Name: Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę obrazowania przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK w komórkach roślinnych przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu. Ta technika umożliwia badanie dynamicznych interakcji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) za redakcję manuskryptu. Prace nad powstawaniem polaryzacji BASL są wspierane przez granty z amerykańskiego Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych dla J.D. (R01GM109080) i Rutgers University.

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Wygeneruj konstrukty za pomocą technologii klonowania, jak opisano wcześniej1,6.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności z odpowiednimi starterami, aby amplifikować sekwencje kodujące BASL, YDA i MPK6 i sklonować je do wektorów wejściowych. Szczegółowy protokół znajduje się w 7.</li>
		<li>Aby wygenerować dominujące ujemne wersje MPK6 i YDA (odpowiednio DNmpk68 i DNyda4), użyj plazmidów wejściowych MPK6 i YDA jako matrycy i wprowadź mutacje punktowe metodą mutagenezy ukierunkowanejna miejsce 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zbudować konstrukty do testów stanów przejściowych tytoniu, należy przeprowadzić standardowe reakcje LR (rekombinacja attL x attR) (szczegółowa procedura w 7) w celu zintegrowania BASL z pH35CG10, DNyda i DNmpk6 odpowiednio z wektorami pXNGW i pXCGW11.
	<ol>
		<li>Potwierdź powstałe plazmidy przez trawienie enzymatyczne i sekwencjonowanie. Po pomyślnym zakończeniu przekształć konstrukty binarne w szczep Agrobacterium tumefaciens GV310112 i hoduj je na płytkach selekcyjnych w temperaturze 28 °C przez 2-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu infiltracji Agrobacterium
<ol>
	<li>Zaszczepić kilka świeżo przekształconych kolonii Agrobacterium w 10 ml pożywki Luria-Bertani (LB) odpowiednimi antybiotykami (Gentamycyna 25 μg/ml, Ryfamycyna 25 μg/ml, Spektynomycyna 100 μg/ml dla konstruktów pH35CG, pXNGW i pXCGW; te same stężenia Gentamycyny i Ryfamycyny z Kanamycyną 50 μg/ml dla P19 (ekspresja białek przeciwko wyciszaniu transgenicznemu)13.</li>
	<li>Hodować kultury Agrobacterium w wytrząsarce o temperaturze 28 °C z prędkością 200 obr./min przez około 16 godzin, a następnie zmierzyć OD600 (szacowany na 1,5 - 1,8) (rysunek 2A-B). Wirować kultury w temperaturze 2 500 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić i przemyć granulki komórek 10 mM MgCl2 (roztwór infiltracyjny).</li>
	<li>Ponownie odwirować kultury i ponownie zawiesić granulki z odpowiednią ilością roztworu infiltracyjnego, aby osiągnąć końcową średnicę zewnętrzną600 = 0,5 (rysunek 2C-D). Przed infiltracją roślin pozostaw mieszaniny komórek w temperaturze pokojowej na 1 - 3 godziny. Ten krok pomaga utrzymać homeostazę komórkową.</li>
</ol>
3. Iniekcja roślin tytoniu i liści
<ol>
	<li>Do iniekcji liści należy używać roślin tytoniu (Nicotiana benthamiana), uprawianych w wieku 4-5 tygodni w standardowej komorze do wzrostu roślin (23 °C z cyklami 16 godzin światła / 8 godzin ciemności)14. 
