Name: Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Naucz się projektować i pakować wirusy CRISPR do edycji genów w mózgu myszy metodą iniekcji stereotaktycznej. Ta technika umożliwia badanie funkcji genów w zaburzeniach neurologicznych bez konieczności tworzenia transgenicznych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R01MH097949 grantu NINH oraz Autism Speaks Pilot Grant 7359 dla BWL oraz Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Shared Instrumentation Grant P30CA023108.

<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077(2011).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method">http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method</a> (2015).</li>
<li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka krytycznych kroków, które są ważne dla udanego pakowania wirusa. Zdrowie komórek ma kluczowe znaczenie przed i podczas transfekcji, ponieważ niezdrowe komórki znacznie zmniejszą ilość produkowanego wirusa. Jeśli transfekcja i pakowanie zakończą się sukcesem, wówczas 100% komórek powinno wyrażać fluorofor, a komórki powinny utworzyć funkcjonalne syncytium. W kroku 3.2.4 stukanie w probówkę jest konieczne do efektywnej transfekcji o wysokim mianie, a pH soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES musi być dokładne. Maxi-prepy, które wytwarzają plazmidy niezbędne do pakowania wirusa, muszą być niezwykle czyste. Do tego momentu pomocne jest wytrącenie etanolu końcowej elucji DNA i ponowne zawieszenie w buforze Tris-EDTA. Bardzo ważne jest również zmniejszenie ilości surowicy do 2% lub mniej w pożywce, do której dodaje się kofeinę w dniu 6 (krok 3.4) przed pobraniem wirusa. Jeśli surowica nie zostanie zmniejszona, wówczas końcowy oczyszczony wirus będzie zawierał niepożądaną ilość białka surowicy. Zastosowanie glikolu polietylenowego 6000 do wytrącania cząstek wirusa wyklucza konieczność ultrawirowania. Ważne jest również, aby pamiętać, że wirusy zawierające Cas9 CRISPR mają zazwyczaj miano około 10 razy mniejsze niż wirusy zawierające wyłącznie fluorofor.
W przypadku chirurgii stereotaktycznej zastosowanie znieczulenia wziewnego umożliwia szybką i precyzyjną kontrolę świadomości zwierzęcia w porównaniu ze środkami znieczulającymi do wstrzykiwań i umożliwia znieczulenie w większym przedziale wiekowym. Bardzo ważne jest, aby narzędzia chirurgiczne były czyste i sterylne, a powtarzalne celowanie wymaga precyzyjnego ustawienia głowy. Upewnij się, że w instrumencie stereotaktycznym nie ma kołysania ani przewracania głowy i że czaszka jest mocno osadzona. Przydatne może być pozostawienie czaszki do wyschnięcia w celu znalezienia szwów w celu określenia współrzędnych stereotaktycznych. Ponadto szybkość i objętość dla każdej współrzędnej stereotaktycznej powinny być określone empirycznie.
Technika ta jest ograniczona, ponieważ rozprzestrzenianie się lenti- lub retrowirusa jest ograniczone, zwłaszcza w porównaniu z wirusami związanymi z adenowirusami (AAV). Dlatego wirusy te są cenne, gdy infekują dyskretny region mózgu, ale nie dla ogólnej infekcji związanej z AAV używanymi do analizy behawioralnej u zwierząt. Zastosowanie kofeiny w tym protokole znacznie zwiększa miano tych wirusów, ale nadal nie jest ono tak wysokie, jak miana osiągane w opakowaniach AAV. Ponadto, stabilna integracja jest tylko zaletą ekspresji fluoroforu, ponieważ CRISPR/Cas9 tworzy stabilne edycje genomu nawet w przypadku przejściowej transfekcji i możliwe jest, że trwająca ekspresja Cas9 i sgRNA może ostatecznie wywołać efekty poza celem. Przejściowa ekspresja systemu CRISPR/Cas9 z AAV jest wystarczająca do wytworzenia zmian genomowych, które są propagowane przez podziały komórkowe, jednak ekspresja fluoroforu nie zostanie utrzymana.
