Name: Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania przepływu korowej aktyny w limfocytach T za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów. Technika łączy nanometrową rozdzielczość z obrazowaniem komórek żywych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

D.M.O. przyznaje grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych nr 337187 oraz grant Marie-Curie na integrację kariery nr 334303. P.W.W. uznaje program Discovery Grant przyznany przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady.

Uwaga: Etapy 1 i 2 odbywają się przed dniem obrazowania; upewnij się, że wszystkie podłoża i suplementy, które mają być użyte przed lub w dniu obrazowania, są wyrównane. Równowagę osiąga się poprzez podgrzanie pożywek i suplementów do 37 °C w inkubatorze nastawionym na 5% CO2 . Wszystkie etapy hodowli komórkowych i powlekania szkiełek nakrywkowych odbywają się w sterylnych warunkach pod okapem z przepływem laminarnym.
1. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Transfekcja limfocytów T, które mają być zobrazowane 24 godziny przed eksperymentem, za pomocą plazmidu kodującego fluorescencyjny konstrukt fuzyjny do znakowania i obrazowania F-aktyny GFP. Uwaga: Komórki należy podzielić na 24 godziny przed transfekcją (48 godzin przed obrazowaniem), aby upewnić się, że komórki są w optymalnym zdrowiu i znajdują się w logarytmicznej fazie wzrostu.
	<ol>
		<li>Umieścić 5 ml suplementu RPMI (RPMI 1640 plus 10% FBS i 1% Pen-Strep (opcjonalnie)) w jednym dołku z 6-dołkową płytką do inkubatora w celu zrównoważenia.</li>
		<li>Osad 2 x 107 limfocytów T hodowanych w temperaturze 37 °C +5 % CO2 w suplemencie RPMI przy użyciu probówki wirówkowej o sile 327 x g przez 5 minut i myć w równej objętości wstępnie podgrzanego podłoża do elektroporacji. Uwaga: Pożywka do elektroporacji to zredukowana pożywka surowicy zawierająca i suplementy (patrz materiały eksploatacyjne).</li>
		<li>Po ponownym granulowaniu w temperaturze 327 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki do elektroporacji i powoli dodać do kuwety, dodać 5 μg plazmidu w klasie PCR dH2O w celu znakowania F-aktyny.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w kuwetę w obszar roboczy okapu, aby upewnić się, że z nośnika nie ma pęcherzyków powietrza, które mogą powodować wyładowania łukowe w elektryczności i równomiernie rozprowadzić ogniwa w mediach.</li>
		<li>Włącz aparat do elektroporacji i ustaw napięcie na 300 V i pojemność na 290 Ω. Elektroporować próbkę przy użyciu rozpadu wykładniczego przez 20 ms. Uwaga: Optymalizacja może być wymagana dla różnych komórek i różnych konstrukcji plazmidowych.</li>
		<li>Po zakończeniu protokołu transfekcji przechowuj komórki na lodzie przez 1 minutę przed kontynuacją.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść komórki z kuwety na 6-dołkową płytkę zawierającą 5 ml zrównoważonego suplementu RPMI z kroku 1.1.1.</li>
		<li>Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Szkiełka nakrywkowe i dodatek do obrazowania przed ociepleniem
<ol>
	<li>Pokryj szkiełka nakrywkowe przeciwciałami, aby indukować stymulację limfocytów T.
	<ol>
		<li>Pokryć każdą komorę 8-dołkowego szkiełka nakrywkowego 1 μg / ml αCD3 i αCD28 w 200 μl PBS.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C O/N. Alternatywnie, szkiełka nakrywkowe należy pokryć na 2 godziny przed obrazowaniem i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zmniejszyć dryft podczas procesu obrazowania poprzez zminimalizowanie zmian temperatury szkiełka nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utworzyć próbkę testową szkiełka nakrywkowego z subdyfrakcyjnymi mikrosferami fluorescencyjnymi 0,1 μm.
	<ol>
		<li>Wiruj podstawowy roztwór kulek, aby uniknąć grudek.</li>
		<li>Na nowym, czystym szkiełku nakrywkowym tego samego typu, co szkiełko użyte w kroku 2.1.1, odpipetować 5 μl fluorescencyjnego roztworu podstawowego mikrosfery na powierzchnię (zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
		<li>Rozprowadź roztwór mikrosfery na szkiełku nakrywkowym za pomocą końcówki pipety.</li>
		<li>Pozostawić do wyschnięcia, a następnie nałożyć 200 μl podłoża montażowego, takiego jak PBS. 
		Uwaga: podłoże montażowe powinno być zgodne z tym, które jest używane do obrazowania próbek komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważyć HBSS (+ 20 mM HEPES, zwany dalej "suplementem HBSS") w probówce wirówkowej, umieszczając w inkubatorze w celu wstępnego ogrzania O/N w temperaturze 37 °C + 5% CO2, 
	Uwaga: dodanie HEPES ma na celu buforowanie CO2, jeśli używasz komory inkubacyjnej z wejściem CO2 pomiń tę suplementację.</li>
</ol>
3. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Włącz inkubator typu stage top mikroskopu TIRF-SIM i umieść tyle wody destylowanej w zbiorniku mikroskopu, aby całkowicie pokryć podstawę elementu grzejnego. Pozwól, aby woda zrównoważyła się do 37 °C. Dodaj kołnierz grzewczy do soczewki obiektywu, również ustawiony na 37 °C. 
	Uwaga: Ze względu na czułość konfiguracji, te czynności są wykonywane poprzedniej nocy, aby elementy optyczne miały stabilną temperaturę przed obrazowaniem.</li>
	<li>Umieść blok kratowy kompatybilny z TIRF 488 na ścieżce światła mikroskopu i zabezpiecz na miejscu.
	<ol>
		<li>Przełącz tryb kanału i światłowodowy odpowiednio do pozycji "Pojedynczy" na stole laserowym i stoliku mikroskopu, aby włączyć odpowiednią ścieżkę optyczną dla trybu TIRF-SIM. Uwaga: Pominięcie tego kroku spowoduje błąd (Rysunek 1A) w oknie oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz wszystkie podzespoły mikroskopu i komputera, a następnie otwórz oprogramowanie do kontroli akwizycji.
	<ol>
		<li>Otwórz okna OC panel, Ti Pad, N-SIM Pad i ND Acquisition (Akwizycja ND) (Rysunek 1B). W 'OC Panel' wybierz opcję 'TIRF 488' (Rysunek 2B, żółta strzałka).</li>
		<li>W oknie N-SIM Pad wybierz ustawienia "TIRF-SIM" i "Ruchomy" (Rysunek 2C, żółte strzałki). Wybierz przycisk ustawień (Rysunek 1C, żółte pole) i wybierz "TIRF 488 (dla 100x TIRF 488nm)" z menu rozwijanego, naciśnij "Zastosuj" i "OK".</li>
		<li>Ustaw ustawienia kamery w "ustawieniach DU897" na: szybkość odświeżania 50 ms, tryb odczytu, wzmocnienie EM 3 MHz przy 14 bitach i mnożnik wzmocnienia EM 300 z wzmocnieniem konwersji 1 (rysunek 1C, zielona ramka). 
		Uwaga: zobacz Reprezentatywne wyniki, aby zapoznać się z kwestiami dotyczącymi liczby klatek na sekundę.</li>
		<li>Skalibruj oświetlenie mikroskopu pod kątem TIRF-SIM, wybierając obiektyw 100x 1.49 NA CFI Apochromat TIRF, na "N-SIM Pad" ustaw moc lasera 488 nm na 10%. 
		Uwaga: Rozmiar pikseli obrazów RAW wynosi 60 nm, a pole widzenia 512 x 512 pikseli.</li>
		<li>Wyczyść soczewkę obiektywu za pomocą chusteczki do soczewek, aby usunąć kurz i olej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź płaszczyznę ogniskowej TIRF-SIM.
	<ol>
		<li>Zacznij od celu w najniższej możliwej płaszczyźnie z. Umieść kroplę oleju do soczewek na obiektywie i dodaj próbkę mikrosfery fluorescencyjnej z kroku 2.2 do stolika mikroskopowego.</li>
		<li>Wybierz funkcję Perfect Focus System (PFS) znajdującą się na korpusie mikroskopu.</li>
		<li>Powoli przesuwaj obiektyw w górę przez płaszczyznę z, aż przycisk PFS przestanie migać, aby potwierdzić, że płaszczyzna ogniskowej została osiągnięta.</li>
		<li>Przełącz się na widok "Na żywo" w oprogramowaniu sterującym i zobrazuj mikrosfery w celu dokonania ostatecznych regulacji za pomocą pokrętła mikromanipulatora PFS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj równomierne oświetlenie bez nieostrej emisji fluorescencji powyżej fali ulotnej 75 nm. 