	Uwaga: Na tym etapie rośliny tytoniu mają zazwyczaj 6 liści (2 duże, 2 średnie i 2 małe). Dwa średniej wielkości liście są najbardziej optymalne do iniekcji liści (dwa duże są za stare, podczas gdy dwa małe są często za młode).</li>
	<li>Przed dniem infiltracji podlej rośliny tytoniu, aby nasycić glebę. </li>
	<li>W dniu infiltracji należy wstępnie inkubować rośliny w ciemności przez 1 - 3 godziny. Ten krok pozwala na szerokie otwarcie aparatów szparkowych w naskórku, co znacznie ułatwia Agrobacterium wnikanie do komórek naskórka liścia.</li>
	<li>Używając kolorowych taśm oznaczonych datami, oznacz liście, które mają zostać przeniknięte. Oznacz obszary, które mają zostać zinfiltrowane, czarnym grubym sharpie (opcjonalnie; infiltrowane obszary są widoczne po zainfekowaniu).</li>
	<li>Pobrać równe objętości zawiesiny Agrobacterium i wymieszać je na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm, delikatnie obracając (ryc. 2E). Uwaga: W naszym przypadku zmieszaliśmy 1 ml p19 z 1 ml CFP-BASL, 1 ml DNyda-nYFP i 1 ml DNmpk-cYFP.</li>
	<li>W trakcie infiltracji napełnić 3 ml strzykawkę bezigłową mieszaniną infiltracyjną (1 - 2 ml) i wepchnąć w dolną stronę (abaksjalną) liścia tytoniu (ryc. 2F). Podczas infiltracji pomocne jest używanie jednej ręki do pchania, a drugiej do delikatnego podpierania górnej strony (adaksjalnie, wbrew sile pchania). 
	Uwaga: Po pomyślnym wstrzyknięciu mieszaniny naciekowej zainfekowane obszary staną się łatwo rozpoznawalne w naskórku. Jednak infiltracja może się nie powieść z powodu ostrego wstrzyknięcia (uszkodzenie tkanki) lub niewystarczającego pchnięcia (brak penetracji cieczy). Do każdego badania sugerujemy co najmniej dwa zastrzyki w dwa niezależne liście (z różnych roślin).</li>
	<li>Umieść zainfekowane rośliny z powrotem w komorze wzrostowej. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresje białek są wykrywalne po 48 godzinach od infiltracji.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne 
<ol>
	<li>Po 48 godzinach od infiltracji należy użyć dziurkacza, aby wyciąć krążek liściowy z obszaru wstrzyknięcia (zwykle można wyprodukować 3 - 4 krążki/obszar) (Rysunek 2G). Za pomocą pęsety delikatnie przenieś krążki liściowe na zjeżdżalnię (stroną z abaxialnym do góry) i zamontuj je za pomocą kropli wody. Unikaj zbyt mocnego naciskania na szkiełko nakrywkowe, ponieważ ściśnięte/uszkodzone komórki nie będą dobrze widoczne pod mikroskopem konfokalnym (ryc. 2H).</li>
	<li>Przed obrazowaniem konfokalnym zeskanuj zamontowane próbki pod mikroskopem epifluorescencyjnym w celu sprawdzenia poziomów ekspresji. Uwaga: Opierając się na naszym doświadczeniu, komórki, które wykazują pośrednie poziomy ekspresji, są najlepiej reprezentowane pod mikroskopem konfokalnym.</li>
	<li>Zacznij od soczewki 40X (NA 1.3) w mikroskopie konfokalnym. Ustaw szkiełko w żądanej pozycji, tak aby komórki wyrażające średnie poziomy białka fluorescencyjnego pozostały w środku. Widma wzbudzenia/emisji dla CFP i YFP wynoszą odpowiednio 458 nm / 480 - 500 nm i 514 nm / 520 - 540 nm.</li>
	<li>Aktywuj przycisk "Na żywo", aby wyświetlić podgląd obrazów, a następnie dostosuj intensywność lasera i inteligentne wzmocnienie, aby uzyskać najbardziej zrównoważony stosunek intensywności fluorescencji do szumu. Aby poprawić jakość obrazowania, zwiększ liczbę skanowanych pikseli i/lub średnią klatki/linii. Na koniec wyreguluj pokrętło ostrości, aby dotrzeć do środkowej płaszczyzny ogniskowej i kliknij "Przechwyć", aby zrobić zdjęcie. 
	Uwaga: Obrazy CFP i YFP mogą być rejestrowane sekwencyjnie lub równocześnie, zaznaczając odpowiednio opcję "sekwencyjnego" trybu skanowania.</li>
	<li>Gdy projekcja Z jest pożądana w celu uzyskania dogłębnego widoku komórek, wybierz tryb obrazowania "xyz", określ głębokość zakresu skanowania (10 - 15 μm) i zbierz obrazy od góry do dołu komórki docelowej. Skompiluj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania Leica, klikając prawym przyciskiem myszy plik obrazu, aby wybrać "zmień nazwę" i wyeksportować obrazy jako pliki .tiff.</li>
	<li>Obraz 30 - 40 komórek do analizy ilościowej.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania Fiji (http://fiji.sc/Fiji) do przetwarzania obrazów i przeprowadzania kwantyfikacji.