Stworzenie lenti- i retrowirusów wykorzystujących system CRISPR/Cas9 zapewni możliwość celowania w dowolny nowy gen w wielu różnych organizmach. Efektywność edycji genów wydaje się być zależna od sekwencji przewodnika RNA ukierunkowanego na rozszczepienie Cas9. Ustalono empirycznie, że od 10% do 80% klonów zawiera indele po sekwencjonowaniu zakażonych komórek Neuro2A. Obecnie nie wiadomo, czy częstości indel obliczone w komórkach Neuro2A odzwierciedlają te w neuronach. Oprogramowanie do projektowania RNA, takie jak Benchling, zawiera teraz wynik "na celu", który może być w stanie przewidzieć wydajność danej sekwencji docelowej. Do jakiego stopnia takie "celowe" wyniki są wiarygodne, musi zostać empirycznie określone w neuronach i innych typach komórek, w miarę jak system CRISPR-Cas9 będzie coraz powszechniej wdrażany.
Transgeniczna produkcja zwierzęca oparta na lentiwirusach odnosiła różne sukcesy, z doniesieniami, że transgeny dostarczane przez lentiwirusa zostają wyciszone11. Edycja genów DNA za pośrednictwem CRISPR może być przekazywana przez linię zarodkową w celu wygenerowania całych modeli zwierzęcych. W związku z tym stabilna edycja genomu może być osiągalna pomimo wyciszenia fluoroforów dostarczanych przez wirusa i transgenów Cas9. Może to stanowić skuteczną platformę dla ukierunkowanych zmian genomowych. Dostarczanie wirusa za pomocą systemu CRISPR/Cas9, choć nie wymaga organizmów transgenicznych, jest komplementarne z tymi technikami. Na przykład, wstrzyknięcie takich cząstek wirusa do transgenicznego zwierzęcia, które indukuje ekspresję Cre i zależnych od Cre transgenów opto- lub chemogenetycznych, powinno ułatwić złożone badania nad związkiem między manipulacjami genetycznymi a aktywnością neuronalną. Drugim przykładem jest dostarczenie tych cząstek wirusa Cas9 / sgRNA do warunkowego nokautu w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem interakcji gen-gen. Wreszcie, kolejnym ekscytującym kierunkiem tych badań jest badanie przesiewowe fenotypów i związków terapeutycznych w komórkach pochodzących od pacjentów, które można wykorzystać do walidacji i odkrycia sieci genetycznych, które są zakłócone w różnych chorobach.

Aby zbadać podstawy normalnej fizjologii i patologii chorób, istnieje potrzeba precyzyjnego manipulowania ekspresją genów w organizmach modelowych. W przypadku organizmów modelowych ssaków jest to w dużej mierze skoncentrowane na tworzeniu i rozwoju transgenicznych myszy, w których element genetyczny będący przedmiotem zainteresowania jest otoczony miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę. Może to prowadzić do specyficznej dla miejsca manipulacji tymi flankowanymi genami. Chociaż jest to skuteczna strategia, wymaga ona dużego czasu i zasobów; na przykład stworzenie potrójnego transgenicznego zwierzęcia, które wykazywałoby ekspresję genu floksowego, rekombinazy Cre i genu reporterowego Cre, wymaga wielu krzyżowań i walidacji. W przeciwieństwie do tego, stereotaktyczne wstrzyknięcie wadliwych cząstek wirusa kodujących białko fluorescencyjne i rekombinazę do zwierzęcia z floksowanym genem nie wymaga skomplikowanego genotypowania ani strategii hodowlanych1. Ponadto, jeśli białko fluorescencyjne i wirus wykazujący ekspresję Cre są wstrzykiwane jednocześnie z drugim wirusem kodującym inne białko fluorescencyjne, zapewnia to kontrolę wewnątrztkankową dla ukierunkowanej manipulacji genetycznej. Podczas gdy strategia ta nadal wymaga wykorzystania zwierząt typu knock-in, strategie oparte na RNA za pośrednictwem wirusa omijają potrzebę stosowania zwierząt transgenicznych. Na przykład stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusów z niedoborem replikacji, które kodują białko fluorescencyjne i krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), może wykorzystać endogenną maszynerię RNAi komórki, aby spowodować silną redukcję transkryptu genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak strategie shRNA powodują subtelne knock-downy genów, często skutkujące skromnymi fenotypami komórkowymi2. Podczas gdy knock-down może być bardziej fizjologicznie istotny dla dysfunkcji genów heterozygotycznych, jego zmniejszona odporność w porównaniu z knock-outem nie jest idealna dla fenotypowego odkrywania nowych genów.
Trzecia technika, która pojawiła się niedawno, system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 (białko związane z CRISPR 9), opiera się na ekspresji zarówno małego egzogennego RNA, jak i enzymu tnącego DNA. System CRISPR/Cas9 został zaadaptowany z prokariotycznego układu odpornościowego, który wyewoluował metodę identyfikacji obcego, inwazyjnego DNA wirusów i kierowania go do degradacji za pomocą enzymuCas9 3,4. Ta potężna technika edycji genomu może być używana do tworzenia ukierunkowanych delecji, insercji i mutacji; Poniższy protokół nakreśli, w jaki sposób dokonać delecji w genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby wyeliminować jego ekspresję in vivo. Enzym Cas9 musi być wyrażany za pomocą przewodnika RNA homologicznego do obszaru zainteresowania i przylegającego do rusztowania RNA. Nokaut genu przy użyciu tej techniki wymaga ukierunkowania Cas9 na określony region w genomie za pomocą syntetycznych przewodników RNA (sgRNA) i wywołania dwuniciowych pęknięć (DSB) w miejscu zainteresowania. Te DSB są następnie naprawiane przez endogenną maszynerię naprawy komórek poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), co prowadzi do indeli, które mogą powodować mutacje typu missense lub nonsense, a tym samym mogą powodować utratę funkcjonalnej ekspresji białka5. Ponieważ system ten wytwarza zmiany genomowe, wymaga jedynie przejściowej ekspresji Cas9 i sgRNA. Pożądane jest jednak, aby stabilny wskaźnik fluorescencyjny identyfikował komórki i ich potomstwo manipulowane w ten sposób.
Lenti- i retrowirusy mają tę zaletę, że stabilnie integrują interesujące nas DNA z komórkami gospodarza, które utrzymują długoterminową ekspresję i są przekazywane do komórek potomnych podczas mitozy. Protokół ten opisuje projektowanie i produkcję dwóch typów retrowirusów o wysokim mianie z wadliwymi replikacjami: cząstek lentiwirusowych pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (lentiwirus) oraz tych opartych na mysim wirusie białaczki Maloneya (retrowirus). Podczas gdy oba te wirusy są zdolne do stabilnej ekspresji dużych transgenów, cząstki retrowirusowe mogą integrować się z genomem tylko podczas podziału komórki z degradacją otoczki jądrowej, a zatem mogą być używane jako narzędzie do oznaczania i datowania urodzeń komórek6. Podczas gdy lentiwirusy mają reputację stosunkowo niskiego miana7, ta metodologia, obejmująca stosowanie kofeiny8 podczas zbierania wirusów, rutynowo generuje miana 10,9 i 1010 cząstek/ml. Kolejną zaletą lenti- i retrowirusów jest tolerancja na bardzo duże wstawki. Poniższy zbiór protokołów przedstawia procedurę projektowania lenti lub retrowirusa kodującego fluorescencyjny reporter, sgRNA i Cas9 w celu wykorzystania systemu CRISPR / Cas9 do modyfikacji DNA, a także ekspresji białka fluorescencyjnego.
Stereotaktyczna neurochirurgia myszy jest cenną metodą wstrzykiwania wirusów in vivo w celu badania morfologii, funkcji i połączeń zainfekowanych neuronów. Infekcja wirusowa w neuronach może być wykorzystywana do manipulowania poziomami ekspresji w dłuższym okresie czasu, na przykład podczas rozwoju, a ekspresja może być precyzyjnie kontrolowana za pomocą różnych systemów indukowanych lekiem i specyficznej ekspresji sterowanej przez Cre. Ten konkretny protokół wyjaśnia, jak wstrzyknąć wirusa z ekspresją sgRNA i Cas9 w celu wyeliminowania interesującego genu w mózgu dorosłej myszy. Myszy bardzo szybko wracają do zdrowia po tej procedurze, a ekspresję transgenu wirusa można zaobserwować w ciągu 48 godzin po wstrzyknięciu. Jednak wydaje się, że ekspresja fluoroforu wzrasta w ciągu kilku tygodni, co skutkuje prawie maksymalnym poziomem w ciągu 3 tygodni po zakażeniu. Myszy, które przechodzą wstrzyknięcie stereotaktyczne wirusa, mogą być wykorzystywane do badań behawioralnych, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, celem tych procedur jest pokazanie, jak znokautować gen w mózgu dorosłej myszy za pomocą chirurgii stereotaktycznej i wirusa wyrażającego specyficzne sgRNA i Cas9.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Lista odczynników do hodowli komórkowych</strong</td></tr><tr><td>>293FT linia komórkowa</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td> Dla linii komórkowej <td>Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP</td><td>Clontech</td><td>631458</td> Dla <td></td></tr><tr><td>modyfikacji DMEM (IMDM) Retrowirusa Iscove'a (IMDM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>Kompletny IMDM z 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln i&nbsp; 1% P/S</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pennicyliny/streptomycyny, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren 10&nbsp; cm talerz</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Lista odczynników do transfekcji</td></tr><tr><td>5&nbsp; ml rurki polistyrenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Przygotować 2,5 M roztwór w ddH2O</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES Sól fizjologiczna buforowana (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95&nbsp; g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (dokładnie!)</td></tr><tr><td>Kofeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; Filtr strzykawkowy M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0,45 &mikro; Filtr strzykawkowy M</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Strzykawka 60 ml L/L</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubka stożkowa</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>glikolu polietylenowego&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Milipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A 6-dołkowa</td><td></td></tr><tr><td>płytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Dawca Serum Końskiego</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP, królik, 488 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Stereotaktyczne odczynniki chirurgiczne</td></tr><tr><td>Vet-Strzykawka weterynaryjna tylko strzykawka T.B. 1 cc Luer slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS Ostrza skalpela</td><td></td></tr> ze stali nierdzewnej <tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>maść na sztuczne łzy</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Potrójna maść antybiotykowa&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; Igły Soft Pack 25 g x 5/8"</td> <td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 nici jedwabne</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych crispr retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Wadliwe lentiwirusy lub retrowirusy replikacji są zdolne do stabilnej integracji transgenów z genomem zainfekowanej komórki gospodarza. Technika ta jest szeroko stosowana do kodowania białek fluorescencyjnych, opto- lub chemogenetycznych kontrolerów aktywności komórek lub heterologicznej ekspresji ludzkich genów w organizmach modelowych. Wirusy te zostały również z powodzeniem wykorzystane do dostarczania rekombinaz do odpowiednich miejsc docelowych u zwierząt transgenicznych, a nawet do dostarczania małych spinek do włosów lub mikro RNA w celu manipulowania ekspresją genów. Chociaż techniki te okazały się owocne, opierają się na zwierzętach transgenicznych (rekombinazy) lub często brakuje im wysokiej skuteczności i swoistości (shRNA/miRNA). W przeciwieństwie do tego, system CRISPR/Cas wykorzystuje egzogenną nukleazę Cas, która celuje w określone miejsca w genomie organizmu za pośrednictwem egzogennego przewodnika RNA w celu wywołania dwuniciowych pęknięć w DNA. Pęknięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), powodując mutacje insercji i delecji (indel), które mogą skutkować szkodliwymi mutacjami typu missense lub nonsense. Manuskrypt ten zawiera szczegółowe metody projektowania, produkcji, wstrzykiwania i walidacji pojedynczych cząstek wirusa lenti/retro, które mogą stabilnie transdukować neurony w celu ekspresji fluorescencyjnego reportera, Cas9 i sgRNA w celu wyeliminowania genów w organizmie modelowym.

Zgodnie z „Protokołem projektowania nici przewodniej (sgRNA) dla retrowirusa CRISPR/Cas9”, oligonukleotydy nakierowane na konkretną sekwencję są wstawiane do wektora klonującego PXL poniżej promotora hU6 oraz poniżej rusztowania sgRNA, wykorzystując miejsca klonowania BbsI (Rysunek 1, krok 1). Następnie sgRNA jest wycinane z PXL i wstawiane do szkieletu pRubi przy użyciu miejsc BstBI i PacI (Rysunek 1, krok 2). W koniec, inna sgRNA sklonowana do PXL może zostać umieszczona poniżej pierwszej sekwencji przewodniej w pRubi-Guide1 (Rysunek 1, krok 3), celując w inny obszar genu i zwiększając szanse na knockout poprzez NHEJ. Weryfikacja poprawności konstruktów powinna zostać przeprowadzona za pomocą analizy sekwencji. Po przygotowaniu konstruktu można go zapakować do wirusa zgodnie z „Protokołem produkcji retrowirusów/lentiwirusów – metoda CaPO4”. Pomyślne pakowanie potwierdza się poprzez infekcję wirusem komórek HEK293 w celu wyznaczenia miana wirusa. Brak ekspresji fluoroforu prawdopodobnie wskazuje na błąd podczas pakowania wirusa.
Rycina 2 przedstawia reprezentatywny wynik współiniekcji dwóch retrowirusów, jednego wykazującego ekspresję GFP, a drugiego mCherry, do zakrętu zębatego noworodka myszy (7. dzień życia), obrazowanych 21 dni po iniekcji. Znakowanie neuronów mCherry lub GFP umożliwia ocenę morfologiczną różnych manipulacji genetycznych w tej samej tkance, gdzie jeden wirus może wprowadzać KO za pośrednictwem CRISPR/Cas9, a drugi być wirusem kontrolnym, wykazującym ekspresję wyłącznie fluoroforu. Iniekcja stereotaktyczna pozwala na precyzyjną selektywność anatomiczną, co potwierdza dyskretna infekcja w zamierzonych współrzędnych, czyli w zakręcie zębatym. Podczas analizy infekcji w przekrojach mózgu ważne jest zachowanie otaczającej tkanki do momentu ustalenia, że zainfekowano prawidłowy region anatomiczny. W przypadku braku oznak infekcji istnieje możliwość, że iniekcja nastąpiła w sąsiednim obszarze, co można zidentyfikować w okolicznych przekrojach. Pomocne może być również zlokalizowanie toru igły w celu znalezienia dokładnego miejsca iniekcji. Wirusy pseudotypowane VSVg rzadko rozprzestrzeniają się poza granice zakrętu zębatego po iniekcji in vivo i mają tendencję do rozprzestrzeniania się wzdłuż osi rostralno-kaudalnej, infekując komórki w całym zakręcie zębatym, co wykazano w analizie rekonstrukcji 3D (Rycina 3).
<img alt="Schemat procesu klonowania CRISPR z mapami wektorów, wstawianiem gRNA i etapami trawienia PacI." src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Strategia klonowania retrowirusowego plazmidu pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR. Strategia ta jest identyczna dla lentiwirulowych plazmidów opartych na FU. Oligonukleotydy sgRNA są hybrydyzowane i wstawiane do PXL przy użyciu miejsc klonowania BsbI. Po sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia prawidłowego wstawienia sgRNA do PXL, plazmid należy poddać trawieniu enzymami BstBI oraz PacI. Wycięty insert (czarna ramka) jest następnie klonowany do wirusowego szkieletu (czarne linie przerywane) pRubi-Guide1 CRISPR. Drugie sgRNA może być również wstawione do PXL i wycięte przy użyciu enzymu PacI. Jest ono następnie klonowane do wektora pRubi-Guide1 CRISPR (czerwone linie przerywane) przy użyciu miejsca PacI. Powstały plazmid zawiera obie nici przewodnie oraz niezbędne elementy wirusowe, promotory i fluorofory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia konfokalna wykazująca fluorescencję GFP i mCherry w tkance neuronalnej; ko-lokalizacja białek." src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Iniekcja retrowirusowa do zakrętu zębatego myszy. Retrowirusy wykazujące ekspresję mCherry (czerwony) lub GFP (zielony) wstrzyknięto do zakrętu zębatego myszy w wieku p7. Po 21 dniach myszy poddano perfuzji, a mózgi pocięto na sekcje i zabarwiono pod kątem GFP i mCherry. (A) Obraz fluorescencyjny w szerokim polu (5X) pokazuje precyzję iniekcji do zakrętu zębatego oraz specyficzność znakowania neuronów ziarnistych zakrętu zębatego. Morfologia hipokampa jest widoczna dzięki barwieniu Dapi (niebieski). Pasek skali odpowiada 200 µm. (B) Obraz fluorescencyjny w szerokim polu (10X) demonstruje, że te lentiwirusy o wysokim mianie infekują dużą liczbę komórek, których morfologię można ocenić dzięki ekspresji fluoroforu. Pasek skali odpowiada 100 µm. (C) Wirusy wykazujące ekspresję GFP lub mCherry wstrzyknięto wspólnie do zakrętu zębatego. Wykorzystując system retrowirusów, można użyć jednego wirusa do przeprowadzenia manipulacji genetycznej znakowanej GFP, a innego do manipulacji znakowanej mCherry, a następnie ocenić pojedyncze lub addytywne zmiany wywołane przez każdy z wirusów. Pasek skali odpowiada 10 µm.
<img alt="Rekonstrukcja 3D struktury neuronalnej, obraz mikroskopowy, analiza przekroju mózgu, od strony rostralnej do caudalnej." src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Rozprzestrzenienie anatomiczne iniekcji lentiwirusowej. Stereotaktyczna coiniekcja wirusa GFP-shPten oraz kontrolnego wirusa mCherry do mózgu dorosłej myszy Ptenloxp/+ doprowadziła do rozprzestrzenienia się wirusa wzdłuż całej osi rostralno-caudalnej zakrętu zębatego hipokampa. Przedstawiono to na rekonstrukcji 3D zakresu iniekcji, w której zamknięte kontury rozprzestrzenienia wirusa zostały wyrysowane na 21 przekrojach seryjnych (Z = 50 μm/przekrój) przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji. Następnie obrysy konturów zostały wyrównane w celu wygenerowania obrazów 3D do kwantyfikacji objętości. Całkowite rozprzestrzenienie wirusa pokazano na kolor zielony (objętość = 54 730 800 μm3), a rozprzestrzenienie zlokalizowane w zakręcie zębatym na kolor fioletowy (objętość = 27 275 200 μm3). Wirus rozprzestrzenia się wzdłuż toru igły oraz w obrębie ciała modzelowatego w miejscu przecięcia z torem igły, oprócz wypełniania osi rostralno-caudalnej zakrętu zębatego. Pasek skali oznacza 200 µm.
<img alt="Mapa sekwencji edycji genów z miejscami restrykcyjnymi; interfejs oprogramowania do analizy DNA; adnotacja sekwencji." src="/files/ftp_upload/53783/53783video1frame.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Klatka z filmu uzupełniającego 1"> 
Film uzupełniający 1. Projektowanie sgRNA do klonowania do szkieletu retrowirusowego i lentiwirusowego. 
W tym przykładzie projektowania syntetycznego przewodzącego RNA (sgRNA) sekwencja genomowa mysiego CHD8 zostaje pobrana z NCBI. Następnie kodon start oraz struktura eksonów są wizualizowane w programie Vector NTI. Pozwala to na skopiowanie regionu genomowego wokół pierwszego eksonu kodującego i wprowadzenie tej sekwencji do programu Benchling. Benchling umożliwia wizualizację wszystkich potencjalnych sgRNA w tym regionie. Ponadto, po wskazaniu wprowadzonego regionu genomowego, Benchling wyświetli wyniki on-target i off-target dla każdego przewodzącego RNA. Użytkownik może następnie wybrać sgRNA z najwyższymi wynikami on- i off-target. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie badaczom zaprojektowania i zapakowania wirusów wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego, CAS9 i sgRNA, a następnie wprowadzenia ich drogą stereotaktyczną do mózgu myszy.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na konkretne pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rola genów leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych i neurorozwojowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania konkretnymi genami bez konieczności czasochłonnego i zasobochłonnego procesu tworzenia zwierząt modyfikowanych genetycznie.Przed przygotowaniem komórek należy skorzystać ze strony internetowej w celu wygenerowania 20-nukleotydowej nici przewodniej lub sgRNA, która posłuży do zaprojektowania jednoniciowych oligosów. Po zamówieniu oligosów i wykorzystaniu ich do stworzenia końcowego plazmidu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przenieść pipetą wszystkie rozmrożone komórki z probówki kriogenicznej do 15 ml probówki stożkowej. Następnie dodać 2 ml uprzednio ogrzanego, nasyconego CO2 kompletnego medium IMDM. Następnie odwirować komórki przez pięć minut przy 500 ×g. Po tym czasie odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 10 ml kompletnego medium IMDM. Wysiać komórki na 10 cm naczyniu hodowlanym i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. 24 godziny po wysianiu zmienić medium, odsysając obecny roztwór i dodając 10 ml ogrzanego medium IMDM. Przesiać komórki po osiągnięciu przez nie konfluencji. Aby przesiać komórki, należy odessać medium i przemyć naczynie 5 ml PBS. Następnie dodać do naczynia 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki odkleją się od powierzchni naczynia.Następnie dodaj 0,5 ml IMDM, aby zneutralizować działanie trypsyny, i przenieś komórki pipetą do probówki o pojemności 1,5 ml. W kolejnym kroku odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut. Resuspenduj komórki w 1 ml IMDM, a następnie rozcieńcz 10 µl zawiesiny komórkowej w 90 µl PBS.Policz komórki, używając hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, a następnie przesiej je do pełnej pożywki IMDM.Piątego dnia, na dwie godziny przed transfekcją, należy wymienić medium, upewniając się, że w płytce 10 centymetrów znajduje się dokładnie 10 mililitrów medium. Następnie należy przygotować odczynniki do transfekcji dla dwóch płytek, używając dwóch okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności pięciu mililitrów. Pierwszą probówkę należy opisać jako DNA, a drugą jako 2X HBS. Następnie należy dostosować stężenie DNA do 1 µg/µL w buforze Tris EDTA o pH 7.4.Aby przygotować odczynniki do transfekcji dla lentiwirusów i retrowirusów, powoli dodawaj wymagane składniki do probówki oznaczonej jako DNA, stale opukując probówkę w celu wymieszania. Następnie dodaj 1 mL 2X HBS do probówki oznaczonej jako 2X HBS. Następnie, powoli dodawaj zawartość probówki DNA do probówki 2X HBS, dodając po jednej kropli na raz. Stale opukuj probówkę 2X HBS i obserwuj tworzący się po każdej kropli osad fosforanu wapnia, aby upewnić się, że kompleksy transfekcyjne zostały utworzone prawidłowo. Następnie inkubuj probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach dodaj 1 mL odczynnika do transfekcji w formie powolnych kropel do każdej płytki z komórkami o rozmiarze 10 cm i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C.W szóstym dniu wymień pożywkę.Siódmego dnia przenieść medium zawierające cząstki wirusowe za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. Następnie do każdej płytki z komórkami dodać 8 ml medium z 0,5% FBS.Ósmego dnia należy zebrać pożywkę komórkową zawierającą cząsteczki wirusowe i połączyć ją z materiałem zebranym dnia poprzedniego w probówce stożkowej o pojemności 50 ml.Na tym etapie odwiruj supernatant wirusowy przy 2000 ×g przez 10 minut. Następnie oczyść medium wirusowe, filtrując je przez filtr strzykawkowy o rozmiarze 0,45 µm o niskim wiązaniu białek. Potem dodaj do medium 5X roztwór glikolu polietylenowego 6000. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość. Następnie inkubuj mieszaninę wirusową w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin.Dziewiątego dnia odwiruj mieszaninę wirusową z prędkością 2500 ×g przez 45 minut. Po 45 minutach odlej nadsącz i ponownie wiruj przez dwie minuty. Następnie ponownie usuń nadsącz. Po tym etapie resuspenduj osad, dodając 320 µL sterylnego PBS, i inkubuj na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnego dnia podziel wirusa na aliquoty i zamroź je w temperaturze -80 °C.Aby rozpocząć tę procedurę, ogoli głowę znieczuplonej myszy w celu przygotowania miejsca wstrzyknięcia. Podaj 4% isofluranu do stożka nosowego. Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym. Wsuń listwę zgryzową do pyska, aż zęby opadną do szczeliny, a następnie zabezpiecz pręty uszne. Upewnij się, że ciało zwierzęcia spoczywa na podkładce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym.Następnie potwierdź znieczulenie, wykonując ucisk stopy. Potem zastosuj sztuczne łzy w celu nawilżenia oczu. Następnie przemyj ogoloną głowę roztworem powidonu jodowego i lidokainy.Następnie wykonaj niewielkie nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Osusz czaszkę za pomocą tamponu i nałóż nadtlenek wodoru, aby ułatwić wizualizację bregmy. Używając stereomikroskopu, zlokalizuj bregmę na czaszce i ustaw wiertło powyżej niej.Ustaw cyfrowe współrzędne stereotaktyczne płaszczyzn X, Y i Z na zero. Aby upewnić się, że głowa jest wypoziomowana wzdłuż rostralno-kaudalnej osi Y, umieść wiertło na lambda i wypoziomuj głowę tak, aby współrzędna Z w punkcie bregma i lambda wynosiła w przybliżeniu zero. Aby upewnić się, że głowa jest wypoziomowana wzdłuż osi X, umieść wiertło w punkcie środkowym między bregma a lambda i zmierz współrzędne Z w odległości jednego milimetra od punktu środkowego po obu stronach, aby upewnić się, że są one równe.Następnie obniż stężenie izofluranu do 2% przed umieszczeniem wiertła nad żądanymi współrzędnymi i ostrożnie wywierć otwory w czaszce. Po wywierceniu wszystkich otworów przymocuj strzykawkę wypełnioną wirusem do instrumentu stereotaktycznego. Wycentruj strzykawkę nad otworem i ustaw współrzędną Z na poziomie czaszki na zero. Powoli opuść strzykawkę do najgłębszej wartości Z i rozpocznij wstrzykiwanie z prędkością 0,25 µL na minutę, używając wtryskiwacza stereotaktycznego. Po zakończeniu wstrzykiwania na najgłębszym poziomie Z odczekaj jedną minutę przed podniesieniem igły do następnej współrzędnej i ponownie rozpocznij wstrzykiwanie. Kontynuuj ten schemat, aż wszystkie współrzędne wstrzykiwania w osi Z zostaną zrealizowane.Po ostatniej iniekcji odczekaj dwie minuty przed wyjęciem strzykawki. Następnie wyjmij mysz z urządzenia stereotaktycznego i zszyj skórę głowy. Na miejsce operowane nanieś lidokainę oraz krem antybakteryjny i podaj lek przeciwbólowy przed przeniesieniem zwierzęcia do ogrzewanej komory rekonwalescencyjnej.Ten obraz fluorescencyjny w szerokim polu przy powiększeniu 10X wykazał, że retrowirusy o wysokim mianie infekują dużą liczbę komórek, których morfologię można ocenić poprzez ekspresję fluoroforu. W tym przykładzie wirusy wykazujące ekspresję GFP lub mCherry zostały wstrzyknięte jednocześnie do zakrętu zębatego. Wykorzystując system retrowirusów, można użyć jednego wirusa do przeprowadzenia jednej manipulacji genetycznej znakowanej GFP i innego wirusa do manipulacji znakowanej m-Cherry, a następnie ocenić pojedyncze lub addytywne zmiany wywołane przez każdy z wirusów.Jest to rekonstrukcja 3D zakresu wstrzyknięcia, w której zamknięte kontury rozprzestrzeniania się wirusa zostały wyrysowane na 21 sekcjach seryjnych. Wyrysowane kontury zostały następnie wyrównane w celu wygenerowania obrazów 3D do kwantyfikacji objętości. Całkowite rozprzestrzenienie wirusa pokazano na zielono, a rozprzestrzenienie zlokalizowane w zakręcie zębatym na fioletowo. Obraz ten pokazuje rozprzestrzenianie się wirusa wzdłuż toru igły oraz ciała modzelowatego, oprócz wypełnienia osi rostralno-kaudalnej zakrętu zębatego.Po wstrzyknięciu wirusa in vivo stosujemy inne metody, takie jak histologia, elektrofizjologia lub mikroskopia dwufotoniczna na żywo, aby zbadać wpływ manipulacji genetycznej na rozwój neuronów.

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zaprojektowanie, zapakowanie i dostarczenie wysokotytułowanych retro- i lentiwirusów CRISPR poprzez wstrzyknięcie stereotaktyczne

Kontrola i analiza obwodów neuronalnych in vivo zostałyby ułatwione dzięki technologii dostarczania wirusów i innych odczynników do wybranych trójwymiarowych zestawów obszarów mózgu. Prezentujemy wykonanie zindywidualizowanej macierzy wtryskiwaczy płynowych oraz dostarczanie kodowanych wirusowo sensybilizatorów optycznych, co umożliwia optyczną manipulację złożonymi obwodami mózgowymi.

Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Naucz się projektować i pakować wirusy CRISPR do edycji genów w mózgu myszy metodą iniekcji stereotaktycznej. Ta technika umożliwia badanie funkcji genów w zaburzeniach neurologicznych bez konieczności tworzenia transgenicznych zwierząt.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Przeglądaj więcej filmów