Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie naukowcom zaprojektowania i zapakowania wirusów, które wyrażają białko fluorescencyjne, CAS9 i sgRNA, a następnie wstrzyknięcie ich stereotaktycznie do mózgu myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na konkretne pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak rola genów leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych i neurorozwojowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania określonymi genami bez czasochłonnego i zasobochłonnego procesu tworzenia genetycznie modyfikowanych zwierząt.

Przed przygotowaniem komórek skorzystaj ze strony internetowej, aby wygenerować 20 nukleotydową nić prowadzącą lub sgRNA, która zostanie wykorzystana do zaprojektowania jednoniciowych oligonukleotydów. Po uporządkowaniu oligonukleotydów i użyciu ich do stworzenia końcowego plazmidu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, kontynuuj pipetowanie wszystkich komórek th-od z krioprobówki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj 2 mililitry wstępnie podgrzanego kompletnego IMDM w równowadze CO2.

Następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 500 razy G. Następnie odessaj supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach pełnego IMDM. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. 24 godziny po posiewie zmień pożywkę, zasysając istniejącą pożywkę i dodając 10 mililitrów wstępnie podgrzanego IMDM.

Podziel komórki, gdy się zlewają. Aby podzielić komórki, odessać pożywkę i umyć płytkę 5 mililitrami PBS. Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny do płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki oderwą się od płytki.

Następnie dodaj 0,5 mililitra IMDM, aby zneutralizować reakcję trypsyny i pipetuj komórki do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie obracaj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić ogniwa w jednym mililitrze IMDM i rozcieńczyć 10 mikrolitrów komórek w 90 mikrolitrach PBS.

Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i ponownie pokryć komórki kompletnym IMDM. Piątego dnia zmień pożywkę na dwie godziny przed transfekcją i upewnij się, że w 10-centymetrowej płytce znajduje się dokładnie 10 mililitrów pożywki. Następnie przygotuj odczynniki do transfekcji na dwie dysze za pomocą dwóch pięciomililitrowych rurek z polistyrenu o okrągłym dnie.

Oznacz pierwszą probówkę jako DNA, a drugą probówkę jako 2X HBS. Następnie dostosuj stężenie DNA do jednego mikrograma na mikrolitr w Tris EDTA przy pH 7,4. Aby zrobić odczynniki do transfekcji dla lentiwirusów i retrowirusów, powoli dodawaj wymagane składniki do DNA znakowanego w probówce, ciągle stukając w probówkę, aby wymieszać.

Następnie dodaj jeden mililitr 2X HBS do probówki oznaczonej jako 2X HBS. Następnie powoli dodawaj jeden mililitr zawartości z probówki DNA do probówki 2X HBS, po jednej kropli na raz. Ciągle stukaj w probówkę 2X HBS i obserwuj osad fosforanu wapnia powstający po każdej kropli, aby zapewnić pomyślne utworzenie kompleksów transfekcyjnych.

Następnie inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach dodaj jeden mililitr odczynnika do transfekcji w powolnych kropelkach do każdej 10-centymetrowej płytki komórkowej i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymień nośnik szóstego dnia.

Siódmego dnia przenieś pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów przed przechowywaniem jej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj osiem mililitrów pożywki 0,5% FBS do każdej płytki komórkowej. Ósmego dnia zbierz pożywkę komórkową zawierającą cząsteczki wirusa i połącz ją ze zbiorem z poprzedniego dnia w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Na tym etapie odwirować supernatant wirusa w temperaturze 2000 razy G przez 10 minut. Następnie należy oczyścić pożywkę wirusową, filtrując ją przez filtr strzykawkowy o niskim poziomie wiązania białek o grubości 0,45 mikrometra. Następnie dodaj 5X roztwór glikolu polietylenowego 6000 do podłoża.

Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Następnie inkubuj mieszaninę wirusową w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin. W dziewiątym dniu odwirować mieszaninę wirusów w temperaturze 2500 razy G przez 45 minut.

Po 45 minutach wyrzucić supernatant i ponownie obracać go przez dwie minuty. Następnie ponownie usuwa się supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad, dodając 320 mikrolitrów sterylnego PBS i inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnego dnia należy podzielić wirusa na porcje i zamrozić podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć tę procedurę, należy ogolić głowę znieczulonej myszy w celu przygotowania się do miejsca wstrzyknięcia. Skieruj 4% izofluranu do stożka nosowego.

Następnie umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym. Włóż pręt do gryzienia do pyska, aż zęby wpadną do szczeliny przed zabezpieczeniem nauszników. Upewnij się, że ciało zwierzęcia znajduje się na poduszce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym.

Następnie potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę. Następnie zastosuj sztuczne łzy, aby nawilżyć oczy. Następnie przetrzyj ogoloną głowę jodonem powidonem i lidokainą.

Teraz wykonaj małe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Osusz czaszkę wacikiem i nałóż nadtlenek wodoru, aby pomóc uwidocznić bregmę. Za pomocą lunety sekcyjnej zlokalizuj bregmę na czaszce i umieść nad nią wiertło.

Ustaw cyfrowe współrzędne stereotaktyczne płaszczyzn X, Y i Z na zero. Aby upewnić się, że głowa jest wypoziomowana na osi Y ogona rostralnego, umieść wiertło na lambdzie i wypoziomuj głowicę tak, aby współrzędna Z była w przybliżeniu równa zeru przy bregma i lambda. Aby upewnić się, że jest wypoziomowany wzdłuż osi X, umieść wiertło w punkcie środkowym między bregmą a lambdą i zmierz współrzędne Z w odległości jednego milimetra od punktu środkowego po obu stronach, aby upewnić się, że są równe.

Następnie obniż izofluran do 2% przed umieszczeniem wiertła nad żądanymi współrzędnymi i ostrożnie przewiercić czaszkę. Po wywierceniu wszystkich otworów przymocuj strzykawkę wypełnioną wirusem do instrumentu stereotaktycznego. Wyśrodkuj strzykawkę nad otworem i ustaw współrzędną Z na czaszce na zero.

Powoli opuścić strzykawkę do najgłębszej głębokości Z i rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,25 mikrolitra na minutę za pomocą wstrzykiwacza stereotaktycznego. Po zakończeniu wstrzykiwania na najgłębszej głębokości Z, należy odczekać minutę przed podniesieniem go do następnej współrzędnej i ponownie rozpocząć wstrzykiwanie. Kontynuuj ten wzór, aż wszystkie współrzędne wtrysku Z zostaną wstrzyknięte.

Po ostatnim wstrzyknięciu należy odczekać dwie minuty przed wyjęciem strzykawki. Następnie wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i zszyj skórę głowy. Nałóż lidokainę i krem przeciwbakteryjny na miejsce operacji i podaj leki przeciwbólowe przed przeniesieniem zwierzęcia do podgrzewanej komory rekonwalescencji.

Ten 10-krotnie szerokokątny obraz fluorescencyjny wykazał, że retrowirusy o wysokim mianie infekują dużą liczbę komórek, których morfologię można ocenić za pomocą ekspresji fluoroforu. W tym przykładzie wirusy wykazujące ekspresję GFP lub mCherry zostały jednocześnie wstrzyknięte do zakrętu zębatego. Korzystając z systemu retrowirusów, można użyć jednego wirusa do wykonania jednej manipulacji genetycznej oznaczonej GFP i innej manipulacji oznaczonej przez mCHerry, a następnie ocenić pojedyncze lub addytywne zmiany spowodowane każdym wirusem.

Jest to rekonstrukcja 3D zakresu iniekcji, w której prześledzono zamknięte kontury rozprzestrzeniania się wirusa na 21 seryjnych odcinkach. Ślady konturów zostały następnie wyrównane w celu wygenerowania obrazów 3D w celu ilościowego określenia objętości. Całkowite rozprzestrzenianie się wirusa jest pokazane na zielono, a miejscowe rozprzestrzenianie się dendate jest pokazane na fioletowo.

Na tym zdjęciu wirus rozprzestrzenia się wzdłuż toru igły i ciała modzelowatego, a także wypełnia rostralną oś ogonową zakrętu zębatego. Po wstrzyknięciu wirusa in vivo stosujemy inne metody, takie jak histologia, elektrofizjologia lub dwukrotne badanie mikroskopowe, aby zbadać wpływ manipulacji genetycznej na rozwój neuronów.