Wyodrębnianie metryk dla trójwymiarowych systemów korzeniowych: analiza objętości i powierzchni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie informacji ilościowych na temat korzeni roślin z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie. Ta metoda badania struktury korzeni żywych roślin może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii, takie jak to, jak rośliny reagują na zmieniające się warunki środowiskowe, takie jak susza, aktywność mikrobiologiczna i tak dalej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna, dlatego pozwala nam badać rośliny w ich naturalnym środowisku, czyli glebie.

Wizualna demonstracja tej metody jest cenna, ponieważ procedura obejmuje wiele etapów, w tym obrazowanie tomograficzne, rekonstrukcję danych i analizę, które mogą być niejasne bez pomocy wizualnej. Aby rozpocząć, umieść roślinę doniczkową na manipulatorze próbki skanera tomografii rentgenowskiej w odległości pożądanej dla powiększenia celu. W przypadku rośliny w uchwycie o średnicy dwóch cali należy ustawić próbkę w odległości źródła około trzech cali.

W oprogramowaniu sterującym przyrządem ustaw ustawienia mocy promieniowania rentgenowskiego na 85 kilowoltów i 190 mikroamperów. Następnie ustaw czas ekspozycji na jedną sekundę, aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu. Ustaw liczbę projekcji na 3 142, a liczbę klatek na projekcję na cztery, aby uzyskać dobre statystyki danych.

Korzystając z właśnie ustawionych parametrów skanowania, wybierz zakładkę Korekcja zacienienia. Następnie kliknij Nowy"i nazwij plik korekcji cieniowania. Następnie kliknij Prezentuj"aby potwierdzić nowe warunki.

Następnie kliknij Utwórz"i kliknij OK"aby użyć dwóch obrazów referencyjnych. Następnie kliknij przycisk Generuj. Następnie, gdy pojawi się wyskakujące okienko z ostrzeżeniem, fizycznie usuń próbkę ze ścieżki wiązki przed kliknięciem OK. Korekcja cieniowania zostanie teraz uruchomiona.

Teraz kliknij na Akwizycja"patka. Nazwij plik danych, a następnie wybierz Brak"dla filtra rentgenowskiego. Upewnij się, że pole wyboru Minimalizuj artefakty pierścienia jest zaznaczone, aby próbka była obracana w krokach kątowych podczas pozyskiwania obrazów projekcyjnych.

Na koniec rozpocznij skanowanie, klikając przycisk Pobierz". Po uzyskaniu surowych danych załaduj je do programu rekonstrukcyjnego. Porównaj pierwszy i ostatni obraz, klikając "Mrugnij"aby upewnić się, że próbka się nie poruszyła lub ustawienia skanowania nie zmieniły się podczas pozyskiwania danych.

Oblicz środek obrotu lub COR, wybierając środek obrotu"zakładkę i korzystając z opcji Automatyczne wyszukiwanie COR z wysoką jakością"dokładność i Podwójny" wybór plasterka do obliczenia COR. Następnie kliknij Start"aby uruchomić obliczenia. Po znalezieniu COR kliknij kartę Wolumin", aby wybrać próbkę do zrekonstruowania.

Użyj miniatur, aby edytować okna wyboru woluminów. Następnie kliknij Start"aby wykonać rekonstrukcję w celu utworzenia pliku woluminu zawierającego dane 3D. Aby przygotować stos obrazów do przetwarzania RooTrak, załaduj plik woluminu do ImageJ, klikając Plik, Importuj, Raw, a następnie wybierając plik woluminu.

Aby zoptymalizować kontrast obrazu między korzeniem a glebą, kliknij Obraz"kartę, a następnie wybierz Dostosuj jasność/kontrast" i wybierz Auto. Gdy obszar zainteresowania jest widoczny w pozycji wyraźnej, ustawienia są uważane za zoptymalizowane. Zapisz obrazy jako stos obrazów w formacie JPEG, BMP lub PNG, klikając Zapisz jako" i wybierając Sekwencja obrazów.

Aby przetworzyć w RooTrak w celu segmentacji korzenia, wybierz zakładkę Narzędzia i wybierz Tracker. Następnie kliknij dwukrotnie biały obszar wprowadzania w oknie dialogowym, aby załadować stos obrazów. Po załadowaniu obrazów wybierz zakładkę Tracker i ustaw punkty początkowe wewnątrz korzenia, klikając kilka punktów wewnątrz każdej z odpowiednich sekcji głównych widocznych w górnym wycinku widoku danych woluminu.

