Name: Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Naucz się izolować i hodować progenitorowe komórki oligodendrocytów szczurów oraz kwantyfikować oligodendrogenezę za pomocą skanowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia badanie czynników wpływających na tworzenie się mieliny w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sponsor grantu: National Institutes of Health; Numer grantu: R37 NS041435.

<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje szybką i niezawodną metodę izolowania OPC u szczurów i ilościowego określania oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne. Stosując selekcję pozytywną, wysokie plony żywotnych i czystych OPC są wykorzystywane bezpośrednio do celów eksperymentalnych. Metoda ta usprawnia etapy izolacji, hodowli i różnicowania w ciągu 1 tygodnia, a utrwalone komórki można wygodnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez utraty czułości testu.
<p class...

Efektywne przewodnictwo nerwowe w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) u ssaków wymaga mielinizacji aksonów przez oligodendrocyty. Podczas rozwoju oligodendrocyty powstają z puli komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC), które, jak się uważa, migrują ze stref komorowych rozwijającego się przodomózgowia i cewy nerwowej1. Po migracji OPC różnicują się w dojrzałe, mielinizujące oligodendrocyty, które nie tylko ułatwiają efektywną propagację impulsów, ale także zapewniają aksonom wsparcie troficzne2. Dorosły OUN utrzymuje obfitą populację OPC, które są rozproszone w istocie szarej i białej, stanowiąc około 5-8% wszystkich komórek3. Po zniewadze demielinizacyjnej OPC migrują do miejsca urazu, namnażają się i różnicują, zastępując utracone lub uszkodzone osłonki mielinowe na odsłoniętych aksonach. Jednak w niektórych warunkach choroby/urazu proces ten okazuje się nieefektywny lub może całkowicie zakończyć się niepowodzeniem4. Podczas gdy uważa się, że przewlekła demieninizacja zwiększa obciążenie chorobą, skuteczna oligodendrogeneza i remielinizacja mogą złagodzić objawy5. W związku z tym interesujące było badanie OPC in vitro w celu określenia wpływu czynników eksperymentalnych na oligodendrogenezę.
Wgląd w różne fazy różnicowania oligodendrocytów stał się możliwy dzięki identyfikacji markerów komórkowych specyficznych dla danego etapu. Samoodnawiające się wczesne komórki progenitorowe są definiowane przez ekspresję receptora alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα), antygenu nerwowego/glejowego 2 (NG2) i A2B5 6-8. Gdy OPC inicjują swój program różnicowania i wycofują się z cyklu komórkowego, regulują ekspresję tych markerów i zaczynają wyrażać białka wskazujące na premielinizujące oligodendrocyty, w tym 3'-fosfodiesterazy cyklicznego nukleotydu (CNPaza) i O4. Wreszcie, ich różnicowanie w bardziej dojrzałe oligodendrocyty charakteryzuje się ekspresją białek związanych z mieliną, w tym glikoproteiny związanej z mieliną (MAG), białka proteolipidowego (PLP) i zasadowego białka mieliny (MBP). MBP jest wewnątrzkomórkowym białkiem błony obwodowej i głównym składnikiem osłonki mielinowej. Myszy pozbawione MBP rozwijają ciężki fenotyp, w którym mielinizacja OUN jest znacznie zmniejszona, co prowadzi do drżenia, drgawek i wczesnej śmierci9,10. Ta ważna rola MBP w mielinizacji doprowadziła do jego wykorzystania jako markera różnicowania oligodendrocytów zarówno in vitro, jak i in vivo11.
Kwantyfikacja MBP może być osiągnięta przy użyciu kilku różnych metodologii. Analiza RT-PCR i Western blot pozwala na ilościowe określenie poziomów MBP przy różnych schematach leczenia. Immunocytochemia jest powszechnym podejściem jakościowym, które może być również ilościowe, gdy stosowane są podejścia mikroskopowe oparte na kamerach. Chociaż systemy te są wiarygodne i mają fundamentalne znaczenie dla badania różnicowania oligodendrocytów, każdy z nich ma swoje wady, które ograniczają ich stosowanie w badaniach przesiewowych leków. Po pierwsze, ilość pierwotnych OPC, które są potrzebne do analizy RT-PCR i Western blot, zmniejsza liczbę zmiennych, które mogą być badane jednocześnie. Chociaż zapotrzebowanie komórek na immunocytochemię jest znacznie niższe, jeśli celem jest kwantyfikacja, należy poświęcić dużo czasu na każdy eksperyment. Konieczne jest wykonanie wielu obrazów, a następnie ich ilościowe określenie, aby ułatwić analizę eksperymentalną. Zastrzeżenia te stają się ważnymi przeszkodami, które należy wziąć pod uwagę w przypadku badań, które wymagają oceny o wysokiej przepustowości. W tym miejscu opisujemy metodę, która wykorzystuje podstawowe aspekty zarówno immunocytochemii, jak i metodologii Western blot do ilościowego oznaczania mieliny, jednocześnie znacznie zmniejszając zarówno liczbę wymaganych komórek, jak i czas do zakończenia analizy ilościowej.

<table><tbody><tr><td>Materiały preparacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Polistyrenowe szalki Petriego</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>Lekki mikroskop preparacyjny</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Disocjacja Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td> Zestaw do dysocjacji <td>rurki dysocjacyjnej</td></tr> Zestaw do <tr><td>dysocjacji tkanek nerwowych (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Zestaw do dysocjacji enzymatycznej</td></tr><tr><td>PBS z Ca2+ i Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 Oczyszczanie kolumny&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-A2B5 Mikrogranulki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td> Kolumny LS <td>z przeciwciałem A2B5 wiązane przez koraliki</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Magnetyczne kolumny selekcyjne</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS z Ca2+ i Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0,50%</td></tr><tr><td>Materiały hodowlane</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Trijodotyronina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Sól fumaranu klemastyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Sól hemifumaranu kwetiapiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Pierwiastki śladowe B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Technologie Życia</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Technologie Życia</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka wizycyjna z pokrywką</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Klasa hodowli tkankowej</td></tr><tr><td><silna>Immunocytochemia i oznaczanie ilościowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5 proc.</td></tr><tr><td>mysz monoklonalna anty-MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>poliklonalnego królika anty-aktyny</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>królika poliklonalnego anty-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>kozła anty-myszy 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>kozioł anty-królik 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie anty-mysie</td><td>technologie Life</td><td>A11032</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie anty-króliki</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Prolong Gold anti-fade z DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z Ca2+ i Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania na podczerwień Licor Odyssey Clx Licor</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Skuteczna oligodendrogeneza jest celem terapeutycznym wielu obszarów badań, w tym urazów rdzenia kręgowego, niedotlenienia noworodków i chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i poprzeczne zapalenie rdzenia kręgowego. Mielinizacja jest wymagana, aby nie tylko ułatwić szybką propagację impulsów w ośrodkowym układzie nerwowym, ale także zapewnić wsparcie troficzne dla leżących poniżej aksonów. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) można badać in vitro, aby pomóc w identyfikacji czynników, które mogą promować lub hamować różnicowanie oligodendrocytów. Do tej pory wiele dostępnych metod oceny tego procesu wymagało albo dużej liczby komórek, co ograniczało liczbę warunków, które można badać w dowolnym momencie, albo pracochłonnych metod kwantyfikacji. W niniejszym artykule opisano protokół izolacji dużej liczby wysoce czystych OPC wraz z szybką i niezawodną metodą określania oligodendrogenezy z wielu warunków jednocześnie. OPC są izolowane z kory noworodków szczurów P5-P7 i hodowane in vitro przez trzy dni przed różnicowaniem. Cztery dni po różnicowaniu oligodendrogenezę ocenia się za pomocą testu skanowania fluorescencji w podwójnej podczerwieni w celu określenia ekspresji białka mieliny.

OPC dodatnie pod kątem A2B5 są izolowane poprzez pozytywną selekcję komórek przy użyciu systemu separacji kolumnowej z magnesami. Przed procedurą izolacji cały mózg zostaje usunięty z młodych szczurów w wieku od P5 do P7. Po pomyślnym oddzieleniu całego mózgu od czaszki, cebulki węchowe oraz móżdżek są usuwane za pomocą precyzyjnych pęset chirurgicznych (Ryc. 1A). W celu wyizolowania tkanki kory mózgowej, podwzgórze, wzgórze oraz śródmózgie są wycinane poprzez ostrożną dy...

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla komórek progenitorowych oligodendrocytów szczura oraz ilościowe określenie oligodendrogenezy w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne. Efektywna oligodendrogeneza jest celem terapeutycznym w wielu obszarach badawczich, w tym w przypadku urazów rdzenia kręgowego, niedotlenienia noworodków oraz chorób demielinizacyjnych, takich jak poprzeczne zapalenie rdzenia i stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest połączenie protokołu izolacji dużych liczb OPC z szybką i niezawodną metodą określania oligodendrogenezy w wielu warunkach eksperymentalnych jednocześnie.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wysterylizować cały sprzęt do sekcji za pomocą sterylizatora koralikowego. Następnie do probówki stożkowej o pojemności 50 ml należy dodać od 15 do 20 ml PBS. Probówkę stożkową należy umieścić w lodzie i wykorzystać ją do przechowywania pociętej tkanki kory podczas sekcji.Następnie do szalki Petriego o średnicy 10 cm wlej zimny PBS, która posłuży do przeprowadzenia sekcji pod mikroskopem świetlnym. Po uśmierceniu młodych szczurów, za pomocą małych nożyczek przetnij skórę za uszami wzdłuż linii środkowej, a następnie odchyl płaty skóry.Następnie należy przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, od pnia mózgu do oczu. Należy uważać, aby nie przeciąć tkanek zbyt głęboko, w celu zachowania struktury leżącej pod nimi kory mózgowej. Po tym etapie należy wykonać dwa cięcia boczne poniżej móżdżku, wprowadzając małe nożyczki chirurgiczne do otworu wielkiego.Wykonaj dodatkowe cięcie między oczami, przed opuszkami węchowymi. Ostrożnie odchyl każdą połowę czaszki. Wyjmij cały mózg i umieść go w 10 centymetrowej płytce Petriego wypełnionej zimnym PBS.Pod stereomikroskopem chirurgicznym usuń cebulki węchowe i móżdżek za pomocą precyzyjnych pincet chirurgicznych. Odwróć mózg tak, aby widoczna była powierzchnia brzuszna. Następnie, używając precyzyjnej pęsety prostej, wykonaj tępe rozcięcie, wprowadzając zamknięte końce pęsety pomiędzy korę a podwzgórze na głębokość około dwóch trzecich mózgu.Rozewrzyj pęsetę, gdy znajdzie się ona na miejscu, a następnie powtórz procedurę dla drugiej półkuli. Po tym odseparuj korę od obszarów podwzgórza i śródmózwia. Usuń podwzgórze, wzgórze i śródmózwie, chwytając śródmózwie za jego powierzchnię tylną i odrywając je w kierunku przedniej części mózgu.Następnie przetnij połączenia przednie. Używając cienkich, zakrzywionych pęsety anatomicznej, usuń hipokamp i przetnij jego połączenie z korą. Następnie usuń pozostałe prążkowie, zeskrobując je z leżącej pod nim kory ruchem diagonalnym na zewnątrz.Usuń naczynia krwionośne i opony z brzusznej powierzchni kory. Następnie odwróć mózg tak, aby widoczna była powierzchnia grzbietowa. Oddziel opony od leżącej pod nimi kory w miejscu położenia opłaty węchowej.Powtórz procedury dla łącznie trzech do czterech młodych szczurów. Wszystkie wypreparowane kory mózgowe umieść w czarni pety’ego. Posiekaj je za pomocą wysterylizowanego ostrza żyletek, aż do uzyskania fragmentów o wymiarach 1 mm na 1 mm.Następnie zbierz tkanki, płukąc naczynie PBS, a potem ponownie umieść je na lodzie. Teraz, używając szklanej pipety Pasteura podłączonej do kontrolera pipetującego, mechanicznie rozdziel tkankę poprzez pipetowanie od dziesięciu do piętnastu razy lub do momentu, aż fragmenty tkanki zmniejszą swoją wielkość, a roztwór stanie się mętny. Następnie przenieś próbkę z powrotem do inkubatora do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C na 15 minut przy ciągłym obrotach.Następnie do każdej próbki dodaj 10 ml PBS i przefiltruj homogenat przez filtr o rozmiarze porów 40 µm umieszczony nad probówką o pojemności 50 ml. Potem przepłucz filtr dodatkowymi 1–2 ml PBS. Połącz wszystkie próbki homogenatu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i określ całkowitą liczbę komórek.Po wykonaniu zliczenia komórek, podziel homogenat równomiernie do probówek stożkowych o pojemności 15 ml i odwiruj je przez 10 do 12 minut przy 300 gs. Przygotuj każdą kolumnę LS, dodając pięć mililitrów buforu kolumnowego. Przesącz zbierz do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Gdy bufor kolumnowy całkowicie przepłynie przez górną komorę, nanieś 1000 µL zawiesiny komórek na każdą kolumnę i pozwól komórkom przepłynąć pod wpływem grawitacji. Następnie wyjmij każdą kolumnę i umieść ją w 15 ml probówce stożkowej. Dodaj 5 ml buforu kolumnowego i szybko przepłucz bufor przez kolumnę, aby oderwać związane komórki i uwolnić je z kolumny.Aby wysiać komórki, należy rozcieńczyć je w pożywce do proliferacji OPC do stężenia 60 000 komórek na mililitr. Do każdej czarnej studni z przezroczystym dnem płytki 24-dołkowej nanieś pipetą 500 µL zawiesiny komórek wzdłuż ścianki. Wymieszaj komórki, potrząsając płytką w poziomie, wykonując ruch w kształcie ósemki.W tej procedurze należy umieścić końcówkę pipety 200 µL nad szklaną pipetą Pasteura, aby upewnić się, że studzienka nie zostanie uszkodzona podczas aspiracji. Następnie należy aspirować pożywkę ze studzienek hodowlanych, przetwarzając jedną grupę badawczą po drugiej, aby zapobiec wysychaniu komórek. Po tym kroku należy powoli dodać 500 µL master mixu z traktowaniem wzdłuż ścianki studzienki, używając pipety 1 mL.Inkubować hodowle i przeprowadzać pełną wymianę pożywki na świeżą pożywkę z substancją testowaną co dwa do trzech dni. Po zakończeniu pożądanego okresu traktowania odessać pożywkę. Powoli dodać 400 µL PFA do ścianki studzienki, aby utrwalić komórki.Następnie inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach odessij PFA i powoli dodaj 500 µL sterylnego D-PBS, aby wypłukać komórki. Powtórz płukanie jeszcze dwukrotnie i nie odsysaj ostatniej porcji płuczki.Następnie doprowadź płytkę do temperatury pokojowej, odessij zawartość studni i dodaj 250 µL D-PBS zawierającego 5% NGS i 0,1% Triton x-100. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy łagodnym wstrząsaniu orbitalnym. Przygotuj roztwór do inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi, rozcieńczając mysie monoklonalne przeciwciało anty-MBP oraz królicze poliklonalne przeciwciało anty-olig2 w D-PBS zawierającym 5% NGS.Następnie inkubować przeciwciała pierwotne w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, od 16 do 18 godzin, przy delikatnym wstrząsaniu orbitalnym. Podczas płukania płytki przygotować roztwór do inkubacji wtórnej, rozcieńczając przeciwciała anti mouse 680 oraz anti rabbit 800 w D-PBS zawierającym pięć procent NGS. Następnie odessać ostatni roztwór płuczący i dodać 250 µL roztworu do inkubacji wtórnej.Osłoń płytkę przed światłem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy łagodnym wstrząsaniu orbitalnym. Następnie zeskanuj płytkę za pomocą systemu obrazowania zdolnego do detekcji emisji fluorescencji o długości 700 nanometrów i 800 nanometrów. Jako wartość początkową ustaw przesunięcie ogniskowe (focal offset) na 3 oraz czułość na 1,5 dla MBP, 5,0 dla aktyny i 3,5 dla olig2.Dostosuj wartości czułości w razie potrzeby, aby uniknąć prześwietlenia sygnału. Na tym schemacie test DIFS rozpoczyna się od świeżo wyizolowanych, A2B5-dodatnich rat szczura OPC wysianych na naczynia hodowlane pokryte PLL. Hodowle te są namnażane przez trzy dni w obecności 20 nanogramów per milliliter PDGFAA, a następnie w dniu zerowym poddane działaniu czynników eksperymentalnych w świeżym medium wolnym od PDGF.Pożywka do hodowli jest w pełni wymieniana w drugim dniu. Komórki są utrwalane 4% paraformaldehydem w czwartym dniu. Tutaj przeprowadzono immunocytochemię dla olig2 i MBP na reprezentatywnych kulturach w dniu zerowym i czwartym, wykorzystując Dapi jako barwnik przeciwjądrowy.Hodowle te wykazują konstytutywne barwienie dla markera wszystkich komórek linii oligodendrocytycznej, Olig2, w dniu zerowym i czwartym. Natomiast barwienie dla markera dojrzałych oligodendrocytów MBP było widoczne dopiero w czwartym dniu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak oczyszczać, hodować i różnicować szczurze OPC dodatnie dla A2B5 w celu ilościowego określenia wpływu czynników eksperymentalnych na oligodendrogenezę.Identyfikacja czynników sprzyjających oligodendrogenezie ma szczególne znaczenie dla badania chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Opanowanie opisanych tutaj technik może pomóc w identyfikacji takich czynników, a w konsekwencji w opracowaniu lepszych metod terapeutycznych.