	<ol>
		<li>Wykreśl wykresy intensywności fluorescencji.
		<ol>
			<li>Aby lepiej zobrazować, czy ekspresja CFP/YFP jest równomiernie rozłożona, użyj Fidżi do zademonstrowania siły sygnału CFP i YFP wzdłuż obwodu komórki. Aby to osiągnąć, najpierw uruchom Fidżi, a następnie wybierz "Plik" i "Otwórz", aby uruchomić obraz. Kliknij "linia" w menu narzędzi i wybierz "Linia segmentowa", klikając prawym przyciskiem myszy. Wybierz obszar zainteresowania i narysuj linię wzdłuż obwodu komórki, aby prześledzić sygnał CFP lub YFP (rysunek 3A-C). 
			Uwaga: Fidżi mierzy bezwzględną wartość intensywności fluorescencji wzdłuż linii segmentowych.</li>
			<li>Wybierz menu rozwijane "Analizuj" i "Profil wykresu", aby wygenerować wykres z wartościami pozycji i intensywności, które reprezentują poziomy CFP/YFP wzdłuż linii segmentowej. W razie potrzeby zduplikuj wartości intensywności (wybierając menu "Kopiuj") do programu EXCEL lub innego oprogramowania graficznego, aby wygenerować porównywalne wykresy intensywności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ ilościowo stopień polaryzacji.
		<ol>
			<li>Zbierz około 20 reprezentatywnych komórek z 3 powtórzonych eksperymentów, aby ocenić stopień polarności CFP i YFP w komórkach tytoniowych. Obliczyć stopień polaryzacji na podstawie stosunku wysokiej intensywności fluorescencji (zdefiniowanej jako H) do niskiej intensywności fluorescencji (zdefiniowanej jako L). Uwaga: Metodę oznaczania ilościowego wyjaśniono na rysunku 3.
			<ol>
				<li>Aby zmierzyć wartości H i L, narysuj linię segmentową wzdłuż zainteresowanego obszaru na obrzeżach komórki (opisanej powyżej), kliknij "Analizuj" z menu rozwijanego, a następnie wybierz "Zmierz". Gdy pojawi się okno "Wyniki", użyj wartości "Średnia", aby przeprowadzić kwantyfikację.</li>
				<li>Z komórek wykazujących względnie jednolitą ekspresję CFP i YFP, np. CFP-BASL (Figura 3A) lub YFP uzupełniony z koekspresji DNyda-nYFP i DNmpk6-cYFP (Figura 3B), uzyskaj wartości H i L, mierząc dwa losowo wybrane segmenty obwodowe o równej długości.</li>
				<li>Z komórek wykazujących oczywistą polarną akumulację białek fluorescencyjnych, w tym przypadku koekspresję CFP-BASL, DNyda-nYFP i DNmpk6-cYFP (Figura 3C), zbierz wartości H z regionów peryferyjnych ze wzbogaconymi sygnałami fluorescencji i L z regionów o niskiej / zerowej akumulacji fluorescencji.</li>
				<li>Zbierz ze sobą wynikowe proporcje H/L z 20 komórek i przetestuj rozkład normalny. Oblicz wartości p za pomocą testu Studenta t (dla rozkładu normalnego) lub testu Kołmogorowa-Smirnowa (K-S) (dla rozkładu nienormalnego).</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li>
<li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li>
<li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway%28R%29+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4(2008).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther%2C+inflorescence%2C+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+Arabidopsis+plants%3A+growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).</li>
<li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li>
<li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li>
<li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCTOPUS%2C+a+polarly+localised+membrane-associated+protein%2C+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li>
<li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ogólne zastosowanie i możliwe modyfikacje systemu ekspresji tytoniu w stanach przejściowych do transdukcji sygnału: Nadekspresja białek fluorescencyjnych (FP) znakowanych białkiem (FP) w naskórku tytoniu została z powodzeniem wykorzystana do szybkiego badania lokalizacji subkomórkowej białek w komórkach roślinnych. Jednak badanie dynamicznego rozkładu sygnalizacji kompleksu białkowego w roślinie jest trudnym tematem ze względu na skomplikowane konteksty subkomórkowe, przejściowe interakcje białk...

Białka oddziałują na siebie w skomplikowanej hierarchicznej sieci i tworzą kompleksy, które odgrywają kluczową rolę w prawie wszystkich procesach biologicznych zachodzących w nieprzewidywalnym środowisku komórkowym. Jednak od rozwoju roślin po reakcje wzrostowe brakuje wygodnych narzędzi, które mogą nie tylko szybko, ale także skutecznie identyfikować i monitorować te dynamiczne zdarzenia sygnalizacyjne na poziomie subkomórkowym.
System przejściowej ekspresji białek w naskórku liści tytoniu ma atrakcyjne zalety do wizualizacji białek fluorescencyjnych w żywych komórkach. System ten zapewnia warunki semi-in vivo, które umożliwiają potranslacyjną modyfikację białek i szybkie badanie lokalizacji białek. Badając uzupełniony sygnał YFP, test dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) informuje o możliwości interakcji białko-białko w komórkach roślinnych. W porównaniu z innymi metodami, np. hybrydą drożdży-dwa (Y2H) i koimmunoprecypitacją (Co-IP), BiFC zapewnia również potężny sposób wizualizacji przedziałów, w których mogą zachodzić interakcje białko-białko na poziomie subkomórkowym.
Ponieważ asymetryczny podział komórek (ACD) utrzymuje populację komórek macierzystych, jednocześnie generując nowe typy komórek do tworzenia tkanek/narządów, jest to niezbędny mechanizm do promowania wielokomórkowości eukariotycznej. Rozwój aparatów szparkowych rzodkiewnika został wykorzystany jako system modelowy do badania ACD u roślin. Komórka prekursorowa, merystemoidalna komórka macierzysta, dzieli się asymetrycznie, tworząc dwie różne komórki potomne, merystremoid (ulega podziałom podobnym do komórek macierzystych przed zakończeniem w parę komórek ochronnych) i komórka naziemna linii szparkowej (SLGC) (może dzielić się i różnicować w komórkę chodnika) odpowiednio (ryc. 1). W aparatach szparkowych ACD nowe białko Breaking of Asymmetry in the Stomatal Lineage (BASL) jest spolaryzowane pretotycznie, aby napędzać asymetrie podziału, które obejmują asymetrię fizyczną i asymetrię losu komórki1. Kaskada MAPK złożona z MAPKKK YODA i MAPK, MPK3 i 6 ma kluczowe znaczenie dla wzorca podziału aparatów szparkowych i przyjęcia losu2,3, 4,5.
Niedawno, Zhang et al. powiązali białko polaryzacji BASL ze szlakiem sygnałowym YDA-MAPK w aparacie szparkowym Arabidopsis ACD 6. Kanoniczny szlak YODA-MAPK, poprzez MPK3/6, fosforyluje BASL i aktywuje jego polaryzację. Fosforylowany BASL działa jak rusztowanie i rekrutuje YODA (YDA) i MPK3/6 do tworzenia kompleksu białkowego i koncentracji sygnalizacji w korze komórkowej6. Polaryzacja składników MAPK i pętla dodatniego sprzężenia zwrotnego między BASL a szlakiem YDA-MAPK stanowi nowy mechanizm polaryzacji białek w komórkach roślinnych. Przypuszcza się, że lokalnie wzbogacona sygnalizacja MAPK jest ściśle związana z różnicowaniem losu komórki w aparatach szparkowych ACD6 (Figura 1). Jedne z kluczowych danych eksperymentalnych, które wspierały ten model, pochodziły z testów tytoniowych, które wykazały przestrzenną redystrybucję MAPK indukowaną przez ekspresję BASL6.
Ogólnie rzecz biorąc, nie jest łatwo monitorować, gdzie występuje sygnalizacja MAPK, ponieważ cząsteczki MAPK często znajdowały się wszędzie wewnątrz komórki. W tym badaniu wykorzystaliśmy system split-YFP do wizualizacji interakcji między kinazą w górę a kinazą, aby zasugerować, gdzie występuje przekaźnik sygnałowy. Rozszerzyliśmy zastosowanie systemu BiFC poprzez koekspresję trzeciego białka (znakowanego CFP) z podzieloną parą YFP (sugerującą interakcję białko-białko), aby zwizualizować, czy i jak dopełniony YFP może być przestrzennie modulowany przez koeksprymowane białko CFP. W ten sposób wykazaliśmy, że koekspresja CFP-BASL indukowała przestrzenną reorganizację interakcji między YDA i MPK6, od równomiernego rozkładu do spolaryzowanego wzorca w korze komórkowej komórek naskórka tytoniu. System ten ma zatem potencjał do opracowania w celu monitorowania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach roślinnych w warunkach, w których komórki są prowokowane przez bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne (np. koekspresja innych białek, zastosowanie chemiczne, atak patogenu lub zmiany środowiskowe itp.).

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spektynomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Prowadnica</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Oprogramowanie TCS SP5</td><td>II LAS AF Lite</td></tr><tr><td>Obiektyw 40X</td><td>Leica</td><td>HCX&nbsp; Plan APO&nbsp;</td><td>HCX&nbsp; Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz</td><td>Zszywki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki sokoła</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Kleszcze</td><td>Canemco & Marivac</td><td>205EQA-Specyfikacja</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego mapk przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Wizualizacja dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach była wyzwaniem. Rozszerzyliśmy ustalony system ekspresji przejściowej, test biomolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w komórkach naskórka tytoniu, z testowania interakcji białko-białko do monitorowania przestrzennego rozkładu transdukcji sygnału w komórkach roślinnych. W tym protokole użyliśmy testu BiFC, aby pokazać, że interakcja i sygnalizacja między Arabidopsis MAPKKK YODA i MAPK6 zachodzą na błonie plazmatycznej. Gdy białko rusztowania BASL uległo jednoczesnej ekspresji, interakcja YODA-MAPK uległa redystrybucji i przestrzennej kopolaryzacji z CFP-BASL. Ten zmodyfikowany system ekspresji tytoniu pozwala na szybkie badanie lokalizacji sygnalizacji i zmian dynamicznych (mniej niż 4 dni) i może pomieścić wiele kolorów białek fluorescencyjnych (co najmniej trzy). Przedstawiliśmy również szczegółowe metody ilościowego określania rozmieszczenia białek (asymetryczna lokalizacja przestrzenna lub "polaryzacja") w komórkach tytoniowych. Ten zaawansowany system ekspresji tytoniu może być szeroko stosowany do szybkiego testowania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach roślinnych.

Aby zapobiec śmierci komórek indukowanej przez nadaktywny szlak sygnałowy MAPK, w badaniu koekspresji w komórkach tytoniu zastosowano nieaktywne kinazowo wersje YDA (DNyda) oraz MPK6 (DNmpk6). Ani oddziaływanie pomiędzy DNyda a DNmpk6 ujawnione za pomocą BiFC, ani sam CFP-BASL nie wywołały nierównomiernego wzorca rozmieszczenia (Rycina 3A-B). Jednakże, po wprowadzeniu CFP-BASL do pary oddziałującej DNyda-DNmpk6, sygnały CFP i YFP uległy redystrybucji w sposób silnie spola...

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja dynamicznego rozkładu przestrzennego białka

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Zegar segmentacyjny napędza oscylacyjną ekspresję genów w mezodermie presomitycznej (PSM). Dynamiczna aktywność Notch jest kluczem do tego procesu. Wykorzystujemy obrazowanie i analizy obliczeniowe, aby wyodrębnić dynamikę czasową z danych wyrażeń przestrzennych, aby wykazać, że ekspresja liganda Delta i receptora Notch oscyluje w PSM kręgowców.

Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania aktywności sygnalizacyjnej TGF-β/Smad3 na żywo komórek za pomocą systemu reporterskiego adenowirusa. System ten śledzi aktywność transkrypcyjną w czasie rzeczywistym i może być stosowany zarówno do pojedynczych komórek in vitro, jak i do żywychmodeli zwierzęcych.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Poznaj metodę obrazowania przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK w komórkach roślinnych przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu. Ta technika umożliwia badanie dynamicznych interakcji białkowych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Przeglądaj więcej filmów