	Uwaga: Upewnij się, że oświetlenie strukturalne jest spełnione, obserwując zmienny wzór oświetlenia z próbki mikrosfery fluorescencyjnej.</li>
	<li>Zmierz próbkę mikrosfery fluorescencyjnej i określ ilościowo poprawioną rozdzielczość obrazowania, obserwując pełną szerokość w połowie maksimum (FWHM) profilu intensywności.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Analyze (wersja 4.20.01) z zainstalowanym modułem NIS-A N-SIM Analysis i wybierz "Aplikacje" -> "Pokaż okno N-SIM".</li>
		<li>Mając kontrast modulacji oświetlenia (IMC) i tłumienie szumów o wysokiej rozdzielczości (HRNS) ustawione na 1 dla zestawów danych TIRF-SIM (rysunek 2), zrekonstruuj przykładowy obraz mikrosfery, aby wygenerować zrekonstruowany obraz o wymiarach 1 024 x 1 024 pikseli i rozmiarze piksela 30 nm.</li>
		<li>Za pomocą narzędzia profilu linii o szerokości 1 piksela (Rysunek 3A, żółte pole), narysuj linię przechodzącą przez środek pojedynczej mikrosfery.</li>
		<li>Wybierz przycisk FWHM (Rysunek 3B, żółte pole) i kliknij maksima intensywności rozkładu Gaussa, a następnie jego minima intensywności.</li>
		<li>Upewnij się, że FWHM mikrosfery mieści się w zakresie 100 nm (rysunek 3C). Uwaga: rozdzielczość uzyskana podczas obrazowania próbek biologicznych będzie się różnić w zależności od stosunku sygnału do szumu wynikającego ze skuteczności znakowania i fluorescencji tła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do obrazowania
<ol>
	<li>Przygotowanie szkiełek nakrywkowych.
	<ol>
		<li>Pobrać z lodówki lub inkubatora szkiełko nakrywkowe pokryte αCD z kroku 2.1 i usunąć PBS zawierające αCD3 i αCD28 z każdej studzienki.</li>
		<li>Dodać 200 μl wstępnie podgrzanego suplementu HBSS z kroku 2.3 do każdego dołka szkiełka nakrywkowego. Umyj i wyjmij, aby upewnić się, że w roztworze pozostała minimalna ilość αCD3 i αCD28. Dodać kolejne 200 μl suplementu HBSS do studzienek nakrywkowych.</li>
		<li>Oczyść spód szkiełka nakrywkowego chusteczką do soczewek, aby usunąć olej i cząstki stałe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i znajdź płaszczyznę ogniskową TIRF szkiełka nakrywkowego, używając płaszczyzny Z PFS, jak pokazano w kroku 3.4.</li>
	<li>Przygotowanie komórek.
	<ol>
		<li>Odpipetować 200 μl pożywki zawierającej transfekowane komórki z kroku 1.1.8 do probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Osadzaj komórki w mikrowirówce o sile 268 x g przez 20 sekund i usuń pożywkę komórkową.</li>
		<li>Zawieś komórki w 200 μl wstępnie podgrzanego suplementu HBSS z kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Komórki obrazowania
<ol>
	<li>Weź do mikroskopu suplement HBSS zawierający komórki i delikatnie odpipetuj 200 μl do jednego z dołków.</li>
	<li>Pozostając w płaszczyźnie ogniskowej TIRF na szkiełku nakrywkowym (w trybie PFS), użyj okularu mikroskopu i oświetlenia epifluorescencyjnego, aby śledzić komórki fluorescencyjne zbliżające się do szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Gdy komórki wylądują na szkiełku nakrywkowym, przełącz się na tryb "Live" w N-SIM Pad, aby wyświetlić obraz na monitorze i sprawdzić, czy komórki są ostre na ekranie komputera.</li>
	<li>Aby rejestrować przebiegi czasowe, otwórz okno Akwizycja ND i wybierz zakładkę "Czas", kliknij "Dodaj" i ustaw "Interwał" na Brak opóźnienia, "Czas trwania" na 10 minut, "Pętle" są ustawione na 1, 
	Uwaga: Czas trwania można zmienić w zależności od interesującego Cię procesu; Oprogramowanie STICS może wyodrębniać wyniki ilościowe ze stosami obrazów o długości ≈10 klatek, gdy są rejestrowane za pomocą funkcji "Bez opóźnienia".</li>
	<li>Mając identyczne ustawienia akwizycji jak w przypadku próbki ściegu, rozpocznij rejestrowanie danych, wybierając opcję "Uruchom teraz" w oknie Akwizycja ND.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja obrazów SIM
<ol>
	<li>Po zakończeniu obrazowania otwórz oprogramowanie Analyze (v4.20.01) z zainstalowanym modułem NIS-A N-SIM Analysis i wybierz "Aplikacje" -> "Pokaż okno N-SIM".</li>
	<li>Gdy modulacja oświetlenia, kontrast (IMC) i tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości (HRNS) są ustawione na 1 dla zestawów danych TIRF-SIM (ilustracja 2), zrekonstruuj jeden (lub wiele za pomocą narzędzia Sekwencja wsadowa) nieprzetworzony plik SIM, aby uzyskać zrekonstruowany obraz karty SIM.</li>
	<li>Upewnij się, że zrekonstruowany plik ma rozmiar piksela 30 nm, wskazany na pasku stanu obrazu. 
	Uwaga: Rozmiar piksela nie ma wpływu na analizę STICS, ale powinien być co najmniej 2 razy mniejszy niż rozdzielczość przestrzenna PSF, aby zapewnić korelację przestrzenną między pikselami.</li>
	<li>Eksportuj dane jako pliki .tiff, gotowe do analizy STICS.</li>
</ol>
7. Analiza STICS
<ol>
	<li>Pobierz i rozpakuj pakiet oprogramowania STIC(C)S Matlab (Wiseman lab; dostępny jako informacje dodatkowe). Skrypt stics_vectormapping.m jest rdzeniem jednokanałowej analizy STICS, a pierwsze 30 wierszy kodu służy do definiowania parametrów wejściowych zgodnie z definicją w sekcji 2.1 podręcznika. Otwórz ten skrypt i zdefiniuj parametry wejściowe do analizy danych TIRF-SIM. Sugeruje się również dodanie folderu STIC(C)S z podfolderami do ścieżki Matlaba na komputerze lokalnym, zgodnie z opisem w dodatku do instrukcji.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj parametry wejściowe dla analizy danych, edytując odpowiednie wiersze kodu</li>
		<li>Aby przeprowadzić analizę danych TIRF-SIM w celu wygenerowania 1 mapy wektorowej, ustaw parametry czasowe na podregion czasowy w wierszu 31 na maksymalną liczbę klatek i przesunięcie czasowe w wierszu 32 na 1. Aby uzyskać szereg czasowy map wektorowych, należy zmienić te parametry.</li>
		<li>W przypadku filtra usuwania Immobile ustaw parametr "filtrowanie" (wiersz 23) na "Średnia krocząca" i ustaw parametr "MoveAverage" (wiersz 24) na 21, 
		Uwaga: Wykazano, że to ustawienie działa w przypadku wolniej poruszających się i dużych sygnałów fluorescencyjnych, ponieważ opiera się na odejmowaniu ramek szeregowych od analizowanej klatki.</li>
		<li>Zmień wiersze 33-38, aby ustawić nazwę plików wyjściowych i tytuły wyjściowych map wektorowych, a także ścieżkę katalogu wyjściowego i określić, w jakim formacie mają być zapisywane obrazy map wektorowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rozmiar piksela (μm)</td>
			<td>0,03 μm</td>
			<td>Linia 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba klatek na sekundę (s)</td>
			<td>1 sekund</td>
			<td>Linia 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalny czas opóźnienia (klatki)</td>
			<td>20 ramek</td>
			<td>Linia 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar podregionu (piksele)</td>
			<td>8 pikseli</td>
			<td>Linia 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odstępy między podregionami (piksele)</td>
			<td>1 piksel</td>
			<td>Linia 30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>Otwórz skrypt run1ChannelSTICS w oknie edytora Matlab. Załaduj serię obrazów, uruchamiając wiersze 1-23 tego skryptu. 
	Uwaga: Ten skrypt może być używany do wczytywania i wstępnego przetwarzania serii obrazów, wykreślania map wektorowych i histogramów prędkości oraz uruchamiania przetwarzania wsadowego dla wielu plików. W razie potrzeby przytnij obraz do obszaru zainteresowania, używając wierszy 24-26 tego skryptu.
	<ol>
		<li>Uruchom wiersze 29-35 run1ChannelSTICS, aby rozpocząć analizę STICS. Po wyświetleniu monitu wybierz wielokąt, aby wskazać określony obszar zainteresowania (ROI), jeśli jest to wymagane. Upewnij się, że zwrot z inwestycji nie nakłada się na krawędź komórki, ponieważ artefakty graniczne występują, gdy STICS analizuje te regiony.</li>
		<li>Uruchom wiersze 38-52, aby wyświetlić mapy wektorowe. Aby wykreślić histogram wielkości prędkości, uruchom linie 53-72.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li>
<li>Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+interaction+between+T+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific interaction between T and B cells.</a> Nature. 314, 537-539 (1985).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+antigen+recognition+by+naive+CD4%2B+T+cells%3A+compulsory+cytoskeletal+alterations+for+the+triggering+of+an+intracellular+calcium+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response.</a> European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Flow+Quantified+beyond+the+Diffraction+Limit+by+Spatiotemporal+Image+Correlation+of+Structured+Illumination+Microscopy+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+integrin-actin+linkage+using+high-resolution+protein+velocity+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping.</a> Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).</li>
<li>Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
<li>Watanabe, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+speckle+analysis+of+actin+filament+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia.</a> Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technika ta pozwoli naukowcom na obrazowanie i ilościowe określenie wcześniej nierozwiązywalnych szczegółów w komórkach wykazujących fluorescencję. W naszych wynikach pokazujemy, że F-aktyna przepływa w sposób symetryczny od obwodu komórki w kierunku środka komórki w limfocytach T IS. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi wynikami z danych kymograficznych o profilu liniowym1D 13 i rozszerzają możliwości analizy na dane 2D i dane o wysokiej rozdzielczości.
Prezentowana technika stanow...

Celem eksperymentu jest zobrazowanie i scharakteryzowanie przepływu molekularnego nitkowatej (F-)aktyny w żywych limfocytach T, poza granicą dyfrakcji, w celu ustalenia kierunku i wielkości przepływu podczas tworzenia synaps immunologicznych (IS). Technika ta zostanie przeprowadzona przy użyciu mikroskopu oświetlenia strukturalnego (SIM) w trybie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), obrazując limfocyty T Jurkat tworzące sztuczną synapsę na aktywacji szkiełek nakrywkowych pokrytych przeciwciałami anty-CD3- i anty-CD28. IS tworzy się między limfocytem T a jego celem; komórka prezentująca antygen (APC) po aktywacji receptora limfocytów T (TCR)1,2. Ponieważ jest to pierwszy krok do ustalenia, czy adaptacyjny układ odpornościowy generuje odpowiedź immunologiczną na infekcję, konsekwencje nieprawidłowej reakcji na bodźce mogą powodować szereg chorób. Znaczenie interakcji limfocytów T z APC jest dobrze udokumentowane, jednak rola dojrzałego IS po początkowej internalizacji sygnału TCR nie została jeszcze w pełni poznana.
Ponieważ uważa się, że cytoszkielet wspomaga dwa procesy związane z aktywacją TCR (ruch cząsteczek na błonie plazmatycznej i kontrola cząsteczek sygnałowych zależnych od cytoszkieletu aktynowego3,4 ), zrozumienie, jak cytoszkielet przestawia się przestrzennie i czasowo, wyjaśni etapy reorganizacji molekularnej podczas tworzenia synaps. Uważa się, że wsteczny przepływ F-aktyny gromadzi klastry TCR w kierunku centrum synapsy immunologicznej, uważa się, że ta translokacja jest niezbędna do zatrzymania sygnału i recyklingu; wspomaganie delikatnej równowagi aktywacji limfocytów T5.
Podczas gdy standardowa mikroskopia fluorescencyjna jest elastycznym narzędziem, które nadal dostarcza informacji o wielu zdarzeniach biologicznych, w tym interakcjach komórka-komórka, jest ona ograniczona przez zdolność systemu do dokładnego rozpoznawania wielu fluoroforów znajdujących się bliżej niż granica dyfrakcji (≈200 nm) od siebie. Ponieważ wiele zdarzeń molekularnych w komórkach obejmuje gęste populacje cząsteczek i wykazuje dynamiczne przegrupowanie w stanie spoczynku lub po określonej stymulacji, konwencjonalna mikroskopia świetlna nie zapewnia pełnego obrazu.
Użycie obrazowania w super rozdzielczości pozwoliło badaczom obejść limit dyfrakcji przy użyciu różnych technik. Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), taka jak PALM i STORM6,7, ma zdolność do określenia lokalizacji cząsteczek z dokładnością do około 20 nm, jednak techniki te opierają się na długim czasie akwizycji, budując obraz w wielu klatkach. Ogólnie rzecz biorąc, wymaga to utrwalenia próbek lub wykazania przez struktury niskiej ruchliwości, aby pojedyncze fluorofory nie były błędnie interpretowane jako wiele punktów. Podczas gdy obrazowanie ze wzbudzonym wyczerpaniem emisji (STED) umożliwia uzyskanie superrozdzielczości dzięki bardzo selektywnemu wzbudzeniu konfokalnemu8, wymagane podejście do skanowania może być powolne w całym polu widzenia komórki. STED wykazuje również znaczną fototoksyczność dla wyższych rozdzielczości ze względu na wzrost mocy wiązki zubożającej.
Mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM9) stanowi alternatywę dla tych metod, jest w stanie podwoić rozdzielczość standardowego mikroskopu fluorescencyjnego i jest bardziej kompatybilna z obrazowaniem żywych komórek niż obecne techniki SMLM. Wykorzystuje niższe moce lasera, w systemie szerokokątnym dla pól widzenia całej komórki; zapewnia zwiększoną szybkość akwizycji i jest kompatybilny ze standardowym znakowaniem fluoroforowym. Szerokokątny charakter SIM pozwala również na wykorzystanie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wysoce selektywnego wzbudzenia, z głębokością penetracji w wymiarze osiowym <100 nm.
Spektroskopia korelacji obrazów (ICS) to metoda korelacji fluktuacji intensywności fluorescencji. Ewolucja systemu ICS; Spektroskopia korelacji obrazów czasoprzestrzennych (STICS10) koreluje wewnątrzkomórkowe sygnały fluorescencyjne w czasie i przestrzeni. Korelując intensywność pikseli z otaczającymi pikselami w opóźnionych klatkach za pomocą funkcji korelacji, uzyskuje się informacje dotyczące prędkości przepływu i kierunkowości. Aby zapewnić, że obiekty statyczne nie zakłócają analizy STICS, zaimplementowano filtr obiektów nieruchomych, który działa poprzez odejmowanie średniej ruchomej intensywności pikseli.
Technika przedstawiona tutaj jest uważana za pierwszą demonstrację spektroskopii korelacji obrazów zastosowanej do danych mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości w celu ilościowego określenia przepływu molekularnego w żywych komórkach11. Metoda ta ulepsza obrazowanie przepływu F-aktyny z ograniczoną dyfrakcją za pomocą analizy STICS12 i będzie odpowiednia dla badaczy, którzy chcą określić dwuwymiarowy przepływ molekularny w żywych komórkach na podstawie danych uzyskanych w rozdzielczościach przestrzennych wykraczających poza granicę dyfrakcji światła.

<table><tbody><tr><td>< mocne> materiały eksploatacyjne: </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Jurkat E6.1 ogniwa</td><td>APCC</td><td>ATTC TIB-152</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Strepromycyna&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>&nbsp; Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 8-dołkowe szkiełka nakrywkowe Labtek</td><td>NUNC, Labtek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>LifeAct GFP konstrukt</td><td>Ibidi</td><td>60101</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Life Technologies</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD28</td><td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr>Olej <td></td><td></td><td></td>do<td>soczewek</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulsar Xcell System</td><td>Kuweta BioRad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td>Wirówka <td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>(5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5805 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (Heraeus)</td><td>Biofuge pico</td><td>75003235</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stopniowy</td><td>Tokai Hit</td><td>INUH-TIZSH</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon N-SIM</td><td>Nikon</td><td>Skontaktuj się z firmą</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Oprogramowanie analityczne</td><td>Firma Nikon</td><td>Kontakt</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ( 190D)</td><td>LEEC</td><td>Skontaktuj się z firmą</td><td></td></tr></tbody></table>

korowy przepływ aktyny w limfocytach t określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Aktyna nitkowata odgrywa kluczową rolę w większości procesów komórkowych, w tym w ruchliwości i, w komórkach odpornościowych, w tworzeniu kluczowej interakcji komórka-komórka, znanej jako synapsa immunologiczna. Spekuluje się również, że F-aktyna odgrywa rolę w regulacji dystrybucji molekularnej na błonie komórek, w tym dynamiki pęcherzyków podbłoniastych i grupowania białek. Podczas gdy standardowe techniki mikroskopu świetlnego pozwalają na prowadzenie uogólnionych i ograniczonych dyfrakcyjnie obserwacji, wiele zdarzeń komórkowych i molekularnych, w tym grupowanie i przepływ molekularny, występuje w populacjach w skalach długości znacznie poniżej zdolności rozdzielczej standardowej mikroskopii świetlnej. Łącząc fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia z metodą obrazowania o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii oświetlenia strukturalnego, zarejestrowano dwuwymiarowy przepływ molekularny F-aktyny w synapsie immunologicznej limfocytów T. Następnie zastosowano spektroskopię korelacji obrazu czasoprzestrzennego (STICS), która pozwala na uzyskanie wymiernych wyników w postaci histogramów prędkości i map wektorowych reprezentujących kierunkowość i wielkość przepływu. Protokół ten opisuje połączenie obrazowania w superrozdzielczości i technik STICS w celu generowania wektorów przepływu na poziomie szczegółowości subdyfrakcyjnym. Technika ta została wykorzystana do potwierdzenia przepływu aktyny, który jest symetrycznie wsteczny i dośrodkowy na obrzeżach limfocytów T po utworzeniu synaps.

Ustawienia mikroskopu
Po pomyślnym wykonaniu wszystkich etapów badacz uzyska obrazy z wykorzystaniem mikroskopii z oświetleniem strukturalnym (SIM) obrazujące przepływ F-aktyny w synapsie limfocytów T (Wideo 1) oraz dokona ilościowej analizy tego przepływu molekularnego za pomocą czasowo-przestrzennej spektroskopii korelacyjnej obrazów (Rycina 411). Przed rejestracją obrazów należy upewnić się, że ośw...

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ilościowe określenie dynamiki aktyny korowej za pomocą spektroskopii korelacyjnej obrazów po akwizycji obrazu techniką całkowitego wewnętrznego odbicia, obrazowania z iluminacją strukturalną lub turf sim. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki, takie jak rola przepływu aktyny korowej w regulacji oddziaływań w synapsie immunologicznej. Główną zaletą tej techniki jest połączenie rozdzielczości w skali nanometrów z kompatybilnością z warunkami życiowymi, co pozwala na obserwację i analizę procesów w mniejszej skali w porównaniu do konwencjonalnych technik mikroskopii fluorescencyjnej.Technikę tę zademonstruje George Ashdown, doktorant z mojego laboratorium. W ramach próbki testowej nanieś pięć mikrolitrów roztworu stokowego fluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 100 nanometrów, znajdujących się poniżej granicy dyfrakcyjnej, na powierzchnię świeżego, niepowlekanego szkiełka podstawowego. Następnie rozprowadź roztwór mikrosfer po szkiełku za pomocą końcówki pipety i pozostaw do wyschnięcia.Nanieś 200 µL medium montażowego na szkiełko nakrywki z próbką w celu przygotowania do obrazowania. Włącz inkubator dla

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę ilościowego określania przepływu korowej aktyny w limfocytach T za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów. Technika łączy nanometrową rozdzielczość z obrazowaniem komórek żywych.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego (Wideo) | JoVE Journal

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Przeglądaj więcej filmów