Ustaw parametr tracker gładkość na 0,3 i podobieństwo na 0,8. Kliknij pole poniżej Katalog wyjściowy"aby wybrać folder plików. Następnie kliknij Wybierz folder"i kliknij Start.

Zostanie wtedy uruchomiona funkcja śledzenia. Spowoduje to podążanie za korzeniem od górnego wycinka obrazu aż do dolnego wycinka. Po otwarciu i wyświetleniu danych woluminu wybierz liczbę wycinków zgodnie z użytecznym woluminem danych.

W przedstawionym przykładzie śledzenie zostało zatrzymane na 200 wycinkach, co odpowiada głębokości 6,2 milimetra, gdzie granice korzeni stały się źle zdefiniowane. Aby przeprowadzić analizę objętości i powierzchni w ImageJ, przekonwertuj stos obrazów z RooTrak na binarny format obrazu, wybierając opcję Proces, Binarny, a następnie Utwórz binarny. Użyj wtyczki ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, BoneJ, aby utworzyć trójkątną siatkę, wybierając Wtyczki, BoneJ, a następnie Isosurface.

W oknie opcji, które się otworzy, ustaw Ponowne próbkowanie"i Próg"odpowiednio na sześć i 120. Następnie zaznacz opcję Pokaż powierzchnię" i naciśnij przycisk OK". W przeglądarce 3D, która się otworzy, kliknij plik"patka.

Następnie kliknij Eksportuj powierzchnie" i zapisz jako plik binarny STL. Na koniec otwórz IMESHJ. Załaduj plik STL, klikając Wybierz plik STL" i wprowadź rozmiar woksela w mikronach.

Kliknij Wprowadź rozmiar woksela"i wprowadź 31 mikronów, a następnie kliknij OK"dwukrotnie. Kliknij przycisk Oblicz pole powierzchni", aby uzyskać całkowitą powierzchnię korzenia próbki w milimetrach kwadratowych. Następnie kliknij Oblicz objętość", aby uzyskać całkowitą objętość pierwiastka próbki w milimetrach sześciennych.

Okaz, składający się z dwóch łodyg rodzimego nasiona prerii trawiastej, Sporobolus heterolepis, i oryginalnej gleby wokół niego, jest pokazany tutaj. Rozmiar woksela w zrekonstruowanych danych wynosił około 31 mikronów sześciennych. Po utworzeniu stosu obrazów i zwiększeniu kontrastu między korzeniami a glebą, zrekonstruowane dane wykazały, że korzeń i niektóre składniki gleby mają bardzo podobne współczynniki tłumienia promieniowania rentgenowskiego, co skutkuje niewielkim lub zerowym kontrastem w skali szarości na obrazach.

Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywny punkt początkowy, który został wybrany wewnątrz odpowiedniej sekcji głównej widocznej w górnym wycinku danych woluminu. Korzystając z parametrów RooTrak opisanych w tym filmie, RooTrak z powodzeniem podzielił wybrane około 200 wycinków danych objętościowych, co odpowiadało głębokości 6,2 milimetra. Segmentacja korzenia jest również pokazana w tej animacji.

W tym przypadku ImageJ został użyty do wygenerowania trójkątnej izopowierzchni siatki objętości 3D na podstawie danych wygenerowanych przez RooTrak. Użyte ustawienia domyślne pozwoliły na stosunkowo szybkie wygenerowanie szczegółowej izopowierzchni. Ostatecznie, za pomocą IMESHJ, powierzchnia została obliczona na 351,87 milimetra kwadratowego, a obliczona objętość wyniosła 47,27 milimetra sześciennego.

Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej techniki, należy pamiętać o przestrzeganiu wszystkich procedur bezpieczeństwa. Należy również pamiętać, że segmentacja korzeni jest możliwa tylko wtedy, gdy istnieje wystarczający kontrast promieniowania rentgenowskiego między korzeniem a glebą.

Po tej procedurze można obrazować i analizować inne okazy o rozgałęzionych strukturach, takich jak liście drzew, płuca zwierząt i ludzi itp., aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wzrost żywych tkanek lub toleruje określone warunki. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się nauką o roślinach do badania takich rzeczy, jak odporność na suszę w roślinach modelowych, takich jak Brachypodium. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować okaz rośliny za pomocą tomografii, jak wizualizować jej strukturę korzenia i wydobywać informacje ilościowe o korzeniu z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie.

Nie zapominaj, że praca z przyrządami rentgenowskimi może być niebezpieczna, a podczas próbowania tej techniki należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa.