominięcia tych kroków w oknie oprogramowania pojawi się błąd. Po ustawieniu trybu opuść obiektyw do najniższej płaszczyzny Z i nanieś na niego kroplę oleju. Umieść na stole mikroskopu szkiełko nakrywkę z próbką zawierającą fluorescencyjne mikrosfery.

Następnie wybierz system idealnego ostrzenia (perfect focus system) lub funkcję PFS na korpusie mikroskopu. Stopniowo przesuwaj obiektyw w górę wzdłuż płaszczyzny Z i zatrzymaj się, gdy przycisk PFS przestanie migać, co wskazuje na osiągnięcie płaszczyzny ogniskowej w oprogramowaniu sterującym. Przełącz do trybu podglądu na żywo, aby zobrazować mikrosfery na ekranie.

Wykonaj precyzyjne korekty ostrości, używając pokrętła mikromanipulatora PFS. Zaobserwuj jednolite oświetlenie bez nieostrosłowej emisji fluorescencyjnej powyżej fali zapachowej 75 nanometrów. Na koniec potwierdź uzyskanie oświetlenia strukturalnego, obserwując fluktuujący wzór oświetlenia próbki fluorescencyjnych mikrosfer dla stymulacji limfocytów T w komorach ośmiu.

Zakropluj na szkiełko nakrywkę 200 µL mieszaniny przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, a następnie inkubuj szkiełko przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Po umyciu szkiełka nakrywki zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść je na stole mikroskopu i odnajdź płaszczyznę ogniskowania. Następnie delikatnie pipetuj 200 µL transfekowanych limfocytów T do jednej z studni na szkiełku nakrywce.

Użyj fluorescencji epifluorescencyjnej, aby śledzić transfekowane GFP aktyną komórki podczas ich osiadania na szkiełku nakrywce. Po osiadaniu komórek przełącz urządzenie w tryb live za pomocą N SimPad i sprawdź, czy komórki widoczne na monitorze są w ostrości. Aby zarejestrować przebieg czasowy, otwórz okno akwizycji ND i wybierz zakładkę czasu.

Następnie kliknij add i ustaw interwał na no delay. Ustaw czas trwania na 10 minutes. Na koniec rozpocznij rejestrację danych, wybierając Run now w oknie akwizycji ND.

Aby zrekonstruować obrazy, należy najpierw otworzyć oprogramowanie analityczne zawierające odpowiedni moduł analizy. Kliknij aplikacje, a następnie wybierz okno show end sim. Ustaw kontrast modulacji oświetlenia oraz tłumienie szumów wysokiej rozdzielczości na wartość jeden, a następnie zrekonstruuj zestaw danych turf SIM z paska stanu obrazu, aby uzyskać kompletny obraz SIM.

Upewnij się, że rozmiar piksela wynosi 30 nanometrów, a następnie wyeksportuj dane jako pliki TIF do analizy stick. Po pobraniu i rozpakowaniu pakietu oprogramowania sticks do programu MATLAB otwórz skrypt. Następnie zdefiniuj parametry wejściowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym dla filtra usuwania elementów nieruchomych (immobile removal filter).

W linii 23 ustaw parametr filtrowania na średnią ruchomą (moving average), a w linii 24 użyj wartości 21 jako parametru średniej ruchomej, aby wygenerować jedną mapę wektorową. W linii 31 ustaw podregion czasowy (temporal subregion) na maksymalną liczbę klatek, w tym przypadku 63. Następnie w linii 32 ustaw przesunięcie czasowe (temporal shift) na jeden w liniach od 33 do 35.

Wprowadź nazwy plików wyjściowych, tytuły wyjściowych map wektorowych oraz ścieżkę do katalogu wyjściowego. Następnie określ format, w którym mają zostać zapisane obrazy mapy wektorowej. W tym przypadku jest to png.

W oknie edytora MATLAB otwórz skrypt. Uruchom skrypt „run one channel sticks” i wczytaj serię obrazów, wykonując linie od 1 do 23 skryptu. Następnie wykonaj linie od 29 do 35 skryptu „run one channel sticks”.

Aby rozpocząć analizę sticków, postępuj zgodnie z komunikatem i w razie potrzeby wybierz wielokąt, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI). Aby wyświetlić mapy wektorowe, uruchom linie od 38 do 52. Następnie uruchom linie od 53 do 72, aby wykreślić histogram wartości prędkości; tutaj przedstawiono komórkę T OT-I wykazującą ekspresję GFP z oznakowaną aktyną F, która została zobrazowana zgodnie z protokołem turf sim.

Omówiono w tekście pięć minut po naniesieniu tej komórki na szkiełko podstawowe pokryte przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, mających na celu stymulację tworzenia synaps immunologicznych. Wykonano pomiar czasowy, aby można było zwizualizować przepływ molekularny f-aktyny. Następująca analiza tych danych przy użyciu programu this sticks umożliwiła kwantyfikację molekularnego przepływu F-aktyny, przedstawioną na tej mapie wektorowej odpowiadającej zaznaczonemu obszarowi komórki po lewej stronie, który reprezentuje fragment peryferii synapsy.

Dalsze powiększenie tej mapy oraz podregionu limfocytów T pozwala dokładniej określić kierunkowość i prędkość przepływu aktyny, które można wyznaczyć na podstawie długości wektora oraz kodu kolorystycznego. Dane dotyczące prędkości można również przedstawić na histogramie, co umożliwia analizę statystyczną. Łącznie wyniki te pokazują, że w synapsie immunologicznej aktyna F przepływa symetrycznie z peryferii w kierunku centrum komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak pozyskiwać dane oraz analizować dynamikę aktyny korowej przy użyciu spektroskopii korelacyjnej obrazów.

Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w przepływ aktyny podczas migracji limfocytów T, może ona również znaleźć zastosowanie w innych układach, w których przepływ molekularny jest uważany za istotny, na przykład podczas badania migracji komórek.