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film pokazuje procedurę izolacji neuronów zwojowych siatkówki (RGN) z siatkówki szczura i kohodowli ich z komórkami glejowymi otoczki węchowej (OEG). Metoda ta pozwala na badanie potencjału neuroregeneracyjnego OEG po uszkodzeniu neuronalnym.

Hodowla neuronów zwojowych siatkówki z glejem osłonki węchowej

Film demonstruje protokół różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) na oligodendrocyty i indukowania mielinizacji w kokulturze z neuronami zwoju korzenia grzbietowego (DRG). OPC są transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych kodujących białko sygnałowe, które reguluje mielinizację. Transdukowane OPC są hodowane wspólnie z neuronami DRG w celu oceny różnicowania w oligodendrocyty i mielinizacji indukowanej białkiem sygnałowym.

Test mielinizacji indukowanej transdukcją in vitro dla komórek prekursorowych oligodendrocytów

Źródło: Schott, J. T., et al. Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni. J. Vis. Exp. (2016).  Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania podwójnej fluorescencji do oceny różnicowania oligodendrocytów od komórek prekursorowych (OPC) wyizolowanych z mózgu młodego szczura. Proces ten obejmuje utrwalanie komórek, znakowanie określonych markerów pierwszorzędowymi i sprzężonymi...

Obrazowanie podwójnej fluorescencji w celu identyfikacji zróżnicowanych oligodendrocytów

Źródło: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem osłonki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020). Ten film przedstawia obrazowanie i kwantyfikację regeneracji aksonów w aksotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura (RGN) współhodowanych z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami glejowymi otaczającymi węch. RGN są znakowane immunologicznie, z czerwonymi somi i zielonymi aksonami. Obrazy...

Obrazowanie i kwantyfikacja regeneracji aksonów w akskotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Naucz się izolować i hodować progenitorowe komórki oligodendrocytów szczurów oraz kwantyfikować oligodendrogenezę za pomocą skanowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia badanie czynników wpływających na tworzenie się mieliny w układzie nerwowym.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów