Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla komórek progenitorowych oligodendrocytów szczura oraz ilościowe określenie oligodendrogenezy w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne. Skuteczna oligodendrogeneza jest celem terapeutycznym w wielu obszarach badań, w tym w urazach rdzenia kręgowego, niedotlenieniu noworodków i chorobach demielinizacyjnych, takich jak poprzeczne zapalenie rdzenia kręgowego i stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona protokół izolacji dużej liczby OPC z szybką i niezawodną metodą określania oligodendrogenezy w wielu warunkach eksperymentalnych jednocześnie.

Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj cały sprzęt do preparowania za pomocą podgrzewanego sterylizatora kulek. Następnie dodaj 15 do 20 mililitrów PBS do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Umieść stożkową rurkę na lodzie i użyj jej do przytrzymania pokrojonej w kostkę tkanki kory podczas sekcji.

Następnie dodaj zimny PBS do 10-centymetrowej szalki Petriego, która zostanie użyta do rozbioru pod mikroskopem świetlnym. Po złożeniu w ofierze szczeniąt szczura odetnij skórę za uszami wzdłuż linii środkowej za pomocą małych nożyczek. I oderwij płaty skóry z powrotem.

Następnie przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej od pnia mózgu do oczu. I uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, aby zachować strukturę leżącej pod spodem kory. Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia poniżej móżdżku, wkładając małe nożyczki chirurgiczne do otworu wielkiego.

Wykonaj dodatkowe nacięcie między oczami przed opuszkami węchowymi. Ostrożnie oderwij każdą połówkę czaszki z powrotem. Usuń cały mózg i umieść go na 10-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS.

Pod mikroskopem mikroskopowym rentgenowskim usuń opuszki węchowe i móżdżek za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych. Odwróć mózg tak, aby widoczna była powierzchnia brzuszna. Następnie, używając cienkich, prostych kleszczy, wykonaj rozwarstwienie, umieszczając zamknięte końcówki kleszczy między korą a podwzgórzem na głębokość około dwóch trzecich mózgu.

Otwórz kleszcze, gdy znajdą się na miejscu, a następnie powtórz procedurę dla drugiej półkuli. Następnie drażnij korę z okolic podwzgórza i śródmózgowia. Usuń podwzgórze, wzgórze i śródmózgowie, przytrzymując śródmózgowie na jego tylnej powierzchni i złuszczając je w kierunku przedniego końca mózgu.

Następnie przeciąć połączenia przednie. Za pomocą drobno zgiętych kleszczy preparacyjnych usuń hipokamp i przerwij jego połączenie z korą. Następnie usuń pozostałe prążkowie, zeskrobując je z leżącej poniżej kory ruchem ukośnym na zewnątrz.

Oczyść naczynia krwionośne i opony mózgowe z brzusznej powierzchni kory. Następnie odwróć mózg tak, aby widoczna była powierzchnia grzbietowa. Oderwij opony mózgowe od leżącej poniżej kory, w której znajduje się opuszka węchowa.

Powtórz procedury, aby uzyskać w sumie od trzech do czterech szczeniąt szczurów. I umieść wszystkie wypreparowane korowe na szalce Petriego. Posiekaj je wysterylizowaną żyletką, aż uzyskasz kawałki o wymiarach jeden milimetr na jeden milimetr.

Następnie zbierz tkanki, spłukując naczynie PBS przed ponownym umieszczeniem go na lodzie. Teraz, używając szklanej pipety Pasteura podłączonej do kontrolera pipety, mechanicznie rozdziel tkankę, pipetując dziesięć do piętnastu razy lub do momentu, gdy kawałki tkanki zmniejszą się, a roztwór stanie się mętny. Następnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut z ciągłą rotacją.

Następnie dodaj 10 mililitrów PBS do każdej próbki i przefiltruj homogenat przez 40-mikrometrowy filtr porowy umieszczony na 50-mililitrowej probówce. Następnie przepłucz filtr dodatkowym litrem do dwóch mililitrów PBS. Zebrać wszystkie próbki homogenatu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i uzyskać ogólną liczbę komórek.

Po zliczeniu komórek równomiernie rozłóż homogenat na stożkowe probówki o pojemności 15 mililetów i odwiruj je przez 10 do 12 minut w temperaturze 300 g. Zalej każdą kolumnę LS, dodając pięć mililitrów bufora kolumny. I zbierz przepływ przez 15-mililitrową stożkową rurkę.

Gdy bufor kolumny całkowicie przejdzie przez górną komorę, nałóż 1000 mikrolitrów zawiesiny komórek na każdą kolumnę i pozwól komórkom przejść grawitacyjnie. Następnie wyjmij każdą kolumnę i umieść ją w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Dodaj pięć mililitrów buforu kolumny i zanurz bufor w kolumnie z dużą prędkością, aby usunąć związane komórki i uwolnić je z kolumny.

Aby pokryć komórki, rozcieńcz je pożywką proliferacyjną OPC do 60 000 komórek na mililitr. Odpipetować 500 mikrolitrów komórek wzdłuż boku każdej czarnej, przezroczystej dolnej studzienki 24-dołkowej. Wymieszaj komórki, potrząsając płytką poziomo, wykonując ruch ósemki.

W tej procedurze umieść końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na szklanej pipecie Pasteura, aby upewnić się, że studzienka nie zostanie uszkodzona podczas aspiracji. Następnie odsysaj pożywkę z dołków hodowlanych po jednej grupie poddawanej działaniu substancji, aby uniknąć wysuszenia komórek. Następnie powoli dodaj 500 mikrolitrów głównej mieszanki zabiegowej wzdłuż boku studzienki za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.

Inkubuj kultury i przeprowadzaj pełną wymianę pożywki ze świeżymi pożywkami do zabiegu co dwa do trzech dni. Pod koniec pożądanego okresu leczenia odessać pożywkę. Powoli dodaj 400 mikrolitrów PFA z boku studzienki, aby utrwalić komórki.

I inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach odessać PFA i powoli dodawać 500 mikrolitrów sterylnego D-PBS, aby umyć komórki. Powtórz pranie jeszcze dwa razy i nie zasysaj końcowego prania.

Teraz doprowadź płytkę do temperatury pokojowej, odessaj studzienki i dodaj 250 mikrolitrów D-PBS zawierających pięć procent NGS i 0,1 procent Triton x-100. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z delikatnym wytrząsaniem orbitalnym. Przygotować podstawowy roztwór do inkubacji, rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne anty MBP i królicze poliklonalne przeciwciało anty olig2 w D-PBS zawierającym pięć procent NGS.

Następnie inkubuj przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przez 16 do 18 godzin z delikatnym wstrząsaniem orbitalnym. Myjąc płytkę, należy przygotować wtórny roztwór inkubacyjny, rozcieńczając przeciwciała anty mysie 680 i anty królicze 800 w D-PBS zawierającym pięć procent NGS. Następnie odessać końcowe płukanie i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu inkubacyjnego.

Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez godzinę z delikatnym potrząsaniem orbitalnym. Następnie zeskanuj płytkę za pomocą systemu obrazowania zdolnego do wykrywania emisji fluorescencji o długości 700 nanometrów i 800 nanometrów. Jako punkt wyjścia ustaw przesunięcie ogniskowej na trzy, a czułość na jeden punkt pięć dla MBP, pięć punktów zero dla aktyny i trzy punkty pięć dla olig2.

Dostosuj wartości czułości zgodnie z potrzebami, aby uniknąć prześwietlenia sygnału. Na tym schemacie test DIFS rozpoczyna się od świeżo wyizolowanych szczurzych OPC z dodatnim wynikiem A2B5 posianych na naczyniach hodowlanych oznaczonych PLL. Kultury te rozmnaża się przez trzy dni w obecności 20 nanogramów na mililitr PDGFAA, a następnie poddaje się działaniu czynników eksperymentalnych w świeżych pożywkach wolnych od PDGF w dniu zero.

Pożywka zabiegowa jest w pełni uzupełniana drugiego dnia. Komórki są utrwalane 4-procentowym paraformaldehydem czwartego dnia. W tym przypadku immunocytochemię dla olig2 i MBP przeprowadzono na reprezentatywnych kulturach w dniu zero i czwartym dniu przy użyciu Dapi jako jądrowego barwnika przeciwjądrowego.

Kultury te wykazują konstytutywne barwienie dla markera komórkowego linii oligodendrocytów, Olig2, w dniach zero i cztery. Natomiast barwienie dojrzałego markera oligodendrocytów MBP było widoczne dopiero w czwartym dniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać, hodować i różnicować A2B5-dodatnie szczurze OPC w celu ilościowego określenia wpływu czynników eksperymentalnych na oligodendrogenezę.

Identyfikacja czynników sprzyjających oligodenrogenezie ma szczególne znaczenie dla badań nad chorobami demielinizacyjnymi, takimi jak stwardnienie rozsiane. Opisane tutaj techniki mogą pomóc w zidentyfikowaniu takich czynników i ostatecznie w opracowaniu lepszych metod terapeutycznych.